2024-2025學(xué)年高中生物第四章生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)實(shí)踐第一節(jié)生物成分的分離與測(cè)定技術(shù)第1課時(shí)蛋白質(zhì)的分離與提取學(xué)案蘇教版選修1

PAGEPAGE1第1課時(shí)蛋白質(zhì)的分別與提取學(xué)習(xí)導(dǎo)航明目標(biāo)、知重點(diǎn)難點(diǎn)駕馭電泳法分別大分子的原理。(重點(diǎn))運(yùn)用常用的方法提取和分別蛋白質(zhì)。(重、難點(diǎn))[學(xué)生用書P48]一、閱讀教材P71～72分析蛋白質(zhì)的分別與純化1．生物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)提取(1)在提取蛋白質(zhì)時(shí)，可以采納研磨與超聲波結(jié)合的方法將生物組織或細(xì)胞完全裂開，使蛋白質(zhì)從細(xì)胞中釋放出來，并使其溶解在適當(dāng)?shù)某樘嵋褐小?2)抽提液的選擇須要依據(jù)蛋白質(zhì)的特性而定，一般酸性蛋白質(zhì)用偏堿性溶液抽提，堿性蛋白質(zhì)用偏酸性溶液抽提，脂蛋白等則可用有機(jī)溶劑抽提。2．蛋白質(zhì)的分別方法(1)離心沉降法：通過限制離心速度，使分子大小、密度不同的蛋白質(zhì)發(fā)生沉降分層。(2)薄膜透析法：利用蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜的特性，使蛋白質(zhì)與其他小分子化合物分別的方法。(3)凝膠色譜法①概念：依據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小差異對(duì)其進(jìn)行有效分別的方法。②原理a．凝膠eq\b\lc\{(\a\vs4\al\co1(形態(tài)：微小的多孔球體,組成：大多由多糖類化合物構(gòu)成,結(jié)構(gòu)：內(nèi)部具有很微小的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)))b．分別的過程進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部的難易程度路程移動(dòng)速度小分子蛋白質(zhì)簡潔較長較慢大分子蛋白質(zhì)無法進(jìn)入較短較快(4)電泳法：將所帶電荷的數(shù)量和性質(zhì)不同的蛋白質(zhì)從混合樣品中分別并純化出來。二、閱讀教材P73～77完成血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳及凝膠色譜法分別血紅蛋白的操作1．血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳配制試劑→打算器材→架濾紙橋→浸泡薄膜→細(xì)心點(diǎn)樣→平懸薄膜→實(shí)施電泳→染色→漂洗→脫色。2．凝膠色譜法分別血紅蛋白樣品處理→血紅蛋白的釋放、分別和透析→凝膠的制備→色譜柱的裝填→樣品的加入→洗脫與收集。判一判(1)酸性蛋白質(zhì)用酸性溶液抽提，水溶性蛋白質(zhì)用透析液抽提，脂溶性蛋白質(zhì)用稀堿性溶液抽提。(×)(2)電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下向著與其電性相反的電極移動(dòng)的過程。(√)(3)電泳時(shí)泳動(dòng)速度取決于帶電顆粒的大小、形態(tài)、所帶靜電荷多少。(√)(4)離心沉降法和薄膜透析法分別蛋白質(zhì)的原理是一樣的。(×)(5)凝膠色譜法是依據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小而對(duì)其進(jìn)行有效分別的方法。(√)(6)醋酸纖維薄膜電泳是采納濾紙為支持物的電泳方法。(×)蛋白質(zhì)分別技術(shù)[學(xué)生用書P49]欲探討某種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能，需將這種蛋白質(zhì)從組織細(xì)胞中分別、純化出來。結(jié)合教材P71第三段～P74內(nèi)容完成以下探究。探究1完善下面示意圖，理解離心沉降法分別蛋白質(zhì)(1)原理：在離心力的作用下，分子大小、密度不同的分子沉降速度不同，從而被分別。(2)目的：使分子大小、密度不同的不同種類的蛋白質(zhì)發(fā)生沉降分層，彼此分別。探究2細(xì)致視察下面示意圖，分析薄膜透析法分別蛋白質(zhì)(1)原理：蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜。(2)目的：去除小分子化合物雜質(zhì)，如無機(jī)鹽、單糖、二糖以及氨基酸等。(3)常用的半透膜：腸衣、玻璃紙等。(4)步驟：將待純化的蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋內(nèi)，再把透析袋放入透析液中即可。探究3完善下面示意圖，分析凝膠色譜法分別蛋白質(zhì)(1)大分子蛋白質(zhì)不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部而沿凝膠顆粒間的空隙移動(dòng)，洗脫路程較短，移動(dòng)速度較快，最先流出柱外。(2)小分子蛋白質(zhì)可以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，洗脫路程較長，移動(dòng)速度緩慢，以致須要較長時(shí)間才能流出柱外。1．蛋白質(zhì)的分別與提純技術(shù)是蛋白質(zhì)探討的重要技術(shù)，下列有關(guān)敘述不正確的是()A．依據(jù)蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜的特性，可將樣品中各種不同的蛋白質(zhì)分別B．依據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷性質(zhì)的差異及分子大小，可通過電泳分別蛋白質(zhì)C．依據(jù)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，可通過凝膠色譜法分別蛋白質(zhì)D．依據(jù)蛋白質(zhì)的分子大小、密度不同，可通過離心沉降法分別蛋白質(zhì)解析：選A。蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜，但溶液中的小分子物質(zhì)則可以透過半透膜，因此可以將蛋白質(zhì)和溶液中的小分子物質(zhì)分別，A項(xiàng)錯(cuò)誤；電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過程。依據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷性質(zhì)的差異及分子大小，可通過電泳使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子的分別，B項(xiàng)正確；凝膠色譜法的原理是：分子量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流淌快，而分子量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長，流淌慢，所以可以依據(jù)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，通過凝膠色譜法使大分子的蛋白質(zhì)先洗脫出來，小分子的蛋白質(zhì)后洗脫出來，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子的分別，C項(xiàng)正確；依據(jù)蛋白質(zhì)的分子大小、密度不同，可通過離心沉降法使不同密度的蛋白質(zhì)分子位于不同層次的離心液中，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分別，D項(xiàng)正確。2．下列有關(guān)蛋白質(zhì)提取和分別的說法，錯(cuò)誤的是()A．透析法分別蛋白質(zhì)的原理是利用蛋白質(zhì)不能通過半透膜的特性B．采納透析法使蛋白質(zhì)與其他小分子化合物分別開來C．離心沉降法通過限制離心速率使分子大小、密度不同的蛋白質(zhì)分別D．蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中可以向與其自身所帶電荷電性相同的電極方向移動(dòng)解析：選D。蛋白質(zhì)是生物大分子，不能通過半透膜，而其他小分子可以通過半透膜，可以利用半透膜進(jìn)行分別得到蛋白質(zhì)，A、B正確。分子大小、密度不同的蛋白質(zhì)其離心速率不同，通過限制離心速率使分子大小、密度不同的蛋白質(zhì)分別，C正確。蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中可以向與其自身所帶電荷電性相反的電極方向移動(dòng)，D錯(cuò)。血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳[學(xué)生用書P50]結(jié)合教材，完善下表，理解血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳。試驗(yàn)步驟操作方法配制試劑↓配制巴比妥緩沖液、染色液、漂洗液、透亮液打算器材↓醋酸纖維薄膜、常壓電泳儀、點(diǎn)樣器等架濾紙橋↓取雙層濾紙條，一端與支架前沿對(duì)齊，另一端浸入電泳槽的緩沖液中，待濾紙條潮濕后，驅(qū)除氣泡，使濾紙緊貼于支架上浸泡薄膜↓用鑷子夾取醋酸纖維薄膜，識(shí)別出光澤面，并在光澤面的一角用筆做上記號(hào)，然后放在巴比妥緩沖液中浸泡20min細(xì)心點(diǎn)樣↓取出薄膜，吸去多余液體，平鋪在玻璃板上，有記號(hào)的一面朝下，點(diǎn)樣時(shí)將蓋玻片在血清中蘸一下，在薄膜一端2_cm處輕輕按下，點(diǎn)上細(xì)條狀的血清樣品，隨即提起平懸薄膜↓將點(diǎn)樣端平貼在電泳槽負(fù)極支架的濾紙橋上，有記號(hào)的一面朝上，另一端平貼于正極，呈繃直狀態(tài)實(shí)施電泳↓蓋上電泳槽蓋，在醋酸纖維薄膜平衡約10min后接通電源，電泳60～90min染色↓取下薄膜，放入染色液中浸泡5～10min漂洗↓取出薄膜，在漂洗液中漂洗數(shù)次，直至蛋白質(zhì)區(qū)底色脫凈為止脫色用濾紙壓平并吸干薄膜后，再浸入透亮液中約5min，取出后平貼于玻璃板上，待完全干燥后便形成透亮薄膜圖譜1．電泳的泳動(dòng)規(guī)律帶電顆粒直徑越小、越接近于球形，所帶凈電荷越多，則在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速度越快；反之，則越慢。2．關(guān)于血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳的幾點(diǎn)說明(1)薄膜的浸潤與選膜是電泳成敗的關(guān)鍵之一。(2)點(diǎn)樣時(shí)，應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，吸水量以不干不濕為宜。(3)點(diǎn)樣時(shí)，動(dòng)作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分別效果。(4)點(diǎn)樣應(yīng)點(diǎn)在薄膜的毛面上，點(diǎn)樣量要適中，不宜過多或過少。(5)電泳時(shí)應(yīng)將薄膜的點(diǎn)樣端置于電泳槽的負(fù)極端，且點(diǎn)樣面對(duì)下。(6)應(yīng)限制染色時(shí)間。時(shí)間長，薄膜底色不易脫去；時(shí)間太短，著色不易區(qū)分，或造成條帶染色不勻稱，必要時(shí)可進(jìn)行復(fù)染。1．細(xì)致視察下面血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳圖譜，所帶負(fù)電荷少的球蛋白是()A．α1-球蛋白 B．α2-球蛋白C．β-球蛋白 D．γ-球蛋白解析：選D。對(duì)于幾種球蛋白來說直徑相差不大，引起泳動(dòng)速度的差異主要來自于所帶電荷多少，由圖可知球蛋白由右向左泳動(dòng)，因右側(cè)為負(fù)極，且γ-球蛋白距點(diǎn)樣處最近，所以γ-球蛋白所帶負(fù)電荷最少。2．下列關(guān)于血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳的說法中，不正確的是()A．架濾紙橋時(shí)，待濾紙條潮濕后，要驅(qū)除氣泡，以便使濾紙緊貼于支架上B．浸泡薄膜時(shí)要識(shí)別出光澤面，并做記號(hào)C．平懸薄膜時(shí)，有記號(hào)的一面朝上D．從染色液中取出薄膜后，用濾紙條壓平并吸干，再浸入透亮液中脫色解析：選D。薄膜染色后要先放入漂洗液中漂洗直至蛋白質(zhì)區(qū)底色脫凈為止，然后才用透亮液脫色。凝膠色譜法分別血紅蛋白[學(xué)生用書P50]凝膠色譜法是依據(jù)蛋白質(zhì)分子的大小，對(duì)其進(jìn)行有效分別的方法。結(jié)合教材P75第三段～P77內(nèi)容完成下列過程(以哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞為例)，學(xué)會(huì)凝膠色譜法分別血紅蛋白。1．樣品處理：采集血樣→低速短時(shí)間離心→取紅細(xì)胞，倒入燒杯＋5倍體積生理鹽水?dāng)嚢琛退匐x心→重復(fù)3次→洗凈的紅細(xì)胞。2．血紅蛋白的釋放、分別和透析(1)血紅蛋白的釋放：紅細(xì)胞＋蒸餾水＋甲苯攪拌，紅細(xì)胞裂開而釋放出血紅蛋白。(2)分別血紅蛋白溶液：將混合液以2_000r/min的速度離心10min，試管中形成4層，取自上而下的第3層紅色透亮液體(血紅蛋白水溶液)。(3)透析：將盛有1mL血紅蛋白溶液的透析袋放入盛有物質(zhì)的量濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液中透析12h。3．凝膠的制備：將交聯(lián)葡聚糖凝膠用蒸餾水充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。4．色譜柱的裝填固定：將層析柱垂直固定在支架上↓裝填：將凝膠懸浮液一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)↓洗滌平衡：用20mmol/L的磷酸緩沖液(pH＝7.0)充分洗滌平衡凝膠12h，使凝膠裝填緊密5．樣品的加入(1)加樣示意圖(2)打開色譜柱下端的流出口，讓凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝膠面剛好平行，關(guān)閉出口。用滴管當(dāng)心吸取1mL樣品溶液沿柱壁輕輕地加入到色譜柱頂端，不能破壞凝膠面。然后，打開流出口，使樣品液漸漸滲入凝膠。6．洗脫與收集(1)洗脫：洗脫液流速為每分鐘1_mL。(2)收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱出口時(shí)，用試管收集洗脫液，每5mL收集一管，連續(xù)收集。(1)凝膠色譜制備中嚴(yán)禁出現(xiàn)氣泡，為什么？提示：氣泡會(huì)打亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分別效果。(2)用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)蛋白質(zhì)的純度鑒定時(shí)，為何僅僅取決于分子量的大?。刻崾荆篠DS可使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原，十二烷基硫酸根所帶的負(fù)電荷使各種蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物都帶上大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的負(fù)電荷量，所以不受蛋白質(zhì)原有電荷的影響。SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變更，使不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長度都一樣，所以不受蛋白質(zhì)形態(tài)的影響。故僅僅取決于蛋白質(zhì)分子量的大小。蛋白質(zhì)分子在凝膠中的運(yùn)動(dòng)狀況分析相對(duì)分子質(zhì)量大相對(duì)分子質(zhì)量小直徑大小大于凝膠顆?？障吨睆叫∮谀z顆粒空隙直徑運(yùn)動(dòng)方式垂直向下運(yùn)動(dòng)不規(guī)則的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)速度較快較慢運(yùn)動(dòng)路程較短較長洗脫次序先從凝膠柱中洗脫出來后從凝膠柱中洗脫出來突破1血紅蛋白提取和分別的過程及原理1．下列關(guān)于血紅蛋白提取和分別的過程及原理敘述，正確的是()A．為了防止血液凝固，應(yīng)在采血器中預(yù)先加入抗凝血?jiǎng)幟仕徕cB．紅細(xì)胞洗滌運(yùn)用5倍體積的蒸餾水，直到離心后上清液不呈現(xiàn)黃色為止C．利用0.9%的NaCl對(duì)血紅蛋白溶液透析12小時(shí)，可以去除小分子雜質(zhì)D．在凝膠柱中加入蛋白樣品后即可連接緩沖溶液洗脫瓶進(jìn)行洗脫和收集樣品解析：選A。為了防止血液凝固，應(yīng)在采血器中預(yù)先加入抗凝血?jiǎng)幟仕徕c，A正確；紅細(xì)胞的洗滌過程應(yīng)當(dāng)用生理鹽水洗滌，不能用蒸餾水洗滌，B錯(cuò)誤；將血紅蛋白溶液通過透析進(jìn)行粗分別時(shí)應(yīng)當(dāng)選用磷酸緩沖液，不是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl溶液，C錯(cuò)誤；在凝膠柱中加入蛋白樣品后要使樣品完全進(jìn)入凝膠層后，當(dāng)心加入緩沖液到適當(dāng)高度后才可連接緩沖溶液洗脫瓶進(jìn)行洗脫和收集樣品，D錯(cuò)誤。突破2血紅蛋白的提取和分別流程2．血紅蛋白是人和其他脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞的主要組成成分，負(fù)責(zé)血液中O2和部分CO2的運(yùn)輸。請(qǐng)依據(jù)血紅蛋白的提取和分別流程圖回答問題：(1)試驗(yàn)流程中：A為__________，B為______________。凝膠色譜法的基本原理是依據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小而達(dá)到蛋白質(zhì)分別的有效方法。(2)洗滌紅細(xì)胞的目的是去除________。(3)釋放血紅蛋白的過程中，加入的試劑是___________。解析：樣品處理過程為：紅細(xì)胞的洗滌→血紅蛋白的釋放→分別血紅蛋白溶液→透析；凝膠色譜操作過程為：凝膠色譜柱的制作→凝膠色譜柱的填充→樣品的加入和洗脫。洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜蛋白。釋放血紅蛋白的過程是讓紅細(xì)胞吸水脹破，由于甲苯是表面活性劑的一種，可將細(xì)胞膜溶解，從而使細(xì)胞裂開。答案：(1)血紅蛋白的釋放樣品的加入和洗脫(2)雜蛋白(血漿蛋白)(3)蒸餾水和甲苯核心學(xué)問小結(jié)[網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建][關(guān)鍵語句]分別與測(cè)定生物成分中蛋白質(zhì)的技術(shù)包括離心沉降法、薄膜透析法和凝膠色譜法等。離心沉降法是通過限制離心速度，使分子大小、密度不同的蛋白質(zhì)發(fā)生沉降分層，從而達(dá)到分別出不同種類蛋白質(zhì)的目的。薄膜透析法是利用蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜的特性，使蛋白質(zhì)與其他小分子化合物分別開。凝膠色譜法是依據(jù)蛋白質(zhì)分子的大小對(duì)其進(jìn)行有效分別的方法。[隨堂檢測(cè)][學(xué)生用書P52]學(xué)問點(diǎn)一蛋白質(zhì)分別技術(shù)1．凝膠色譜法分別蛋白質(zhì)依據(jù)的原理是()A．依據(jù)蛋白質(zhì)分子與凝膠的親和力的大小B．依據(jù)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小C．依據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷的多少D．依據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的大小解析：選B。凝膠色譜法是依據(jù)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分別蛋白質(zhì)的一種方法。2．下列有關(guān)透析的敘述，錯(cuò)誤的是()A．用于透析的薄膜要具有選擇透過性B．透析膜是一種半透膜C．透析能使小分子自由出入，而將大分子保留在袋內(nèi)D．透析膜可用于更換樣品的緩沖液解析：選A。透析膜能使小分子自由出入，大分子不能通過，具有半透性，但不具有選擇性，A項(xiàng)錯(cuò)。透析過程中小分子可自由出入，因此，可用于更換樣品的緩沖液，B、C、D項(xiàng)都正確。3．電泳實(shí)現(xiàn)樣品中各種蛋白質(zhì)分子的分別是利用了()A．各種分子帶電性質(zhì)的差異B．分子本身的大小不同C．分子形態(tài)的不同D．以上都正確解析：選D。電泳是利用了待分別樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形態(tài)的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分別。學(xué)問點(diǎn)二電泳法與凝膠色譜法分別蛋白質(zhì)的過程4．如圖為凝膠色譜法分別蛋白質(zhì)示意圖和SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳示意圖。據(jù)圖分析不正確的是()A．在裝填圖甲中凝膠色譜柱時(shí)一旦發(fā)覺柱內(nèi)有氣泡存在，就須要重裝B．圖甲中大分子蛋白質(zhì)因阻力大而移動(dòng)慢，所以最終從層析柱中流出來C．圖乙中凝膠中加入的SDS可以使蛋白質(zhì)遷移速率完全取決于分子大小D．已知凝膠中的SDS帶負(fù)電，則應(yīng)在電泳槽的①處接電源負(fù)極，②處接電源正極解析：選B。在裝填凝膠色譜柱時(shí)，凝膠裝填在色譜柱內(nèi)要?jiǎng)蚍Q，不能有氣泡存在，因?yàn)闅馀輹?huì)影響蛋白質(zhì)洗脫的次序，A正確；圖甲中大分子蛋白質(zhì)因不簡潔進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程短，移動(dòng)速度快，所以最先從層析柱中流出來，B錯(cuò)誤；SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳的遷移速率完全取決于分子大小，因此圖乙中凝膠中加入的SDS可以使蛋白質(zhì)遷移速率完全取決于分子大小，C正確；凝膠中的SDS帶負(fù)電，所以電泳槽的①處接電源負(fù)極，②處接電源正極，D正確。5．如圖能正確表示相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)，屬于在凝膠中的行進(jìn)過程的是()解析：選B。相對(duì)分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)不簡潔進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程短，移動(dòng)的速度快，A錯(cuò)誤；相對(duì)分子質(zhì)量小的蛋白質(zhì)簡潔進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程長，移動(dòng)的速度慢，相對(duì)分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)不簡潔進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程短，移動(dòng)的速度快，B正確；相對(duì)分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)不簡潔進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，C錯(cuò)誤；相對(duì)分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)不簡潔進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，且其路程短，移動(dòng)的速度快，D錯(cuò)誤。6．紅細(xì)胞含有大量血紅蛋白，紅細(xì)胞的機(jī)能主要是由血紅蛋白完成的，血紅蛋白的主要功能是攜帶O2。我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動(dòng)物的血液進(jìn)行試驗(yàn)，來提取和分別血紅蛋白。依據(jù)材料回答下列問題：(1)試驗(yàn)前取簇新血液，要在采血器中預(yù)先加入檸檬酸鈉，取血回來，立刻進(jìn)行離心，收集血紅蛋白溶液。加入檸檬酸鈉的目的是________________________________________________________________________。(2)在對(duì)樣品進(jìn)行處理時(shí)，主要包括紅細(xì)胞的洗滌、血紅蛋白的釋放、分別血紅蛋白溶液、透析等步驟。其中透析技術(shù)的原理是________________________________________________________________________。(3)同學(xué)甲利用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)將得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行分別，在電泳過程中，影響蛋白質(zhì)遷移速率的因素包括蛋白質(zhì)分子的________、________以及分子的形態(tài)等。(4)圖1、圖2分別是同學(xué)甲、乙利用同一種樣品分別得到的結(jié)果，則圖2中與圖1中蛋白質(zhì)P對(duì)應(yīng)的是________________________________________________________________________。解析：(1)加入檸檬酸鈉的目的是防止血液凝固。(2)透析的原理是小分子可以自由進(jìn)出透析袋(半透膜)，而大分子不能通過。(3)電泳時(shí)，影響蛋白質(zhì)遷移速率的因素有蛋白質(zhì)分子大小、帶電性質(zhì)及分子的形態(tài)等。(4)SDS凝膠電泳裝置是垂直的裝置，此種電泳方法主要取決于蛋白質(zhì)分子量的大小，與電荷無關(guān)，同時(shí)加樣在“－”極，通電后，樣品蛋白質(zhì)向“＋”極移動(dòng)，相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)小的，移動(dòng)距離大，因此從圖1的電泳結(jié)果分析，P比N、M移向“＋”距離大，說明P的相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)比較小，因此洗脫出來的時(shí)間比較長，符合圖2中的丙。答案：(1)防止血液凝固(2)小分子可以自由進(jìn)出透析袋(半透膜)，而大分子不能通過(3)大小帶電性質(zhì)(4)丙[課時(shí)作業(yè)][學(xué)生用書P91(單獨(dú)成冊(cè))]一、選擇題1．下列關(guān)于蛋白質(zhì)提取的說法中，不正確的是()A．一般用機(jī)械方法裂開生物組織B．裂開細(xì)胞常用的方法有研磨法、超聲波法和酶解法C．一般來說，酸性蛋白質(zhì)要用酸性溶液抽提D．抽提得到的蛋白質(zhì)粗提取物可用離心法去除固體雜質(zhì)解析：選C。一般酸性蛋白質(zhì)要用偏堿性溶液抽提。2．離心沉降法是純化蛋白質(zhì)的方法之一，在這一過程中蛋白質(zhì)會(huì)分層，這一現(xiàn)象與蛋白質(zhì)的何種性質(zhì)有關(guān)()A．酸堿性B．所帶電荷多少C．分子大小和密度D．種類解析：選C。依據(jù)蛋白質(zhì)之間或蛋白質(zhì)與其他分子之間在分子大小和密度上的不同，采納離心沉降法，使其分層而分別；酸堿性不同可用電泳法；所帶電荷多少不同可采納電泳法等。3．利用凝膠色譜法哪種蛋白質(zhì)先洗脫出來()A．相對(duì)分子質(zhì)量大的B．溶解度高的C．相對(duì)分子質(zhì)量小的D．所帶電荷多的解析：選A。相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)能進(jìn)入凝膠內(nèi)部通道，洗脫路程較長，移動(dòng)速度較慢；相對(duì)分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部而沿凝膠顆粒間的空隙移動(dòng)，洗脫路程較短，移動(dòng)速度較快，首先洗脫出來。4．在pH＝5.12時(shí)進(jìn)行電泳，下列哪種蛋白質(zhì)既不向正極移動(dòng)也不向負(fù)極移動(dòng)()A．血紅蛋白：pI(等電點(diǎn))＝7.07B．魚精蛋白：pI＝12.20C．α1-球蛋白：pI＝5.06D．β-球蛋白：pI＝5.12解析：選D。β-球蛋白在pH＝5.12時(shí)不帶電，在電泳時(shí)既不向正極移動(dòng)也不向負(fù)極移動(dòng)。5．關(guān)于蛋白質(zhì)提取的敘述中，不正確的是()A．分別與純化蛋白質(zhì)之前首先要用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ沟鞍踪|(zhì)釋放出來B．抽提時(shí)要依據(jù)蛋白質(zhì)的不同特性選擇不同的溶劑C．蛋白質(zhì)的粗提取物離心可除去一些小分子雜質(zhì)D．蛋白質(zhì)的粗制品可能是多種蛋白質(zhì)的混合物解析：選C。分別純化蛋白質(zhì)之前要先讓細(xì)胞中的蛋白質(zhì)釋放出來，A正確；提取蛋白質(zhì)時(shí)，要依據(jù)蛋白質(zhì)的不同特性選用不同的溶劑，B正確；對(duì)蛋白質(zhì)的粗提取物離心可以除去一些固體雜質(zhì)，C錯(cuò)誤；蛋白質(zhì)的粗制品是多種蛋白質(zhì)的混合物，D正確。6．下列有關(guān)凝膠色譜法和電泳法的說法，正確的是()A．它們都是分別蛋白質(zhì)的重要方法B．它們的原理相同C．運(yùn)用凝膠色譜法須要運(yùn)用緩沖溶液而電泳不須要D．以上說法都正確解析：選A。不同蛋白質(zhì)的分子量不同，因此凝膠色譜法可以依據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分別蛋白質(zhì)；電泳法中帶電分子的遷移速度不僅與分子大小有關(guān)，也與分子所帶的電荷有關(guān)，A正確、B錯(cuò)誤；這兩種方法都用到緩沖溶液，以調(diào)整溶液的酸堿度，C錯(cuò)誤。7．下列關(guān)于蛋白質(zhì)純化方法的敘述，錯(cuò)誤的是()A．純化主要是依據(jù)蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)與其他物質(zhì)之間的理化性質(zhì)的差異進(jìn)行的B．透析法可去除小分子化合物雜質(zhì)，原理是不同分子所攜帶凈電荷不同C．通過限制離心速率，可使分子大小、密度不同的蛋白質(zhì)沉降分層，從而分別不同的蛋白質(zhì)D．不同的物質(zhì)在同一電場(chǎng)中的泳動(dòng)速度不同，因此可用電泳法分別蛋白質(zhì)解析：選B。透析法是利用蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜的特性，將蛋白質(zhì)與其他小分子化合物分別開來。8．下列關(guān)于血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳試驗(yàn)的說法，不正確的是()A．試驗(yàn)所用的巴比妥緩沖液的pH為8.6B．點(diǎn)樣是在薄膜的光澤面上進(jìn)行的C．試驗(yàn)后可以得到五條色帶D．整個(gè)試驗(yàn)最關(guān)鍵的步驟是點(diǎn)樣解析：選B。在點(diǎn)樣時(shí)，用蓋玻片在薄膜的非光澤面且離薄膜一端2cm處輕輕點(diǎn)樣。9．下圖是人血清蛋白在以醋酸纖維薄膜為支持物，pH為8.6的巴比妥緩沖液中電泳分別結(jié)果示意圖，由此圖不能得出的結(jié)論是()A．在pH為8.6的巴比妥緩沖液中γ、β、α2、α1和清蛋白都帶負(fù)電荷B．在pH為8.6的巴比妥緩沖液中電泳時(shí)，γ、β、α2、α1和清蛋白遷移速率不同C．β球蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量肯定比α球蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量大D．在pH為8.6的巴比妥緩沖液中γ球蛋白遷移速率最慢，清蛋白遷移速率最快解析：選C。帶電粒子在電場(chǎng)中遷移的速率是帶電粒子帶電性質(zhì)、帶電量、粒子大小、粒子形態(tài)共同作用的結(jié)果。10．如圖是用除去DNA的濾液進(jìn)行血紅蛋白的提取和分別試驗(yàn)裝置，下列敘述不正確是()A．用圖甲裝置對(duì)濾液進(jìn)行處理，其目的是去除相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)B．圖乙裝置的試管中收集到的液體中最先出現(xiàn)的是相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)C．用圖乙裝置分別血紅蛋白時(shí)，待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每管收集5mL，連續(xù)收集D．圖丙裝置中電泳法分別提純血紅蛋白的原理是血紅蛋白帶有肯定量的電荷，在電場(chǎng)的作用下向一極移動(dòng)解析：選B。圖甲裝置為透析法，通過對(duì)濾液進(jìn)行處理，其目的是去除相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)，A正確；圖乙裝置為凝膠色譜法，試管中收集到的液體中最先出現(xiàn)的是相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)，B錯(cuò)誤；用圖乙裝置分別血紅蛋白時(shí)，待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每管收集5mL，連續(xù)收集，C正確；丙裝置中電泳法分別提純血紅蛋白的原理是血紅蛋白帶有肯定量的電荷，在電場(chǎng)的作用下向一極移動(dòng)，D正確。11.如圖表示對(duì)某蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果(類似于紙層析法分別色素)，下列相關(guān)敘述不正確的是()A．蛋白質(zhì)上某些基團(tuán)解離后可使蛋白質(zhì)帶電，電場(chǎng)中帶電的蛋白質(zhì)分子(或多肽)會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)B．蛋白質(zhì)在SDS—聚丙烯酰胺凝膠中的遷移速度完全取決于其所帶凈電荷多少C．蛋白質(zhì)在SDS—聚丙烯酰胺凝膠中的遷移速度基本取決于其分子量大小D．電泳結(jié)果表明溶液中蛋白質(zhì)可能有兩種，但也可能只有一種解析：選B。蛋白質(zhì)的氨基與羧基可發(fā)生解離，使其帶正電或負(fù)電，在電場(chǎng)中發(fā)生遷移。SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳中所加的SDS可完全掩蓋蛋白質(zhì)本身所帶電荷，故其移動(dòng)速度與本身所帶電荷無關(guān)，而由其分子量大小確定。SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳會(huì)使蛋白質(zhì)水解成肽鏈，故結(jié)果所示可能只有一種蛋白質(zhì)(有兩種肽鏈)，也可能有兩種蛋白質(zhì)。12．下列關(guān)于凝膠色譜法的原理及操作，不正確的是()A．是利用凝膠把分子大小不同的物質(zhì)分別開的一種方法B．在洗脫過程中，大分子不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部而最先流出，而小分子可以進(jìn)入凝膠內(nèi)部而流速緩慢，最終流出C．凝膠內(nèi)部有很微細(xì)的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其空隙大小與被分別的物質(zhì)分子的大小無相應(yīng)關(guān)系D．一般狀況下，凝膠對(duì)要分別的物質(zhì)沒有吸附作用，因此全部要分別的物質(zhì)都應(yīng)當(dāng)被洗脫出來解析：選C。凝膠色譜法是依據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量大小分別蛋白質(zhì)的有效方法。凝膠是由多糖類化合物構(gòu)成的，其內(nèi)部有很微細(xì)的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)可以進(jìn)入凝膠內(nèi)部，路程較長，移動(dòng)速度較慢；而相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部，路程較短，移動(dòng)速度較快，因此在洗脫過程中先分別出來。不同的凝膠，其立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不同，孔隙大小不同，因此可分別的分子大小也不同。凝膠一般對(duì)分別的物質(zhì)無吸附作用，所以要分別的物質(zhì)都應(yīng)當(dāng)被洗脫出來，這是凝膠色譜法與一般層析法的不同。二、非選擇題13．請(qǐng)依據(jù)血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳試驗(yàn)回答下列問題：(1)試驗(yàn)所用的主要試劑有：________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(2)試驗(yàn)所用緩沖液的pH為________，為什么？________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)點(diǎn)樣應(yīng)點(diǎn)在薄膜的哪一面？__________，方法是：用__________在血清中蘸一下，在離薄膜一端________cm處輕輕按下，隨即提起。(4)實(shí)施電泳時(shí)，每厘米膜寬電流強(qiáng)度為________________________________________________________________________，電泳時(shí)間為________________________。解析：(1)血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳試驗(yàn)需配制的試劑有巴比妥緩沖液、染色液、漂洗液、透亮液等。(2)試驗(yàn)所用的緩沖液的pH為8.6，因?yàn)榇藭r(shí)血清中的各種蛋白質(zhì)都呈負(fù)電性，而且彼此電荷大小不同，便于分別。(3)在點(diǎn)樣時(shí)，用蓋玻片在膜的非光澤面且離薄膜一端2cm處輕輕點(diǎn)樣。(4)在實(shí)施電泳時(shí)，蓋上電泳槽蓋，在薄膜平衡約10min后通上電源，調(diào)整電流強(qiáng)度至每厘米膜寬0.4～0.8mA，電泳時(shí)間為60～90min。答案：(1)巴比妥緩沖液、染色液、漂洗液、透亮液等(2)8.6在此pH下，血清中的各種蛋白質(zhì)都呈負(fù)電性，而且彼此電荷大小不同，便于分別(3)非光澤面蓋玻片2(4)0.4～0.8mA60～90min14.凝膠色譜技術(shù)是20世紀(jì)六十年頭初發(fā)展起來的一種快速而又簡潔的分別技術(shù)，由于設(shè)備簡潔、操作便利、不須要有機(jī)溶劑，對(duì)高分子物質(zhì)有很高的分別效果，目前已經(jīng)被生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程學(xué)、分子免疫學(xué)以及醫(yī)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，不但應(yīng)用于科學(xué)試驗(yàn)探討，而且已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè)生產(chǎn)。據(jù)圖回答問題：(1)a、b均為蛋白質(zhì)分子，其中先從層析柱中洗脫出來的是________，緣由是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(2)自己制作凝膠色譜柱時(shí)，在色譜柱底部d位置相當(dāng)于多孔板的結(jié)構(gòu)可由________替代。(3)裝填凝膠色譜柱時(shí)，色譜柱內(nèi)不能有氣泡存在，緣由是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)洗脫用的液體應(yīng)盡量與浸泡凝膠所用的液體______(填“相同”或“不同”)，洗脫時(shí)，對(duì)洗脫液的流速要求是________。解析：用凝膠色譜法分別各種蛋白質(zhì)時(shí)，大分子蛋白質(zhì)先洗脫出來，小分子蛋白質(zhì)后洗脫出來。大分子蛋白質(zhì)由于直徑較大，不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，而只能分布于顆粒之間，所以向下移動(dòng)的速度較快。小分子蛋白質(zhì)可進(jìn)入凝膠內(nèi)，在向下移動(dòng)的過程中，從一個(gè)凝膠顆粒內(nèi)擴(kuò)散到顆粒間隙后再進(jìn)入另一凝膠顆粒，如此不斷地進(jìn)入和擴(kuò)散，小分子蛋白質(zhì)的下移速度落后于大分子蛋白質(zhì)。在裝填凝膠色譜柱時(shí)，不得有氣泡存在，因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分別效果；洗脫時(shí)要調(diào)整洗脫液流速，保持穩(wěn)定。答案：(1)aa的相對(duì)分子質(zhì)量大，無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快(2)尼龍網(wǎng)或尼龍紗(3)氣泡會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分別效果(4)相同保持穩(wěn)定15．商品化植酸酶主要來自微生物，首先篩選出產(chǎn)酶的菌株，然后制備植酸酶，請(qǐng)依據(jù)下面的流程圖回答問題：(1)Ⅰ中的主要成分有哪些？____________________；Ⅱ中包含哪些成分？__________________。(2)請(qǐng)寫一種純化得到植酸酶的方法：________________________________________________________________________；其原理是_____________________