蛋白質(zhì)分析技術(shù)第九章課件

蛋白質(zhì)分析技術(shù)第九章學(xué)習(xí)目標(biāo)熟悉了解掌握1.蛋白質(zhì)分離純化基本原理2.SDS的原理，Westernblot原理SDS電泳的操作流程；Western印跡技術(shù)操作流程1.以Western為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)第一節(jié)蛋白質(zhì)的分離純化第二節(jié)Western印跡技術(shù)01小節(jié)PART蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)的分離純化是增加制品的純度

總目標(biāo)

盡量滿足研究與診斷對(duì)靶蛋白純度的要求,純化蛋白質(zhì)總是希望純度和產(chǎn)率均高?？傇瓌t保證靶蛋白結(jié)構(gòu)的完整，防止降解和活性蛋白質(zhì)的變性；蛋白質(zhì)的分離純化因標(biāo)本而異。蛋白樣品一般流程

前處理粗分離細(xì)分離結(jié)晶蛋白質(zhì)的分離純化鹽析（A/G）、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑。凝膠過(guò)濾、離子交換、吸附層析、親和層析分離純化的最后步驟(如有必要)生物樣本蛋白質(zhì)的釋放（粉碎組織、裂解細(xì)胞）離心蛋白質(zhì)粗提取液鹽析有機(jī)溶劑沉淀等電點(diǎn)沉淀超速離心蛋白質(zhì)粗品離子交換凝膠過(guò)濾親和層析制備HPLC電泳蛋白質(zhì)純品預(yù)處理分離純化蛋白質(zhì)的分離純化細(xì)胞破碎方法勻漿搗碎研磨機(jī)械法物理法化學(xué)法超聲法反復(fù)凍融冷熱交替法低滲裂解有機(jī)溶劑去污劑酶解法機(jī)體軟組織動(dòng)物韌性組織細(xì)菌、酵母細(xì)胞混懸液培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)菌、病毒紅細(xì)胞細(xì)菌、酵母組織、培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)菌、酵母蛋白質(zhì)的分離純化一、機(jī)械法勻漿：將組織剪成小塊，再加入3-5倍體積的預(yù)冷勻漿緩沖溶液，通過(guò)剪切力破壞組織和細(xì)胞。研磨：將剪碎的動(dòng)物組織置于研缽或勻漿器中研磨或勻漿，破碎細(xì)胞。這種方法溫和，適合實(shí)驗(yàn)室使用。組織搗碎器：較劇烈的破碎細(xì)胞的方法，為了防止發(fā)熱和升溫過(guò)高，通常是轉(zhuǎn)10秒—20秒，停10秒—20秒，可反復(fù)多次。反復(fù)凍融法：將待破碎的細(xì)胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室溫(或40℃)迅速融化，由于細(xì)胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細(xì)胞溶脹破碎。超聲波處理法：借助超聲波的振動(dòng)力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器。使用時(shí)注意降溫，防止過(guò)熱。冷熱交替法：在90℃左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即放入冰浴中使之冷卻，如此反復(fù)多次，絕大部分細(xì)胞可以被破碎。物理法有機(jī)溶劑處理法：利用氯仿、甲苯等脂溶性溶劑或SDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細(xì)胞，可將細(xì)胞膜溶解，從而使細(xì)胞破裂，此法也可以與研磨法聯(lián)合使用。溶脹法：細(xì)胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進(jìn)入細(xì)胞，將細(xì)胞膜脹破釋放出細(xì)胞內(nèi)含物?；瘜W(xué)法

1）根據(jù)分子極性大小和溶解度的不同，如溶劑提取技術(shù)、鹽析法、分配層析法、分級(jí)沉淀法等；2）根據(jù)分子形狀和大小不同，如凝膠過(guò)濾層析等；3）根據(jù)物質(zhì)吸附性質(zhì)不同，如選擇性吸附與吸附層析法等；4）根據(jù)分子帶電性（電離性質(zhì)）的差異，如離子交換層析、電泳、等電聚焦法等。5）根據(jù)配體特異性，如親和層析。蛋白質(zhì)的分離純化二、蛋白質(zhì)混合物的分離方法超濾透析根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同沉淀鹽析吸附分離親和層析蛋白質(zhì)的分離純化根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷不同采用配體特異性親和力電泳離子交換超濾和透析利用離心力或壓力強(qiáng)行使水和其它小分子通過(guò)半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在半透膜上的過(guò)程。根據(jù)相對(duì)分子量不同的分離方法透析按照分子大小進(jìn)行分離。分離取決于透析袋截留的分子量。透析液濃縮的蛋白混合樣品透析袋開(kāi)始透析處于平衡狀態(tài)離心

應(yīng)用強(qiáng)大的離心力，使物質(zhì)因沉降速度不同而進(jìn)行分離的方法叫離心技術(shù)。差速離心密度梯度離心等密度離心

差速離心密度梯度離心也稱(chēng)色譜，基本原理是分析樣品作為流動(dòng)相流過(guò)固相時(shí)，由于樣品中的各個(gè)成分與固相相互作用不同，使得樣品中的各個(gè)成分通過(guò)固相的速率產(chǎn)生了差別，從而達(dá)到分離樣品中各個(gè)成分的目的。層析因固相介質(zhì)不同又分為離子交換層析、分子篩層析和吸附層析等各種層析。層析利用各蛋白質(zhì)分子大小不同分離凝膠法只適于球狀蛋白分子測(cè)量凝膠過(guò)濾層析

樣品以一支持物為載體，在一定的電解質(zhì)溶液中，各組分在電場(chǎng)的作用下，以不同的速度進(jìn)行遷移，從而得到分離。根據(jù)電荷不同的分離方法電泳

不同帶電粒子在同一外加電場(chǎng)作用下泳動(dòng)的速度是不同的，泳動(dòng)度取決于帶電顆粒的性質(zhì)，顆粒所帶凈電荷越多、直徑越小，越接近球形、泳動(dòng)速度越大。

聚丙烯酰胺凝膠電泳

在電解槽中放入兩性電解質(zhì)，通電即形成一個(gè)由陽(yáng)→陰逐步遞增的pH梯度。pH=pI時(shí)，Pro凈電荷=0，所以Pro將聚焦于相當(dāng)于pI的pH帶內(nèi)。

等電聚焦電泳(IEF)以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道。在高壓作用下，帶電粒子在毛細(xì)管內(nèi)的溶液中遷移，遷移速度等于電泳和電滲流的矢量和。

毛細(xì)管電泳離子交換層析根據(jù)蛋白質(zhì)分子在一定pH和離子強(qiáng)度條件下所帶電荷的差異進(jìn)行分離的方法。以離子交換樹(shù)脂作為固定相，樹(shù)脂上具有固定離子基團(tuán)及可交換的離子基團(tuán)。當(dāng)流動(dòng)相帶著組分電離生成的離子通過(guò)固定相時(shí)，組分離子與樹(shù)脂上可交換的離子基團(tuán)進(jìn)行可逆變換。根據(jù)組分離子對(duì)樹(shù)脂親合力不同而得到分離。

利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進(jìn)行分離。二維電泳等電聚焦電泳和SDS的組合等電聚焦電泳雙向電泳方法原理優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)凝膠層析分子篩的排阻效應(yīng)分辨力高、不會(huì)引起變性凝膠介質(zhì)昂貴、處理量有限離子交換層析各組份與離子交換劑親和力不同分辨力高、處理量較大需酸堿處理樹(shù)脂、操作耗時(shí)電泳法等電點(diǎn)、分子量、電荷的差異分辨力很高、可連續(xù)制備儀器試劑昂貴鹽析法破壞水化膜和中和表面電荷操作簡(jiǎn)便、成本低、重復(fù)性好、對(duì)蛋白有保護(hù)作用分辨率差、純化倍數(shù)低、沉淀中混雜鹽分選擇性沉淀等電點(diǎn)、熱變性、酸堿變性等沉淀作用選擇性較強(qiáng)、方法簡(jiǎn)便、種類(lèi)較多應(yīng)用范圍較窄有機(jī)溶劑沉淀脫水作用和降低介電常數(shù)操作簡(jiǎn)便、分辨較強(qiáng)對(duì)蛋白質(zhì)或酶有變性作用親和層析蛋白質(zhì)與配體之間特殊的親和力分辨力很高局限性大高速與超速離心沉降系數(shù)或密度差異操作方便、容量大設(shè)備昂貴制備HPLC凝膠過(guò)濾、離子交換、反向色譜等分辯力很高、步驟少，儀器昂貴常用的蛋白質(zhì)分離純化方法

三、蛋白質(zhì)分離純化的條件緩沖溶液鹽、金屬離子和螯合劑還原劑去垢劑蛋白酶抑制劑表面效應(yīng)蛋白質(zhì)的環(huán)境因素溫度儲(chǔ)存

02小節(jié)PARTWestern印跡技術(shù)1979年，Towbin等人首先將印跡術(shù)引入對(duì)抗原（蛋白質(zhì)）的檢測(cè)——免疫印跡，Western印記雜交。Western印跡雜交/Westernblot（1）首先做蛋白質(zhì)的