食品微生物 食品微生物檢驗(yàn)的指標(biāo)學(xué)習(xí)資料

第四章食品微生物檢驗(yàn)的指標(biāo)食品在食用前的各個(gè)環(huán)節(jié)中，被微生物污染往往是不可避免的。評(píng)價(jià)食品被微生物污染的程度，要采用微生物檢驗(yàn)指標(biāo)采進(jìn)行。常采用的微生物檢驗(yàn)指標(biāo)為三項(xiàng)細(xì)菌指標(biāo)，即細(xì)菌數(shù)量(主要是菌落總數(shù))、大腸菌群最近似數(shù)(MPN)和致病菌。第一節(jié)食品中菌落總數(shù)的測(cè)定食品中細(xì)菌數(shù)量越多，則食品腐敗變質(zhì)的速度就越快，甚至可引起食用者的不良反應(yīng)．如有人認(rèn)為細(xì)菌數(shù)量達(dá)到100—1000萬(wàn)個(gè)／g時(shí)食品就可能引起食用者的食物中毒。菌落：指細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖而形成的能被肉眼識(shí)別的生長(zhǎng)物，它是由數(shù)以萬(wàn)計(jì)相同的細(xì)菌集合而成。細(xì)菌數(shù)量的表示方法由于所采用的計(jì)數(shù)方法不同而有兩種：菌落總數(shù)和細(xì)菌總數(shù)：一、菌落總數(shù)的概念及衛(wèi)生意義細(xì)菌總數(shù)作為食品衛(wèi)生質(zhì)量的指標(biāo)食品中微生物數(shù)量的表示方法：1g食品、1cm2的食品表面積和1ml食品中的細(xì)菌（雜菌）總數(shù)表示。細(xì)菌（雜菌）總數(shù)作為食品衛(wèi)生質(zhì)量評(píng)定的原因：

（1）反映食品的新鮮程度（2）食品生產(chǎn)過程中有否變質(zhì)（3）食品生產(chǎn)的一般衛(wèi)生情況不適于用細(xì)菌（雜菌）總數(shù)作為衛(wèi)生質(zhì)量指標(biāo)的食品：

發(fā)酵食品（尤其是細(xì)菌發(fā)酵食品）食品衛(wèi)生質(zhì)量綜合評(píng)定的重要性：

微生物毒素的存在，病原微生物的存在指一定數(shù)量或面積的食品樣品，在一定條件下進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，使每一個(gè)活菌只能形成一個(gè)肉眼可見的菌落，然后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)所得的菌落數(shù)量。通常以lg或1ml或lcm2樣品中所含的菌落數(shù)量來表示。按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定，即在需氧情況下，37℃培養(yǎng)48h，能在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)的細(xì)菌菌落總數(shù)，所以厭氧或微需氧菌、有特殊營(yíng)養(yǎng)要求的以及非嗜中溫的細(xì)菌，由于現(xiàn)有條件不能滿足其生理需求，故難以繁殖生長(zhǎng)。因此菌落總數(shù)并不表示實(shí)際中的所有細(xì)菌總數(shù)，菌落總數(shù)并不能區(qū)分其中細(xì)菌的種類，所以有時(shí)被稱為雜菌數(shù)，需氧菌數(shù)等。1、菌落總數(shù)指一定數(shù)量或面積的食品樣品．經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶幚砗?，在顯微鏡下對(duì)細(xì)菌進(jìn)行直接計(jì)數(shù)。其中包括各種活菌數(shù)和尚未消失的死菌數(shù)。細(xì)菌總數(shù)也稱細(xì)菌直接顯微鏡數(shù)。通常以1g或1m1或lcm2—樣品中的細(xì)菌總數(shù)來表示。菌落總數(shù)測(cè)定是用來判定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量，它反映食品在生產(chǎn)過程中是否符合衛(wèi)生要求，以便對(duì)被檢樣品做出適當(dāng)?shù)男l(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)。菌落總數(shù)的多少在一定程度上標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣2、細(xì)菌總數(shù)二、菌落總數(shù)測(cè)定的意義1、判定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量。2、預(yù)測(cè)食品存用的期限長(zhǎng)短。3、了解細(xì)菌在食品中的繁殖動(dòng)態(tài)。三、菌落總數(shù)測(cè)定的方法※平板傾注法＃平板表面涂布法平板表面點(diǎn)滴法涂布平板法是將營(yíng)養(yǎng)瓊脂制成平板、經(jīng)50℃1—2小時(shí)或35℃18～20小時(shí)干燥后，在上面滴加檢樣稀釋液0.2ml，用“L”棒涂布于整個(gè)平板的表現(xiàn)，放置約10分鐘，將平板翻轉(zhuǎn)，放至36+1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24±2小時(shí)，（水產(chǎn)品用30C培養(yǎng)48±2小時(shí))取出，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，然后乘以5(由0．2ml換算為1ml)，再乘以樣品稀釋液的倍數(shù)，即得每克或每升檢樣所含菌落數(shù)。這種方法比常規(guī)檢驗(yàn)法效果好。因?yàn)榫渖L(zhǎng)在表面，便于識(shí)別和檢查其形態(tài)，雖檢樣中含有食品顆粒，也不會(huì)發(fā)生混淆．但是本法取樣量比常規(guī)檢驗(yàn)法少。代表性會(huì)受到一定影響。點(diǎn)滴平板法與涂布平板法相似。不同的是點(diǎn)滴平板法只是用標(biāo)定好的微量吸管或注射器針頭按滴(使每滴相當(dāng)于0．025m1)將檢樣稀釋液滴加于瓊脂平板上固定的區(qū)域(預(yù)先在乎板背面用標(biāo)記筆劃成四個(gè)區(qū)域)．每個(gè)區(qū)域滴1滴，每個(gè)稀釋度滴兩個(gè)區(qū)域，作為平行試驗(yàn)。滴加后，將平板放平約10分鐘，然后翻轉(zhuǎn)平板，如涂布平板法+樣移入溫箱中，培養(yǎng)6—8小時(shí)后進(jìn)行計(jì)數(shù)，將所得菌落數(shù)乘以40(由0．025m1換算為1ml)，再乘以樣品的稀釋倍數(shù)，即得每克或每毫升檢樣所含菌落數(shù)。四、平板傾注法測(cè)定菌落總數(shù)檢驗(yàn)步驟(程序)：檢樣→稀釋處理→做平板→培養(yǎng)→菌落計(jì)數(shù)→報(bào)告結(jié)果（一）、樣品稀釋及做平板1ml1ml1ml1ml1:101:10001:1001:100001ml1ml1ml加入46℃營(yíng)養(yǎng)瓊脂12~15ml25g/ml樣品生理鹽水

檢樣從開始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用時(shí)間不宜超過20min，以防止細(xì)菌有所死亡或繁殖。

（二）培養(yǎng)普通食品:37℃48h倒放平板清涼飲料、調(diào)味品、糕點(diǎn)、酒類：37℃24h水產(chǎn)品:30℃48h（三）計(jì)數(shù)和報(bào)告

到達(dá)規(guī)定培養(yǎng)時(shí)間，應(yīng)立即計(jì)數(shù)。如果不能立即計(jì)數(shù)，應(yīng)將平板放置于0－4℃，但不得超過24h。1、菌落的選擇（1）、單個(gè)菌做一個(gè)菌落計(jì)（2）、呈鏈狀生長(zhǎng)的菌落之間無(wú)任何明顯界限，作為一個(gè)菌落計(jì)，如存在有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應(yīng)按一個(gè)菌落計(jì)算。（3）、如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個(gè)平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù)。2、平板菌落計(jì)數(shù)的選擇

（1）、選取菌落數(shù)在30～300之間的平板（SN標(biāo)準(zhǔn)要求為25～250個(gè)菌落），若有二個(gè)稀釋度均在30～300之間時(shí)，比值小于或等于2取平均數(shù)，比值大于2則其較小數(shù)字。（2）、如均大于300，則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告（3）、如均小于30，則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)報(bào)告（4）、如菌落數(shù)有的大于300，有的又小于30，不在30～300之間，以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告（5）、如所有稀釋度均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則應(yīng)按小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告。

3、菌落數(shù)的報(bào)告菌落數(shù)在1～100時(shí)，按實(shí)有數(shù)字報(bào)告，如大于100時(shí)，則報(bào)告前面兩位有效數(shù)字，第三位數(shù)按四舍五入計(jì)算。固體檢樣以克（g)為單位報(bào)告，液體檢樣以毫升（ml）為單位報(bào)告，表面涂擦則以平方厘米（cm2）報(bào)告。

(四)、檢驗(yàn)注意事項(xiàng)1、對(duì)照平板出現(xiàn)幾個(gè)菌落時(shí)，要追加對(duì)照平板；2、吸管進(jìn)出瓶子或試管時(shí)，吸管口不得觸及瓶口、管口的外圍部分；3、吸管插入試樣液內(nèi)的深度不得小于2.5cm,調(diào)整時(shí)要使管尖與容器內(nèi)壁緊貼;4、進(jìn)行稀釋時(shí),吸管口不得與稀釋液接觸;5、檢樣從開始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用時(shí)間不宜超過20min.6、稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，不可作為檢樣計(jì)數(shù)報(bào)告的依據(jù)。復(fù)習(xí)題1、什么是菌落總數(shù)？2、測(cè)定食品、飲料等產(chǎn)品的菌落總數(shù)有什么意義？3、畫出平板傾注法測(cè)定菌落總數(shù)的示意圖。4、在測(cè)定菌落總數(shù)時(shí)，如何選擇菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)？5、在菌落總數(shù)的檢驗(yàn)中，要注意哪些事項(xiàng)？6、在菌落總數(shù)的檢驗(yàn)中，如何根據(jù)樣品的特性選擇培養(yǎng)溫度和時(shí)間？第二節(jié)食品中大腸菌群的檢驗(yàn)一、大腸菌群

什么是大腸菌群？

指一群需氧及兼性厭氧，在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的革蘭氏染色陰性無(wú)芽胞桿菌。大腸菌群的組成:大腸埃希氏菌發(fā)屬、檸檬酸桿菌屬、產(chǎn)氣克雷伯氏菌屬和陰溝腸桿菌。大腸菌群并非細(xì)菌學(xué)分類命名，而是衛(wèi)生細(xì)菌領(lǐng)域的用語(yǔ)，它不代表某一個(gè)或某一屬細(xì)菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致。屬代表種致病性埃希氏菌屬（Escherichia）大腸埃希氏菌(E.coli)腸道外感染，急性腹瀉志賀氏菌屬（Shigella）痢疾志賀氏菌(Sh.dysenteriae)細(xì)菌性痢疾愛德華氏菌屬（Edwardsiella）遲純愛德華氏菌(E.tarda)蛇類等血?jiǎng)游锏恼Ｄc道寄居菌，偶見于健康人或腹瀉者糞便內(nèi)沙門氏菌屬（Salmonella）傷寒沙門氏菌(S.typhi)腸熱癥、急性腸炎、敗血癥枸櫞酸桿菌屬(Citrobacter)弗勞地氏枸櫞酸桿菌(C.freundii)條件致病菌，引起繼發(fā)性感染克雷伯氏菌屬(Klebsiella)肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)肺炎，泌尿系、創(chuàng)傷感染敗血癥等陰溝腸桿菌(Enterobacter)產(chǎn)氣桿菌(E.aerogenes)很少引起原發(fā)性感染哈夫尼亞菌屬(Hafnia)蜂窩啥夫尼亞菌(H.alvei)對(duì)人無(wú)致病性沙雷氏菌屬(Serrati)粘質(zhì)沙雷氏菌(S.marcescens)條件致病菌，引起泌尿系，呼吸道及創(chuàng)傷感染變形桿菌屬(Proteus)普通變形桿菌(P.vulgaris)食物中毒，泌尿系、呼吸道感染等耶爾森氏菌屬(Yersinia)鼠疫耶爾森氏菌(Y.pestis)鼠疫歐文氏菌屬(Erwinia)草原居民歐文氏菌(E.herbicola)植物寄生菌，曾從人體腸道及化膿扁桃體中分離到1、概念：大腸菌群系指一群在37度能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性的無(wú)芽胞桿菌。從種類上講，大腸菌舉包括許多生化及血清學(xué)特性均很不相同的細(xì)菌，其中有埃希氏菌屬，枸椽酸菌屬、腸桿菌屬和克雷伯氏菌屬等等．以埃希氏菌屬為主，大腸菌群MPN是指在100ml(或100g)食品檢樣中聽含的大腸菌群的最近似或最可能數(shù)。2、作為（判斷食品是否被腸道致病菌所污染及污染程度的）指示菌的條件：①和腸道致病菌的來源相同，并且在相同的來源中普遍存在和數(shù)量甚多，以易于檢出。②在外界環(huán)境中的生存時(shí)間與腸道致病菌相當(dāng)或稍長(zhǎng)。③檢驗(yàn)方法比較簡(jiǎn)便。人們通過大量研究發(fā)現(xiàn)，大腸菌群在數(shù)量和檢驗(yàn)方面均符合指示菌的三項(xiàng)要求，因此，用大腸菌群作為標(biāo)志食品是否已被腸道致病菌污染及其污染的程度的指標(biāo)菌是合適的。大腸菌群作為食品的指示菌即是說：在食品中存在的大腸菌群數(shù)量越多，表示該食品受糞便污染的程度越大，也就相應(yīng)地表示該食品被腸道致病菌污染的可能性也就越大。3、大腸菌群數(shù)量的表示方法有兩種：1）大腸菌群MPN大腸菌群MPN是采用一定的方法，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)的原理所測(cè)定和計(jì)算出的一種最近似數(shù)值；2）大腸菌群值。大腸菌群值是指在食品中檢出一個(gè)大腸菌群細(xì)菌時(shí)所需要的最少樣品量。故大腸菌群值越大，表示食品中所含的大腸菌群細(xì)菌的數(shù)量越少，食品的衛(wèi)生質(zhì)量也就越好：在這兩種表示方法中，目前國(guó)內(nèi)外普遍采用大腸菌群MPN，而大腸菌群值逐漸趨于不用。大腸菌群是評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，目前已被國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用于食品衛(wèi)生工作中。4、大腸菌群MPN的常規(guī)檢驗(yàn)方法大腸菌群MPN常規(guī)的檢驗(yàn)方法有三管系列、五管系列和其它系列，其原理相同，區(qū)別在于樣品滴度和各滴度的管數(shù)，三管系列接種三個(gè)滴度、每個(gè)滴度三管、五管系列接種五個(gè)滴度、每個(gè)滴度五管。以三管系列較為簡(jiǎn)便。我國(guó)現(xiàn)有兩個(gè)大腸菌群檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，一個(gè)是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB4789．3-94)，另一個(gè)是行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SN0169-92)。大腸菌群MPN的常規(guī)檢驗(yàn)方法是將不同倍數(shù)的檢樣稀釋液接種到乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，經(jīng)一定的溫度、時(shí)間發(fā)酵，若均不產(chǎn)氣者則可報(bào)告為陰性；如有產(chǎn)氣者，則需進(jìn)行分離培養(yǎng)，證實(shí)試驗(yàn)，然后查取MPN檢索表，報(bào)告出每100ml(g)大腸菌群的最近似數(shù)。5、不適于用大腸菌群作為糞便污染指示菌的食品冷凍食品經(jīng)射線照射處理的食品

pH較高的食品在上述食品中大腸菌群的細(xì)菌比許多腸道病原微生物更易死亡。大腸桿菌作為食品衛(wèi)生質(zhì)量指標(biāo)大腸桿菌是最早用于食品衛(wèi)生質(zhì)量評(píng)定的指標(biāo)菌少數(shù)腸道病原菌在水體中的存活能力強(qiáng)于大腸桿菌。腸球菌（糞鏈球菌、糞渣鏈球菌），可作為糞便污染指示菌，但數(shù)量較大腸菌群少，不易檢測(cè)。具芽孢的細(xì)菌（嗜熱需氧芽孢菌數(shù)、嗜熱厭氧芽孢菌數(shù)、嗜溫需氧芽孢菌、嗜溫厭氧芽孢菌數(shù)數(shù)、平酸芽孢菌數(shù)、產(chǎn)硫化物芽孢菌數(shù)）霉菌和酵母菌作為食品衛(wèi)生質(zhì)量指標(biāo)的其他微生物1、糞便污染的指標(biāo)菌：大腸菌群或大腸桿菌二、大腸菌群的測(cè)定意義2、以大腸菌群作為糞便指標(biāo)菌原因：在糞便中數(shù)量最大；在外環(huán)境中存活的時(shí)間與致病菌大體相同；檢測(cè)方法簡(jiǎn)便容易。3、大腸菌群的測(cè)定意義（1）、判斷食品中否受到糞便污染。（2）、有利于控制腸道傳染病的發(fā)生和流行。（3）、有利于控制食品在生產(chǎn)加工、運(yùn)輸、保存等過程中的衛(wèi)生狀況。三、大腸菌群的生物學(xué)特性1.形態(tài)與染色：革蘭氏染色陰性，無(wú)芽胞桿菌。2.發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣

3.培養(yǎng)特性：在ＥＭＢ瓊脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，常有金屬光澤；在麥康凱瓊脂上的典型菌落:呈桃紅色或中心桃紅、圓形，扁平，光滑濕潤(rùn)。伊紅美蘭EMB平板照片及原理EMB培養(yǎng)基中大腸桿菌，因其強(qiáng)烈分解乳糖而產(chǎn)生大量的混合酸，菌體帶H+,故可染上酸性染料伊紅，又因伊紅與美藍(lán)結(jié)合，使菌落呈深紫色。從菌落表面反光還可看到綠色金屬閃光。而產(chǎn)酸弱的菌株的菌落呈棕色。不發(fā)酵乳酸的菌落無(wú)色透明。麥康凱瓊脂平板Ageofcultureis24h大腸桿菌、大腸菌群選擇性顯色培養(yǎng)基--COLIID用于在37℃下對(duì)食品中大腸菌群和大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)、計(jì)數(shù)及大腸桿菌的鑒定本培養(yǎng)基含有兩種顯色物質(zhì)，可以直接識(shí)別大腸菌群（coliforms）和鑒定大腸桿菌（Escherichiacoli）,而不需附加任何試劑。

菌落顏色玫瑰紅藍(lán)色透明.

β-葡萄糖苷酶+

-

-

.

β-半乳糖苷酶+

+

-

.

大腸桿菌其它大腸菌群其它革蘭氏陰性菌.

β-半乳糖苷酶（+）大腸菌群存在β-半乳糖苷酶（+）大腸菌群存在

β-葡萄糖苷酶（+）大腸桿菌存在β-葡萄糖苷酶（-）無(wú)大腸菌群存在

大腸桿菌平板菌落照片

腸桿菌掃描電鏡照片.四、大腸菌群檢驗(yàn)方法及操作方法三步法：乳糖膽鹽發(fā)酵試驗(yàn)→分離培養(yǎng)→證實(shí)試驗(yàn)(乳糖發(fā)酵試驗(yàn))

乳糖發(fā)酵試驗(yàn)：樣品稀釋后，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。36±1℃培養(yǎng)48±2h，觀察是否產(chǎn)氣。分離培養(yǎng)：將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，36±1℃培養(yǎng)18-24h，觀察菌落形態(tài)。證實(shí)試驗(yàn)：挑取平板上的可疑菌落，進(jìn)行革蘭氏染色觀察。同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管36±1℃培養(yǎng)24±2h，觀察產(chǎn)氣情況。報(bào)告：根據(jù)證實(shí)為大腸桿菌陽(yáng)性的管數(shù)，查MPN表，報(bào)告每100ml（g）大腸菌群的MPN值。具體操作參見GB4789.3-94《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群測(cè)定》（一）國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：（二）行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)：

兩步法：推測(cè)試驗(yàn)→證實(shí)試驗(yàn)原國(guó)家商檢局制訂的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，等效采用美國(guó)FDA的標(biāo)準(zhǔn)方法，用于對(duì)出口食品中的大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)。本方法采用兩步法：推測(cè)試驗(yàn)：樣品稀釋后，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管LST肉湯。36±1℃培養(yǎng)48±2h，觀察是否產(chǎn)氣。證實(shí)試驗(yàn)：將產(chǎn)氣管培養(yǎng)物接種煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中，36±1℃培養(yǎng)48±2h，觀察是否產(chǎn)氣。以BGLB產(chǎn)氣為陽(yáng)性。查MPN表，報(bào)告每ml(g)樣品中大腸菌群的MPN值。具體操作參見SN0169-92《中華人民共和國(guó)進(jìn)出口商品檢驗(yàn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗(yàn)方法》檢樣稀釋處理EMB等革蘭氏染色乳糖發(fā)酵管革蘭氏陰性無(wú)芽胞產(chǎn)氣革蘭氏陽(yáng)性大腸桿菌陰性大腸桿菌陰性報(bào)告不產(chǎn)氣乳糖膽鹽發(fā)酵管產(chǎn)氣不產(chǎn)氣大腸桿菌陰性報(bào)告報(bào)告報(bào)告大腸桿菌陽(yáng)性1:1001:10各加入1ml各加入10ml各加入1ml單料乳糖膽鹽發(fā)酵管單料乳糖膽鹽發(fā)酵管雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管初發(fā)酵檢樣稀釋檢樣量1g/ml檢樣量0.1g/ml檢樣量0.01g/mlEMB分離培養(yǎng)證實(shí)試驗(yàn)乳糖發(fā)酵管鏡檢查MPN表報(bào)告結(jié)果表1糞大腸菌群在幾種常用分離培養(yǎng)上的菌落特征培養(yǎng)基菌落特征伊紅蘭培養(yǎng)基(EMB)紫黑色、有金屬光澤，紫黑色、不帶或略帶光澤，淡紫紅色、中心紫黑色、黑紅或深紫紅色品紅亞硫酸納(遠(yuǎn)藤氏平板)紫紅色、有金屬光澤，深紅色、不帶或略帶金屬光澤，淡紅色、中心較深中國(guó)蘭平板深藍(lán)色，淺藍(lán)色、中心深藍(lán)色麥康凱平板(MacC)桃紅色，粉紅色、中心桃紅色說明1．MPN檢索表：

MPN為最大可能數(shù)(MostProbableNumber)的簡(jiǎn)稱。這種方法，對(duì)樣品進(jìn)行連續(xù)系列進(jìn)行稀釋，加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從規(guī)定的反應(yīng)呈陽(yáng)性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來推算樣品中菌數(shù)最近似的數(shù)值。

MPN檢索表只給了三個(gè)稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。注意國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中所附MPN表所用稀釋度是不同的，而且結(jié)果報(bào)告單位也不相同。2．初發(fā)酵和證實(shí)試驗(yàn)：無(wú)論是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的三步法還是行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的兩步法，都利用了乳糖發(fā)酵管進(jìn)行了兩次發(fā)酵試驗(yàn)，培養(yǎng)基的配制略有不同，但都是為了證實(shí)培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義，即“在37℃分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。初發(fā)酵陽(yáng)性管，不能肯定就是大腸菌群細(xì)菌，經(jīng)過證實(shí)試驗(yàn)后，有時(shí)可能成為陰性。有數(shù)據(jù)表明，食品中大腸菌群檢驗(yàn)步驟的符合率，初發(fā)酵與證實(shí)試驗(yàn)相差較大。因此，在實(shí)際檢測(cè)工作中，證實(shí)試驗(yàn)是必需的。3．產(chǎn)氣量與倒管：在乳糖發(fā)酵試驗(yàn)工作中，經(jīng)?？梢钥吹皆诎l(fā)酵倒管內(nèi)極微少的氣泡（有時(shí)比小米粒還?。?，有時(shí)可以遇到在初發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。實(shí)驗(yàn)表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對(duì)產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問時(shí)，可以用手輕輕打動(dòng)試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn)。4．挑選菌落：國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，需要對(duì)初發(fā)酵陽(yáng)性培養(yǎng)物接種伊紅美藍(lán)平板分離，對(duì)典型和可疑菌落進(jìn)行觀察和證實(shí)試驗(yàn)。由于大腸菌群是一群細(xì)菌的總稱，在平板大腸菌群菌落的色澤、形態(tài)等方面較大腸菌更為復(fù)雜和多樣，而且與大腸菌群的檢出率密切相關(guān)。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定伊紅美藍(lán)平板為分離培養(yǎng)基，在該平板上，大腸菌群菌落呈黑紫色有光澤或無(wú)光澤時(shí)，檢出率最高；紅色、粉紅色菌落檢出率較低。另外，挑取菌落數(shù)與大腸菌群的檢出率有密切關(guān)系，只挑取一個(gè)菌落，由于機(jī)率問題，尤其當(dāng)菌落不典型時(shí)，很難避免假陰性的出現(xiàn)。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如無(wú)典型菌落則應(yīng)多挑幾個(gè)，以免出現(xiàn)假陰性。5．抑菌劑：大腸菌群檢驗(yàn)中常用的抑菌劑有膽鹽、十二烷基硫酸鈉、洗衣粉、煌綠、龍膽紫、孔雀綠等。抑菌劑的主要作用是抑制其它雜菌，特別是革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中乳糖膽鹽發(fā)酵管利用膽鹽作為抑菌劑，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中LST肉湯利用十二烷基硫酸鈉作為抑菌劑，BGLB肉湯利用煌綠和膽鹽作為抑菌劑。抑菌劑雖可抑制樣品中的一些雜菌，而有利于大腸菌群細(xì)菌的生長(zhǎng)和挑選，但對(duì)大腸菌群中的某些菌株有時(shí)也產(chǎn)生一些抑制作用。有些抑菌劑用量甚微，稱量時(shí)稍有誤差，即可對(duì)抑菌作用產(chǎn)生影響，因此抑菌劑的添加應(yīng)嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。MPN法簡(jiǎn)介TheMostProbableNumberMethod1g/ml檢樣中最近似值(MPN)表以1、0.1、0.01、各用3管。陽(yáng)性管數(shù)MPN個(gè)/100g/ml1g/ml×30.1g/ml×30.01g/ml×3000＜30

001300026000390010300116001290013120020600219002212002315003090031130032160033190五、糞大腸菌群的檢驗(yàn)糞大腸菌群：系一群需氧及兼性厭氧，在44.5℃培養(yǎng)24h內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣和分解色氨酸產(chǎn)生靛基質(zhì)的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。檢驗(yàn)方法檢樣產(chǎn)酸產(chǎn)氣查MPN表報(bào)告EMB分離靛質(zhì)基試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)方法一：45℃EC肉湯發(fā)酵稀釋44℃乳糖膽鹽發(fā)酵方法二：檢樣稀釋36℃乳糖膽鹽發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣產(chǎn)酸產(chǎn)氣EMB分離查MPN表報(bào)告1、從制備樣品勻液至稀釋完畢,全過程不得超過15min。2、對(duì)產(chǎn)酸但未看到氣泡的乳糖發(fā)酵，用手輕打動(dòng)試管，如有氣泡沿管壁上浮，應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn)。

3、挑選菌落進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)時(shí)，最少要挑2個(gè)以上的典型菌落或非典型菌落進(jìn)行接種。4、不可用其他膽鹽代替指定的膽鹽。六、檢驗(yàn)注意事項(xiàng)靛基質(zhì)試驗(yàn)原理及照片有些細(xì)菌具有色氨酸酶，在蛋白胨水培養(yǎng)基中生長(zhǎng)能分解色氨酸產(chǎn)生吲哚（靛基質(zhì)），吲哚無(wú)色，肉眼不能觀察，如加入靛基質(zhì)試劑（含對(duì)二甲基氨基苯甲醛）即生成玫瑰吲哚而顯現(xiàn)紅色。七、大腸菌群快速檢驗(yàn)食品大腸菌群快速檢驗(yàn)方法：TTC顯色法；DC試管法；紙片法。（一）食品飲料大腸菌群快速檢驗(yàn)紙片

使用方法：1.樣品稀釋同國(guó)標(biāo)法2.接種：飲料和飲用水采用原液、1:10、1:100三個(gè)稀釋度，固體食品采用1:1、1:10和1:100三個(gè)稀釋度。用1亳升滅菌吸管吸取1亳升同一稀釋度的稀釋液均勻涂布到袋中的紙片上，做三個(gè)重復(fù)。3.培養(yǎng)：將接種好的紙片輕輕壓平（可疊放），在36℃下培養(yǎng)15－24h觀察結(jié)果。4.結(jié)果判定:紙片上出現(xiàn)紫紅色斑點(diǎn),其周圍有黃圈者,為陽(yáng)性.紙片為一種著色,無(wú)菌落生長(zhǎng)者為陰性.紙片呈紫蘭色,有紫紅色斑點(diǎn)，其周圍地黃圈者陰性.酸性食品接種后,紙片變黃,經(jīng)培養(yǎng)后無(wú)紫紅色斑點(diǎn)為陰性（二）餐具大腸菌群快速檢驗(yàn)(紙片法)使用方法：1.

采樣6—10份。碗、盤、杯等每份貼紙片兩張，用無(wú)菌生理鹽水濕潤(rùn)紙片后，立即貼于食具內(nèi)側(cè)表面，30秒后取下，置于原塑料袋內(nèi)。筷子以5只為一份樣品，用吸管吸取生理鹽水濕潤(rùn)紙片后，立即將筷子進(jìn)口端（約5cm）抹拭兩張，放入原塑料袋內(nèi)。2.將已采樣的紙樣置于37°C培養(yǎng)15小時(shí).紙片在黃色背景上出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)為陽(yáng)性，紙片在紫蘭色背景上呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，但周圍沒有黃暈均為大腸菌群陰性。同一份樣品兩張紙片均是陰性為合格。食品冷飲大腸菌群檢驗(yàn)紙片

冷飲、乳制品和調(diào)味品等大腸菌群的測(cè)定食品飲料大腸菌群快速檢驗(yàn)紙片

飲料、食用純水和糕點(diǎn)的大腸菌群測(cè)定餐具大腸菌快速檢驗(yàn)紙片

餐具衛(wèi)生消毒效果檢測(cè)大腸菌群測(cè)試片

適用于需要對(duì)大腸菌群準(zhǔn)確計(jì)數(shù)的樣品，如消毒牛乳、冷飲和調(diào)味品等。

八、水的大腸菌群檢驗(yàn)大腸菌群MPN/100mL細(xì)菌總數(shù)

CFU/mL

生活飲用水

≤3/L＜100

瓶裝飲用純凈水

≤3

≤20

飲用天然礦泉水罐裝產(chǎn)品0＜50地面水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

＜10000個(gè)/L

準(zhǔn)備加氯消毒后供飲用的水≤1000準(zhǔn)備加氯消毒后供飲用的水≤10000游泳池水≤100＜1000（一）、水樣的采集

1、自來水（未含氯）：龍頭火燒滅菌，暢流5—10′后取樣。2、地面水源水：江湖河，水庫(kù)，水池等。浸入水下20cm下取樣。水井50cm下取樣。3、漂白粉處理的水樣：自來水，游泳池水，應(yīng)在瓶?jī)?nèi)加入0.03g硫代硫酸鈉/500ml，或2ml1.5%硫代硫酸鈉液/500ml，除氯。4、運(yùn)送：2小時(shí)內(nèi)送到檢驗(yàn)室。6—10℃，<6h,立即檢驗(yàn).5、檢驗(yàn)前：將水樣振搖5—10分鐘。（二）、生活飲用水或食品生產(chǎn)用水的檢驗(yàn)（大腸菌群）

各加10ml各加100ml水樣初發(fā)酵三料乳糖膽鹽50毫升裝三料乳糖膽鹽5毫升裝EMB分離36℃培養(yǎng)24h復(fù)發(fā)酵乳糖發(fā)酵鏡檢36℃培養(yǎng)24h大腸菌群檢索表（飲用水）100ml陽(yáng)性管數(shù)10ml陽(yáng)性管數(shù)012每L水中大腸菌群數(shù)0＜3411138182713273111838414245251830706223692727431208315116193660230104069＞230（三）、瓶裝礦泉水的檢驗(yàn)

（大腸菌群）

原水樣雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管10毫升裝37℃培養(yǎng)24h產(chǎn)酸產(chǎn)氣者亮綠乳糖膽鹽發(fā)酵管37℃培養(yǎng)48h產(chǎn)酸產(chǎn)氣者查表報(bào)告各加入10ml水樣礦泉水的檢驗(yàn)檢索表陽(yáng)性管數(shù)MPN/100mL0012.225.139.24165＞

16(四)、水源水的檢驗(yàn)

接種量嚴(yán)重污染水：1、0.1、0.01、0.001ml各1份總量：1.111ml中度污染水：10、1、0.1、0.01ml各1份總量：11.11ml輕度污染水：100、10、1、0.1ml各1份總量：111.1ml原水樣接種量100ml用三料乳糖膽鹽接種量10ml用雙料乳糖膽鹽接種量≤1ml用單料乳糖膽鹽EMB分離乳糖發(fā)酵復(fù)發(fā)酵36℃培養(yǎng)24h36℃培養(yǎng)24h查表報(bào)告鏡檢復(fù)習(xí)題1、什么是大腸菌群？大腸菌群由哪些微生物組成？2、測(cè)定食品、飲料等產(chǎn)品的大腸菌群數(shù)有什么意義？3、大腸菌群具有哪些生物學(xué)特性？4、在大腸菌群數(shù)的檢驗(yàn)中，要注意哪些事項(xiàng)？5、在水的大腸菌群數(shù)檢驗(yàn)中，如何進(jìn)行水樣的采集？第三節(jié)致病性微生物食品首先是應(yīng)考慮其安全性，其次才是可食性和其他，食品中一旦含有致病性微生物，其安全性就隨之喪失，當(dāng)然其食用性也不復(fù)存在了；各國(guó)的衛(wèi)生部門對(duì)致病性微生物都作了嚴(yán)格的規(guī)定，把它作為食品衛(wèi)生質(zhì)量的最重要的指標(biāo)。食品生產(chǎn)是一個(gè)時(shí)間長(zhǎng)、環(huán)節(jié)多的復(fù)雜過程?？傊c食品有直接和間接關(guān)系的致病性微生物都可能污染食品。（以乳制品為例）1、能引起人類疾病和食物中毒的致病性微生物：沙門氏菌、葡萄球菌、鏈球菌、副溶血性弧菌，口蹄疫病毒等。2、能產(chǎn)生毒素并引起食物中毒的微生物：肉毒梭菌、葡萄球菌和產(chǎn)氣莢膜桿菌，也包括一些真菌，都會(huì)產(chǎn)生毒素。一、食品中常見的致病性微生物1、致病性微生物的檢驗(yàn)按照國(guó)家統(tǒng)一的方法進(jìn)行檢驗(yàn)。2、特例：在加工食品中能夠存活下來的致病性微生物注往受到了某種程度的損傷，它們會(huì)受到增菌液中抑制劑的影響而不能被檢測(cè)出來。因此，需要進(jìn)行前增菌，以幫助致病菌恢復(fù)到正常狀態(tài)。前增菌的適宜方法和使用的培養(yǎng)基則因食品的理化性質(zhì)、加工方法不同而異。以檢驗(yàn)沙門氏菌為例，干蛋品中的細(xì)菌用緩沖蛋白胨水進(jìn)行前增菌，脫脂乳粉中的細(xì)菌用煌綠水進(jìn)行前增菌，全脂乳粉則用滅菌蒸