第十一章 課時(shí)6 基因工程的基本工具與操作程序

202X單擊此處添加副標(biāo)題第十一章生物技術(shù)與工程課時(shí)6基因工程的基本工具與操作程序匯報(bào)日期考點(diǎn)1基因工程的基本工具考點(diǎn)2基因工程的基本操作程序考點(diǎn)3

DNA的粗提取與鑒定及DNA片段的擴(kuò)增與鑒定練習(xí)幫練透好題精準(zhǔn)分層添加標(biāo)題01單擊此處添加文本添加標(biāo)題02單擊此處添加文本Contents目錄

課標(biāo)要求1.闡明DNA重組技術(shù)的實(shí)現(xiàn)需要利用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具；2.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞和目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)鑒定等步驟；3.DNA的提取和鑒定；4.利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增DNA片段并完成電泳鑒定，或運(yùn)用軟件進(jìn)行虛擬PCR實(shí)驗(yàn)核心考點(diǎn)五年考情基因工程的

基本工具2023：重慶T12、湖北T4和T22(4)、新課標(biāo)T6；2022：湖北T24(3)；2021：湖北T7、全國(guó)乙T38基因工程的

基本操作程

序2023：遼寧T8和T25、江蘇T22、天津T17、山東T25、湖南T19(2)、全國(guó)乙T38、浙江1月T24(5)；2022：江蘇T24、全國(guó)乙T38、遼寧T12和T24Ⅰ、天津T15；2021：山東T25、遼寧T24、廣東T22、湖北T16、全國(guó)甲T38、天津T16、江蘇T23、福建T21、浙江6月T29(二)(2)；2020：浙江7月T24和T29(二)(1)(2)、浙江1月T29(二)(2)；2019：江蘇T33、全國(guó)ⅠT38、天津T9核心考點(diǎn)五年考情DNA的粗提取與鑒定及DNA片段的擴(kuò)增與鑒定2023：江蘇T9D、廣東T11；2022：山東T13；2021：山東T13；2020：海南T10；2019：江蘇T10核心素養(yǎng)對(duì)接1.科學(xué)思維——建立模型：基因工程的操作流程。分析與綜合：理解基因工程的工具；PCR的原理，推斷PCR反應(yīng)所需的條件；根據(jù)基因表達(dá)的過(guò)程，推斷目的基因檢測(cè)與鑒定的方式。2.科學(xué)探究——通過(guò)DNA的粗提取與鑒定及DNA片段的擴(kuò)增與鑒定的實(shí)際操作，培養(yǎng)科學(xué)探究能力命題分析

預(yù)測(cè)1.基因工程是高考的重點(diǎn)，常以科研或生產(chǎn)實(shí)踐為情境，考查基因工

程的基本工具及基本操作程序，也常與核酸的結(jié)構(gòu)、遺傳的物質(zhì)基

礎(chǔ)、細(xì)胞工程、胚胎工程等知識(shí)相結(jié)合進(jìn)行綜合考查，多以非選擇題

形式呈現(xiàn)，但也可以選擇題的形式呈現(xiàn)。2.預(yù)計(jì)2025年高考試題仍可能延續(xù)往年的考查形式及特點(diǎn)，分層設(shè)置

問(wèn)題，多角度考查基因工程的工具、操作程序等相關(guān)知識(shí)，同時(shí)原因

分析型試題的比例將大大增加

考點(diǎn)1基因工程的基本工具

1.基因工程的概念(1)手段：按照人們的愿望，通過(guò)[1]

?等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性。(2)目的：創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和[2]

?。(3)操作水平：[3]

。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施

工的，因此又叫作[4]

?。轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品分子水平重組DNA技術(shù)2.基因工程的基本工具磷酸二酯鍵黏性末端磷酸二酯鍵磷酸切割位點(diǎn)教材補(bǔ)遺[選必3P72“旁欄思考”]DNA連接酶和DNA聚合酶不是一回事。原因：

①DNA連接酶是催化兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，而DNA聚合酶只能催化

單個(gè)脫氧核苷酸加到已有的DNA片段3'末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；②DNA聚

合酶起作用時(shí)需要以一條DNA鏈為模板，而DNA連接酶起作用時(shí)不需要模板。質(zhì)粒限制酶切割位點(diǎn)3.與DNA有關(guān)的幾種酶的比較

項(xiàng)目種類作用底物作用結(jié)果限制酶DNA分子切開(kāi)磷酸二酯鍵，形成黏性末端或平末端DNA連接酶兩個(gè)DNA分子片段通過(guò)形成磷酸二酯鍵，進(jìn)而形成新的DNA分子DNA聚合酶DNA片段、脫氧核

苷酸通過(guò)形成磷酸二酯鍵，進(jìn)而形成新的單鏈DNA

分子DNA酶[10]

?斷開(kāi)磷酸二酯鍵，形成脫氧核苷酸解旋酶雙鏈DNA分子斷開(kāi)堿基對(duì)間的氫鍵，形成單鏈DNA分子RNA聚合酶DNA片段、核糖核

苷酸通過(guò)形成磷酸二酯鍵，進(jìn)而形成單鏈RNA分子DNA分子

基礎(chǔ)自測(cè)1.重組DNA技術(shù)所需要的工具酶有限制酶、DNA連接酶和載體。

(

×

)2.所有的限制酶都只能識(shí)別同一種特定的核苷酸序列。

(

×

)3.切割質(zhì)粒的限制性內(nèi)切核酸酶均能特異性地識(shí)別6個(gè)核苷酸序列。

(

×

)4.限制酶和DNA連接酶的作用部位一致，但作用相反。

(

√

)5.所有DNA連接酶都能連接黏性末端和平末端。

(

×

)6.載體的種類有質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)植物病毒等。

(

√

)7.載體質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為篩選的標(biāo)記基因。

(

×

)×××√×√×深度思考1.原核生物中存在限制酶的意義是什么？2.原核生物中限制酶為什么不切割自身的DNA？提示當(dāng)外源DNA入侵時(shí)，原核生物會(huì)利用限制酶切割外源DNA以保證自身安全，

這是原核生物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的防御機(jī)制。提示原核生物中不存在該酶的識(shí)別序列或識(shí)別序列已被修飾等。3.基因工程中的載體與細(xì)胞膜上的載體相同嗎？4.天然質(zhì)粒一般不能直接用作基因工程載體的原因是什么？提示不同?；蚬こ讨械妮d體通常是質(zhì)粒、噬菌體、動(dòng)植物病毒等，主要作用是

攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，或整合到受體DNA

上，隨受體DNA進(jìn)行同步復(fù)制；細(xì)胞膜上的載體一般為蛋白質(zhì)，主要是運(yùn)載要進(jìn)入

細(xì)胞的特定物質(zhì)。提示只有具有能自我復(fù)制、有一個(gè)或多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)、有標(biāo)記基因及對(duì)受體

細(xì)胞無(wú)害等特點(diǎn)的質(zhì)粒才可以直接用作基因工程的載體。實(shí)際上天然質(zhì)粒一般不完

全具備上述條件，其往往需要進(jìn)行人工改造后才能用于基因工程操作。

命題點(diǎn)

基因工程所需的工具酶分析1.[2023新課標(biāo)]某同學(xué)擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將

目的基因(兩端含相應(yīng)限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn))和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)

建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。12B.質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C.質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D.質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用

E

.

coli

DNA連接酶連接[解析]

只用一種限制酶切割質(zhì)粒和目的基因，會(huì)使質(zhì)粒和目的基因發(fā)生自身環(huán)化

或者使目的基因在質(zhì)粒中反向連接，而且酶3切割產(chǎn)生平末端，

E

.

coli

DNA連接酶

不能連接具有平末端的DNA片段，A錯(cuò)誤；用酶1切割目的基因，產(chǎn)生的是黏性末

端，用酶3切割質(zhì)粒，產(chǎn)生的是平末端，無(wú)法連接，B錯(cuò)誤；質(zhì)粒和目的基因都用酶

1和酶2切割后，可使用T4DNA連接酶連接，使目的基因定向插到質(zhì)粒中，C正確；

用酶4切割質(zhì)粒會(huì)破壞標(biāo)記基因，不能選擇酶4切割，D錯(cuò)誤。下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是(

C

)A.質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用

E

.

coli

DNA連接酶連接C12通性通法

圖解限制酶的選擇依據(jù)甲

乙(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切割位點(diǎn)確定限制酶的種類①應(yīng)選擇位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲中可選擇

Pst

Ⅰ。②不能選擇目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲中不能選擇

Sma

Ⅰ。12(2)根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類①通常選擇與待切割目的基因相同的限制酶，以確保出現(xiàn)相同的黏性末端，如圖乙

中的

Pst

Ⅰ。②在只有一種標(biāo)記基因時(shí)，選擇的限制酶不能破壞標(biāo)記基因，如圖乙中限制酶

Sma

Ⅰ

會(huì)破壞標(biāo)記基因。122.[2023保定模擬，10分]如圖為大腸桿菌及質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)模式圖，據(jù)圖回答下列

問(wèn)題。(1)a和質(zhì)粒的化學(xué)本質(zhì)相同，都是

，二者還具有其他共同點(diǎn)，如

?

(寫(xiě)出一條即可)。DNA

能夠自

我復(fù)制[解析]圖中a是擬核DNA，擬核DNA和質(zhì)粒的本質(zhì)都是DNA分子，均能夠自我

復(fù)制。12[解析]

DNA連接酶可以將具有互補(bǔ)末端的2個(gè)DNA片段連接在一起，形成重組

DNA分子，若質(zhì)粒的切割末端為－TGCGC，則與之連接的目的基因切割的黏性末端應(yīng)為CGCGT－。(2)若質(zhì)粒的切割末端為－TGCGC，則與之連接的目的基因切割的黏性末端應(yīng)

為

；可使用

?把質(zhì)粒和目的基因連接在一起。CGCGT－

A－DNA連接酶標(biāo)記基因便于重組

DNA的鑒定和篩選(3)氨芐青霉素抗性基因在質(zhì)粒DNA上作為

，其作用是

?

?。－A[解析]

質(zhì)粒上常具有標(biāo)記基因(如抗生素的抗性基因)，便于重組DNA的鑒定與篩選。12－A(4)下列常在基因工程中作為載體的是(

C

)A.蘇云金桿菌抗蟲(chóng)基因B.農(nóng)桿菌環(huán)狀RNA分子C.大腸桿菌的質(zhì)粒D.動(dòng)物細(xì)胞的染色體C(5)除質(zhì)粒外，常用的載體還有

和

?等。噬菌體動(dòng)植物病毒12考點(diǎn)2基因工程的基本操作程序

1.基因工程的基本操作程序表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和功能PCR穩(wěn)定存在表達(dá)上游轉(zhuǎn)錄下游標(biāo)記基因農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化Ca2+處理抗原一體化雜交教材補(bǔ)遺[選必3P77“相關(guān)信息”]Bt抗蟲(chóng)蛋白只有在某類昆蟲(chóng)腸道的堿性環(huán)境中才

能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細(xì)胞也沒(méi)有特異性受體。2.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因DNA半保留復(fù)制單鏈耐高溫的DNA聚合酶指數(shù)辨析PCR與體內(nèi)DNA復(fù)制的異同類型PCR體內(nèi)DNA復(fù)制時(shí)期人工控制，隨時(shí)進(jìn)行有絲分裂和減數(shù)分裂前的間期場(chǎng)所細(xì)胞外細(xì)胞內(nèi)解旋方式90℃以上高溫條件下變性解旋解旋酶催化酶耐高溫的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶等子鏈合成方式從兩條引物的3'端開(kāi)始連續(xù)合成一條連續(xù)合成，另一條不連續(xù)

合成結(jié)果擴(kuò)增DNA片段或基因合成整個(gè)DNA分子相同點(diǎn)①都需要DNA模板、引物、能量和一定的溫度條件；②都遵循堿

基互補(bǔ)配對(duì)原則；③DNA的合成都是從子鏈的5'端向3'端延伸

基礎(chǔ)自測(cè)1.基因表達(dá)載體中含有啟動(dòng)子和密碼子。

(

×

)2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心。

(

√

)3.啟動(dòng)子是與RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，是起始密碼子。

(

×

)4.Ti質(zhì)粒上的T－DNA可與雙子葉植物受體細(xì)胞的染色體DNA整合在一起。

(

√

)5.將重組表達(dá)載體導(dǎo)入動(dòng)物受精卵常用基因槍法。

(

×

)6.PCR擴(kuò)增時(shí)，50℃左右，引物與作為模板的單鏈DNA特定部位相互配對(duì)、結(jié)合。

(

√

)×√×√×√深度思考1.構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，為什么一般選用兩種限制酶切割目的基因和載體？提示因?yàn)橛貌煌南拗泼阜謩e處理目的基因和載體時(shí)，可以使目的基因兩側(cè)和載

體上各自具有兩個(gè)不同的黏性末端，防止目的基因或載體發(fā)生自身環(huán)化及目的基因

與載體反向連接。2.啟動(dòng)子與起始密碼子、終止子與終止密碼子有什么不同？項(xiàng)目本質(zhì)位置功能啟動(dòng)子DNA片段目的基因上游RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因

轉(zhuǎn)錄出mRNA終止子DNA片段目的基因下游使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來(lái)起始密

碼子mRNA上

三個(gè)相鄰

的堿基mRNA首端翻譯的起始信號(hào)(編碼氨基酸)提示啟動(dòng)子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對(duì)比項(xiàng)目本質(zhì)位置功能終止密

碼子mRNA上

三個(gè)相鄰的堿基mRNA尾端翻譯的結(jié)束信號(hào)(不編碼氨基酸)3.在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，目的基因的序列中能否含有用到的限制酶的識(shí)別序列，

為什么？4.在用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的過(guò)程中，為什么一定要將目的基因

插入Ti質(zhì)粒的T－DNA上？提示不能，因?yàn)槟康幕虻男蛄兄腥艉杏玫降南拗泼傅淖R(shí)別序列，目的基因可

能會(huì)被切斷。提示

Ti質(zhì)粒的T－DNA是可轉(zhuǎn)移的DNA，可轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)

胞染色體DNA上。將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T－DNA中，就可以使目的基因進(jìn)入植

物細(xì)胞。5.復(fù)性時(shí)，引物與DNA模板的結(jié)合是隨機(jī)的，但兩條解開(kāi)的DNA模板鏈結(jié)合的概率

較低，其原因是什么？提示

①模板鏈一般較長(zhǎng)，比引物復(fù)雜得多，重新結(jié)合的概率低；②加入引物的量

足夠多，而模板鏈較少，故引物和模板鏈結(jié)合的機(jī)會(huì)遠(yuǎn)大于模板鏈間的。

命題點(diǎn)1

PCR的過(guò)程和應(yīng)用分析1.[2021湖北]某實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)獲取目的基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除目的基因條帶(引

物與模板完全配對(duì))外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對(duì))。為了減少反

應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是(

D

)A.增加模板DNA的量B.延長(zhǎng)熱變性的時(shí)間C.延長(zhǎng)延伸的時(shí)間D.提高復(fù)性的溫度D1234[解析]

PCR過(guò)程中，引物和模板不完全配對(duì)會(huì)形成非特異條帶，增加模板DNA的

量可以提高反應(yīng)速率，但不會(huì)減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生，A錯(cuò)誤；延長(zhǎng)熱變性

的時(shí)間和延伸的時(shí)間對(duì)延伸中的配對(duì)影響不大，故不能有效減少非特異性條帶的產(chǎn)

生，B、C錯(cuò)誤；非特異性條帶增加的原因可能是復(fù)性溫度過(guò)低使引物與模板的結(jié)合

位點(diǎn)增加，故可通過(guò)提高復(fù)性的溫度來(lái)減少非特異性條帶的產(chǎn)生，D正確。12342.[2022遼寧]抗蟲(chóng)和耐除草劑玉米雙抗12－5是我國(guó)自主研發(fā)的轉(zhuǎn)基因品種。為給監(jiān)

管轉(zhuǎn)基因生物安全提供依據(jù)，采用PCR方法進(jìn)行目的基因監(jiān)測(cè)，反應(yīng)程序如圖所

示。下列敘述正確的是(

B

)A.預(yù)變性過(guò)程可促進(jìn)模板DNA邊解旋邊復(fù)制B.后延伸過(guò)程可使目的基因的擴(kuò)增更加充分C.延伸過(guò)程無(wú)需引物參與即可完成半保留復(fù)制D.轉(zhuǎn)基因品種經(jīng)檢測(cè)含有目的基因后即可上市B1234[解析]預(yù)變性的溫度為94℃，在這個(gè)溫度下，雙鏈DNA解旋為單鏈，但模板鏈不

易和引物結(jié)合，不能進(jìn)行復(fù)制，A錯(cuò)誤。延伸的目的是合成新的子鏈，后延伸延長(zhǎng)

了延伸時(shí)間，使目的基因的擴(kuò)增更加充分，B正確。延伸過(guò)程需要引物與模板鏈結(jié)

合，在引物的3'端加上相應(yīng)的核苷酸，C錯(cuò)誤。轉(zhuǎn)基因品種經(jīng)檢測(cè)含有目的基因且已

經(jīng)表達(dá)使生物體表現(xiàn)出相應(yīng)性狀后，還需要經(jīng)過(guò)系列的安全性評(píng)價(jià)，符合相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)

后才能上市，D錯(cuò)誤。1234命題點(diǎn)2

基因工程的基本操作程序分析3.[2023全國(guó)乙節(jié)選，10分]GFP是水母體內(nèi)存在的能發(fā)綠色熒光的一種蛋白?？蒲?/p>

人員以

GFP

基因?yàn)椴牧?，利用基因工程技術(shù)獲得了能發(fā)其他顏色熒光的蛋白，豐富

了熒光蛋白的顏色種類?；卮鹣铝袉?wèn)題。(1)構(gòu)建突變基因文庫(kù)?？蒲腥藛T將

GFP

基因的不同突變基因分別插入載體，并轉(zhuǎn)入

大腸桿菌制備出

GFP

基因的突變基因文庫(kù)。1234(2)構(gòu)建目的基因表達(dá)載體。科研人員從構(gòu)建的

GFP

突變基因文庫(kù)中提取目的基因

(均為突變基因)構(gòu)建表達(dá)載體，其模式圖如圖所示(箭頭為

GFP

突變基因的轉(zhuǎn)錄方

向)。圖中①為

；②為

，其作用是

?

?。終止子啟動(dòng)子被RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)

合，驅(qū)動(dòng)

GFP

突變基因的轉(zhuǎn)錄[解析]

一個(gè)基因表達(dá)載體的組成，除了目的基因，還必須有啟動(dòng)子、終止子以及標(biāo)記基因等。啟動(dòng)子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終表達(dá)出人類需要的蛋白質(zhì)。終止子相當(dāng)于一盞紅色信號(hào)燈，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來(lái)，位于基因的下游，也是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段。1234(3)目的基因的表達(dá)。科研人員將構(gòu)建好的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)

大腸桿菌有的發(fā)綠色熒光，有的發(fā)黃色熒光，有的不發(fā)熒光。請(qǐng)從密碼子特點(diǎn)的角

度分析，發(fā)綠色熒光的可能原因是

?

(答出1點(diǎn)即可)。密碼子的簡(jiǎn)并使

GFP

基因突變后編碼的蛋白質(zhì)

與突變前相同[解析]

結(jié)合題中信息可知，將構(gòu)建好的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)有的大腸桿菌發(fā)綠色熒光，即GFP蛋白的熒光顏色，推測(cè)發(fā)綠色熒光的可能原因是密碼子的簡(jiǎn)并使

GFP

基因突變后編碼的蛋白質(zhì)與突變前的相同。1234[解析]

基因工程的基本操作程序包括：①目的基因的篩選與獲取；②基因表達(dá)載體的構(gòu)建；③將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞；④目的基因的檢測(cè)與鑒定。欲通過(guò)基因工程的方法探究

YFP

基因能否在真核細(xì)胞中表達(dá)，可通過(guò)基因工程的方法將目的基因?qū)虢湍妇髾z測(cè)酵母菌是否發(fā)黃色熒光，如果發(fā)黃色熒光，則可證明

YFP

基因能在真核細(xì)胞中表達(dá)，否則，不能證明

YFP

基因能在真核細(xì)胞中表達(dá)。(4)新蛋白與突變基因的關(guān)聯(lián)性分析。將上述發(fā)黃色熒光的大腸桿菌分離純化后，對(duì)

其所含的

GFP

突變基因進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其堿基序列與

GFP

基因的不同，將該

GFP

突變基因命名為

YFP

基因(黃色熒光蛋白基因)。若要通過(guò)基因工程的方法探究

YFP

基因能否在真核細(xì)胞中表達(dá)，實(shí)驗(yàn)思路是

?

?

?。選擇合適的運(yùn)載體，利用合適的限制酶

和DNA連接酶將

YFP

基因和運(yùn)載體連接起來(lái)，構(gòu)建基因表達(dá)載體，之后將基因表達(dá)

載體導(dǎo)入酵母菌，檢測(cè)酵母菌是否會(huì)發(fā)黃色熒光12344.[2021福建節(jié)選，10分]微生物吸附是重金屬?gòu)U水的處理方法之一。金屬硫蛋白

(MT)是一類廣泛存在于動(dòng)植物中的金屬結(jié)合蛋白，具有吸附重金屬的作用?？蒲腥?/p>

員將棗樹(shù)的

MT

基因?qū)氪竽c桿菌構(gòu)建工程菌?；卮鹣铝袉?wèn)題：(1)根據(jù)棗樹(shù)的

MTcDNA的核苷酸序列設(shè)計(jì)了相應(yīng)的引物(圖中甲)，通過(guò)PCR擴(kuò)增

MT

基因。已知A位點(diǎn)和B位點(diǎn)分別是起始密碼子和終止密碼子對(duì)應(yīng)的基因位置。選

用的引物組合應(yīng)為

?。引物1和引物4

1234[解析]據(jù)題中信息知，A位點(diǎn)和B位點(diǎn)分別是起始密碼子和終止密碼子對(duì)應(yīng)的基

因位置，若要通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增

MT

基因，應(yīng)選用引物1和引物4。1234(2)本實(shí)驗(yàn)中，PCR所用的DNA聚合酶擴(kuò)增出的

MT

基因的末端為平末端。由于載體

E只有能產(chǎn)生黏性末端的酶切位點(diǎn)，需借助中間載體P將

MT

基因接入載體E。載體P

和載體E的酶切位點(diǎn)及相應(yīng)的酶切序列如圖中乙所示。①選用

酶將載體P切開(kāi)，再用

(填“T4DNA”或“

E

.

coli

DNA”)連接酶將

MT

基因與載體P相連，構(gòu)成重組載體P'。②載體P'不具有表達(dá)

MT

基因的

和

。選用

?

酶組合對(duì)載體P'和載體E進(jìn)行酶切，將切下的

MT

基因和載體E用DNA連接酶進(jìn)行連

接，將得到的混合物導(dǎo)入用

離子處理的大腸桿菌，篩出MT工程菌。Eco

R

Ⅴ

T4

DNA

啟動(dòng)子終止子X(jué)ho

Ⅰ和

Pst

Ⅰ

鈣1234[解析]

①通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增出的

MT

基因的末端為平末端，載體P中有限制酶

Xho

Ⅰ、

Eco

RⅤ、

Pst

Ⅰ、

Sma

Ⅰ的酶切位點(diǎn)，用限制酶

Xho

Ⅰ、

Pst

Ⅰ切割載體P得到的均為黏性末端，而用限制酶

Eco

RⅤ和

Sma

Ⅰ切割載體P得到的均是平末端，但不能用限制酶

Sma

Ⅰ進(jìn)行酶切，若用限制酶

Sma

Ⅰ進(jìn)行酶切，無(wú)法將目的基因插入載體E中，因此，應(yīng)選用

Eco

RⅤ酶將載體P切開(kāi)，再用能連接平末端的T4DNA連接酶將

MT

基因與載體P相連，構(gòu)成重組載體P'。②載體P'不具有表達(dá)

MT

基因的啟動(dòng)子和終止子。再選用

Xho

Ⅰ和

Pst

Ⅰ酶組合對(duì)載體P'和載體E進(jìn)行酶切，將切下的

MT

基因和載體E用DNA連接酶進(jìn)行連接，將得到的混合物導(dǎo)入用鈣離子處理的大腸桿菌中，篩出MT工程菌。1234考點(diǎn)3

DNA的粗提取與鑒定及DNA片段的擴(kuò)增與鑒定

1.DNA的粗提取與鑒定不溶于2mol/L二苯胺研磨上清液95%5min2.DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定(1)原理熱變性可解離的基團(tuán)正電荷或負(fù)電荷相反300nm(2)方法步驟電泳緩沖液凝膠載樣紫外燈

基礎(chǔ)自測(cè)1.進(jìn)行“DNA的粗提取”實(shí)驗(yàn)時(shí)，為獲得較好的提取效果，應(yīng)離心2次，第一次離

心后應(yīng)保留上清液，第二次離心后應(yīng)棄去上清液，且兩次離心的轉(zhuǎn)速也不相同。

(

√

)2.

TaqDNA聚合酶是用PCR儀對(duì)DNA分子擴(kuò)增過(guò)程中常用的一種耐高溫的DNA聚合

酶。

(

√

)3.PCR中離心的目的是讓反應(yīng)組分在離心管中分層分布。

(

×

)√√×4.電泳鑒定PCR產(chǎn)物時(shí)，應(yīng)在每個(gè)加樣孔中加入等量的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液

的混合液。

(

×

)5.粗提取的DNA溶于2mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺試劑后顯藍(lán)色[2023江蘇，

T9D]。

(

×

)6.過(guò)濾液沉淀過(guò)程在4℃冰箱中進(jìn)行是為了防止DNA降解[2022山東，T13A]。

(

√

)××√深度思考1.能否選擇哺乳動(dòng)物的成熟紅細(xì)胞作為DNA粗提取的實(shí)驗(yàn)材料，為什么？2.DNA的電泳鑒定實(shí)驗(yàn)中，影響DNA分子遷移速率的因素有哪些？提示不能。因?yàn)椴溉閯?dòng)物成熟的紅細(xì)胞中沒(méi)有細(xì)胞核和線粒體等，不含DNA。提示影響DNA分子遷移速率的因素有凝膠濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等。

命題點(diǎn)1

DNA的粗提取與鑒定1.[2023廣東改編]“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的基本過(guò)程是：裂解→分離→沉淀→

鑒定。下列敘述錯(cuò)誤的是(

D

)A.裂解：使細(xì)胞破裂釋放出DNA等物質(zhì)B.分離：可去除混合物中的部分多糖、蛋白質(zhì)等C.沉淀：可反復(fù)多次以提高DNA的純度D.鑒定：加入二苯胺試劑后即呈現(xiàn)藍(lán)色D12[解析]“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的基本過(guò)程是：裂解、分離、沉淀、鑒定。裂

解的目的是使細(xì)胞破裂，釋放出DNA等物質(zhì)，A正確。DNA不溶于酒精，但某些蛋

白質(zhì)溶于酒精，利用這一原理，可以初步分離DNA與蛋白質(zhì)等，分離過(guò)程中混合物

中的部分多糖、蛋白質(zhì)等可被去除，B正確。DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度

不同，通過(guò)控制NaCl溶液的濃度可去除雜質(zhì)，反復(fù)多次以提高DNA的純度，C正

確。進(jìn)行DNA鑒定時(shí)可以使用二苯胺試劑，但要進(jìn)行沸水浴加熱后才能觀察到顏色

變化，D錯(cuò)誤。12命題點(diǎn)2

DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定2.[2023浙江6月]某研究小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將綠色熒光蛋白基因(

GFP

)整合到野

生型小鼠Gata3基因一端，如圖甲所示。實(shí)驗(yàn)得到能正常表達(dá)兩種蛋白質(zhì)的雜合子

雌雄小鼠各1只，交配以期獲得Gata3－

GFP

基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的

4只新生小鼠的基因型，設(shè)計(jì)了引物1和引物2用于PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖

乙所示。圖甲圖乙12下列敘述正確的是(

B

)A.

G

ata3基因的啟動(dòng)子無(wú)法控制

GFP

基因表達(dá)B.翻譯時(shí)先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白C.2號(hào)條帶的小鼠是野生型，4號(hào)條帶的小鼠是

G

ata3－

GFP

基因純合子D.若用引物1和引物3進(jìn)行PCR，能更好地區(qū)分雜合子和純合子B12[解析]由圖甲可知，Gata3基因與

GFP

基因共用一個(gè)啟動(dòng)子，且由題干可知兩基因

能正常表達(dá)出相關(guān)蛋白質(zhì)，A錯(cuò)誤；由于啟動(dòng)子在左側(cè)，基因在右側(cè)，轉(zhuǎn)錄基因

時(shí)，先轉(zhuǎn)錄Gata3基因，再轉(zhuǎn)錄

GFP

基因，且翻譯的方向是沿mRNA從5'→3'，因此

翻譯時(shí)先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正確；由圖乙可知，大片段包含

GFP

基因編碼區(qū)片段，小片段不包含

GFP

基因編碼區(qū)片段，則2號(hào)小鼠是Gata3－

GFP

基因純合子，4號(hào)小鼠是野生型，C錯(cuò)誤；若用引物1和引物3進(jìn)行PCR，雜合子和

Gata3－

GFP

基因純合子均能擴(kuò)增出條帶，僅有Gata3基因時(shí)無(wú)法擴(kuò)增出條帶，不利

于區(qū)分雜合子和純合子，D錯(cuò)誤。12

1.[2023遼寧]CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受體。為實(shí)時(shí)監(jiān)控CD163蛋白的

表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，將紅色熒光蛋白

RFP

基因與CD163基因拼接在一起(如下圖)，使

其表達(dá)成一條多肽。該拼接過(guò)程的關(guān)鍵步驟是除去(

B

)A.

CD

163基因中編碼起始密碼子的序列B.

CD

163基因中編碼終止密碼子的序列C.

RFP

基因中編碼起始密碼子的序列D.

RFP

基因中編碼終止密碼子的序列B123456[解析]由題意可知，若想使紅色熒光蛋白

RFP

基因與CD163基因拼接在一起，使

其表達(dá)成一條多肽，則CD163基因和紅色熒光蛋白

RFP

基因都需進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，

再結(jié)合圖示可知，CD163基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA中不能出現(xiàn)終止密碼子，否則在翻

譯時(shí)會(huì)提前終止，無(wú)法表達(dá)出既含CD163蛋白又含紅色熒光蛋白R(shí)FP的一整條多

肽，因此該拼接過(guò)程的關(guān)鍵步驟是除去CD163基因中編碼終止密碼子的序列，B符

合題意，A、C、D不符合題意。1234562.[2023湖北]用氨芐青霉素抗性基因(

Amp

R)、四環(huán)素抗性基因(

Tet

R)作為標(biāo)記基因

構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，

構(gòu)建基因表達(dá)載體(重組質(zhì)粒)，并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是(

D

)A.若用

Hin

dⅢ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同B.若用

P

ν

u

Ⅰ酶切，在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定

含有目的基因C.若用

Sph

Ⅰ酶切，可通過(guò)DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)

建成功與否D.若用

Sph

Ⅰ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉

素)和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落D123456[解析]若用

Hin

dⅢ酶切質(zhì)粒和含有目的基因的DNA片段，用DNA連接酶將兩者

連接成重組質(zhì)粒，目的基因和質(zhì)粒有正向連接和反向連接兩種連接形式，因此，目

的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同，A正確；若用

Pvu

Ⅰ酶切，會(huì)破壞氨芐青霉素抗性基

因，在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落可能是由含有目的基因的重組質(zhì)粒形成的，也

可能是由質(zhì)粒自身連接的產(chǎn)物形成的，因此，在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不

一定含有目的基因，B正確；若用

Sph

Ⅰ酶切，由于重組質(zhì)粒和普通質(zhì)粒的堿基對(duì)數(shù)

不同，因此可通過(guò)DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否，C正確；若用

Sph

Ⅰ酶切，會(huì)破壞四環(huán)素抗性基因，氨芐青霉素抗性基因不受影響，因此攜帶目的

基因的受體菌能在含Amp(氨芐青霉素)的培養(yǎng)基中形成菌落，不能在含Tet(四環(huán)素)

的培養(yǎng)基中形成菌落，D錯(cuò)誤。1234563.[2021山東]粗提取DNA時(shí)，向雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌，過(guò)濾后

所得濾液進(jìn)行下列處理后再進(jìn)行過(guò)濾，在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出

DNA相對(duì)含量較高的白色絲狀物的處理方式是(

A

)A.加入適量的木瓜蛋白酶B.37～40℃的水浴箱中保溫10～15分鐘C.加入與濾液體積相等的、體積分?jǐn)?shù)為95％的冷卻的酒精D.加入NaCl調(diào)節(jié)濃度至2mol/L→過(guò)濾→調(diào)節(jié)濾液中NaCl濃度至0.14mol/LA123456[解析]

木瓜蛋白酶能夠分解蛋白質(zhì)，故在得到的濾液中加入適量的木瓜蛋白酶后

容易提取出DNA相對(duì)含量較高的白色絲狀物，A符合題意。將制備的含有DNA的濾

液放入60～75℃的水浴箱中保溫10～15分鐘，利用DNA和蛋白質(zhì)對(duì)高溫的耐受性不

同，使蛋白質(zhì)變性，從而更好地與DNA分離，B不符合題意。DNA不溶于體積分?jǐn)?shù)

為95％的冷卻的酒精，因此向含有DNA的濾液中加入與濾液體積相等的、體積分?jǐn)?shù)

為95％的冷卻的酒精后DNA會(huì)析出，C不符合題意。DNA在0.14mol/L的NaCl溶液

中的溶解度最低，因此將含DNA的NaCl溶液調(diào)至0.14mol/L，濾液中幾乎不含

DNA，D不符合題意。1234564.[2023山東，10分]科研人員構(gòu)建了可表達(dá)J－V5融合蛋白的重組質(zhì)粒并進(jìn)行了檢

測(cè)，該質(zhì)粒的部分結(jié)構(gòu)如圖甲所示。其中V5編碼序列表達(dá)標(biāo)簽短肽V5。123456(1)與圖甲中啟動(dòng)子結(jié)合的酶是

?。除圖甲中標(biāo)出的結(jié)構(gòu)外，作為載

體，質(zhì)粒還需具備的結(jié)構(gòu)有

(答出2個(gè)結(jié)構(gòu)即可)。RNA聚合酶標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)[解析]啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，能夠驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄?；虮磉_(dá)

載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)等。(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒后，為了確定

J

基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，需進(jìn)行PCR檢

測(cè)，若僅用一對(duì)引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物

。已知

J

基因轉(zhuǎn)

錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物F1與圖甲中

J

基因的

(填“a鏈”或“b

鏈”)相應(yīng)部分的序列相同。F2和R1(或F1和R2)

a鏈123456[解析]

如果引物的結(jié)合位點(diǎn)全部位于目的基因上，則無(wú)論目的基因插入的方向如何，均可通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，因此若通過(guò)PCR檢測(cè)目的基因是否正確插入，所選的一對(duì)引物中的一個(gè)必須與目的基因結(jié)合，另一個(gè)必須在目的基因外側(cè)，這2個(gè)引物方向相反并且均指向目的基因。由以上分析可知，若要確定

J

基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，則可利用圖甲中引物F2和R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增。若

J

基因沒(méi)有連接到質(zhì)粒中，則引物R1沒(méi)有結(jié)合部位，擴(kuò)增不出

J

基因；若

J

基因連接到質(zhì)粒中但反向插入，則利用圖甲中引物F2和R1擴(kuò)增不出

J

基因。同理可知，還可選擇圖甲中引物F1和R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以確定

J

基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確。轉(zhuǎn)錄時(shí)mRNA的合成方向?yàn)?'→3'，又知

J

基因轉(zhuǎn)錄的模板鏈位于b鏈，所以b鏈左側(cè)是3'端，右側(cè)是5'端。PCR擴(kuò)增時(shí)引物F1與模板鏈3'端的堿基進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，所以引物F1與圖甲中

J

基因的b鏈左側(cè)相應(yīng)部分的序列互補(bǔ)，與a鏈相應(yīng)部分的序列相同。123456(3)重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測(cè)相應(yīng)蛋

白是否表達(dá)以及表達(dá)水平，結(jié)果如圖乙所示。其中，出現(xiàn)條帶1證明細(xì)胞內(nèi)表達(dá)

了

，條帶2所檢出的蛋白

(填“是”或“不是”)由重組

質(zhì)粒上的

J

基因表達(dá)的。J－V5融合蛋白不是[解析]

重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測(cè)相應(yīng)蛋白是否表達(dá)以及表達(dá)水平。分析題圖乙可知，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體檢測(cè)后，均有條帶1，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)表達(dá)了J－V5融合蛋白。用抗J蛋白抗體檢測(cè)后，出現(xiàn)條帶2，而用抗V5抗體檢測(cè)后，沒(méi)有出現(xiàn)條帶2，說(shuō)明條帶2所檢出的蛋白不是由重組質(zhì)粒上的

J

基因表達(dá)的。1234565.[2023江蘇，12分]為了將某納米抗體和綠色熒光蛋白基因融合表達(dá)，運(yùn)用重組酶

技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒，如圖1所示。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：(1)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增片段F1與片段F2時(shí)，配制的兩個(gè)反應(yīng)體系中不同的有

?

，擴(kuò)增程序中最主要的不同是

?。模板、

引物延伸時(shí)間[解析]進(jìn)行PCR反應(yīng)所需的條件：引物、酶、dNTP、模板和緩沖液(一般要添加

Mg2＋)。分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增片段F1與片段F2時(shí)，配制的兩個(gè)反應(yīng)體系中不同的有模

板、引物。擴(kuò)增程序中最主要的不同是延伸的時(shí)間。123456(2)有關(guān)基因序列如圖2。引物F2－F、F1－R應(yīng)在下列選項(xiàng)中選用

?。A.ATGGTG……CAACCAB.TGGTTG……CACCATC.GACGAG……CTGCAGD.CTGCAG……CTCGTCCD

[解析]由圖1可知，引物F2－F用于擴(kuò)增F2片段(AnB1)，引物F1－R用于擴(kuò)增F1片段(EGFP)。C選項(xiàng)中5'－CTGCAG－3'能與AnB1中左側(cè)部分序列進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，因此引物F2－F選用C。D選項(xiàng)中5'－CTCGTC－3'能與EGFP中右側(cè)部分序列進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，因此引物F1－R選用D。123456(3)將PCR產(chǎn)物片段與線性質(zhì)粒載體混合后，在重組酶作用下可形成環(huán)化質(zhì)粒，直接

用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌。這一過(guò)程與傳統(tǒng)重組質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程相比，無(wú)需使用的酶主要有

?

?。限

制酶、DNA連接酶[解析]

傳統(tǒng)重組質(zhì)粒構(gòu)建時(shí)，會(huì)用一定的限制酶切割載體，使它出現(xiàn)一個(gè)切口，然

后用同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，再利用

DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體的切口處。將PCR產(chǎn)物片段與線性質(zhì)粒載體混合后，在重組酶作用下可形成環(huán)化質(zhì)粒，該過(guò)程不需要使用限制酶、DNA連接酶。123456(4)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，下列敘述錯(cuò)誤的

有

?。A.稀釋涂布平板需控制每個(gè)平板30～300個(gè)菌落B.抗性平板上未長(zhǎng)出菌落的原因一般是培養(yǎng)基溫度太高C.抗性平板上常常會(huì)出現(xiàn)大量雜菌形成的菌落D.抗性平板上長(zhǎng)出的單菌落無(wú)需進(jìn)一步劃線純化ABC

123456[解析]

用稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)時(shí)，為了使結(jié)果更準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)為30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，稀釋涂布平板不需要控制每個(gè)平板的菌落數(shù)，A錯(cuò)誤；抗性平板上未長(zhǎng)出菌落的原因可能是轉(zhuǎn)化失敗或涂布器溫度過(guò)高，一般不是培養(yǎng)基溫度太高，B錯(cuò)誤；轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，一般含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌才能生長(zhǎng)，故抗性平板上不會(huì)出現(xiàn)大量雜菌形成的菌落，C錯(cuò)誤；稀釋涂布平板法和平板劃線法均為分離純化微生物的方法，用稀釋涂布平板法在抗性平板上接種后，長(zhǎng)出的單菌落無(wú)需進(jìn)一步劃線純化，D正確。123456(5)為了驗(yàn)證平板上菌落中的質(zhì)粒是否符合設(shè)計(jì)，用不同菌落的質(zhì)粒為模板，用引物

F1－F和F2－R進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，質(zhì)粒P1～P4的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖3。根據(jù)圖中

結(jié)果判斷，可以舍棄的質(zhì)粒有

?。P3、P4

[解析]

EGFP的長(zhǎng)度為720bp，AnB1的長(zhǎng)度為390bp，二者的總長(zhǎng)為720＋390＝1100(bp)，用不同菌落的質(zhì)粒為模板，用引物F1－F和F2－R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若質(zhì)粒符合設(shè)計(jì)，則用引物F1－F和F2－R應(yīng)擴(kuò)增出長(zhǎng)度為1100bp的片段，根據(jù)圖中結(jié)果判斷，可以舍棄的質(zhì)粒有P3、P4。123456(6)對(duì)于PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果符合預(yù)期的質(zhì)粒，通常需進(jìn)一步通過(guò)基因測(cè)序確認(rèn)，原因

是

?。電泳僅能檢測(cè)DNA分子的大小，無(wú)法確定DNA分子的堿基序列是否正確[解析]電泳僅能檢測(cè)DNA分子的大小，無(wú)法確定DNA分子的堿基序列是否正確，因此對(duì)于PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果符合預(yù)期的質(zhì)粒，通常需進(jìn)一步通過(guò)基因測(cè)序確認(rèn)。1234566.[2022遼寧節(jié)選，4分]某抗膜蛋白治療性抗體藥物研發(fā)過(guò)程中，需要表達(dá)N蛋白胞

外段，制備相應(yīng)的單克隆抗體，增加其對(duì)N蛋白胞外段特異性結(jié)合的能力。Ⅰ.N蛋白

胞外段抗原制備，流程如圖。(1)構(gòu)建重組慢病毒質(zhì)粒時(shí)，選用氨芐青霉素抗性基因作為標(biāo)記基因，目的是

?

?。用脂質(zhì)體將重組慢病毒質(zhì)粒與

輔助質(zhì)粒導(dǎo)入病毒包裝細(xì)胞，質(zhì)粒被包在脂質(zhì)體

(填“雙分子層中”

或“兩層磷脂分子之間”)。篩選

出含目的基因(N蛋白胞外段基因)的病毒包裝細(xì)胞雙分子層中123456[解析]

構(gòu)建重組慢病毒質(zhì)粒時(shí)，選用氨芐青霉素抗性基因作為標(biāo)記基因，將病毒包裝細(xì)胞置于含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，就可以將含有目的基因(N蛋白胞外段基因)的病毒包裝細(xì)胞篩選出來(lái)。用脂質(zhì)體將重組慢病毒質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒導(dǎo)入病毒包裝細(xì)胞，質(zhì)粒被包在脂質(zhì)體的雙分子層中。123456(2)質(zhì)粒在包裝細(xì)胞內(nèi)組裝出由

?

組成的慢病毒，用慢病毒感染海拉細(xì)胞進(jìn)而表達(dá)并分離、純化N蛋白胞

外段。[解析]

質(zhì)粒在包裝細(xì)胞內(nèi)組裝出由N蛋白胞外段基因重組慢病毒質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒和蛋白質(zhì)外殼組成的慢病毒，用慢病毒感染海拉細(xì)胞進(jìn)而表達(dá)并分離、純化N蛋白胞外段。N蛋白胞外段基因重組慢病毒質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒和蛋

白質(zhì)外殼123456

一、選擇題1.[2024哈爾濱九中模擬]限制酶和DNA連接酶是基因工程的工具酶，以下說(shuō)法正確

的是(

A

)A.限制酶只能切割雙鏈DNA片段，不能切割煙草花葉病毒的核酸B.DNA連接酶能將單個(gè)核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯鍵C.

E

.

coli

DNA連接酶既能連接黏性末端，也能連接平末端D.限制酶主要從原核生物中分離純化而來(lái)，所以也能剪切自身的DNAA1234567891011121314151617[解析]限制酶只能切割DNA分子，煙草花葉病毒的核酸是RNA，不能切割，A正

確；DNA連接酶連接的是兩個(gè)DNA片段，B錯(cuò)誤；

E

.

coli

DNA連接酶只能連接黏性

末端，不能連接平末端，C錯(cuò)誤；限制酶主要從原核生物中分離純化而來(lái)，但是因

為原核生物DNA分子中不存在該酶的識(shí)別序列或識(shí)別序列已經(jīng)被修飾，所以不能剪

切自身的DNA，D錯(cuò)誤。12345678910111213141516172.[2024重慶南開(kāi)中學(xué)模擬]常見(jiàn)的啟動(dòng)子可分為三類：組成型啟動(dòng)子，驅(qū)動(dòng)基因在

所有細(xì)胞、組織和器官中持續(xù)表達(dá)；組織特異性啟動(dòng)子，調(diào)控基因只在某些特定的

部位中表達(dá)；誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，通常在光、鹽等信號(hào)作用下，使目的基因的轉(zhuǎn)錄水平

有所提高。下列敘述錯(cuò)誤的是(

B

)A.啟動(dòng)子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的上游B.細(xì)胞分化與組織特異性啟動(dòng)子的調(diào)控有關(guān)，與組成型啟動(dòng)子無(wú)關(guān)C.乳腺生物反應(yīng)器的構(gòu)建需要將組織特異性啟動(dòng)子與目的基因連接D.鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在高鹽環(huán)境中被激活，可增加農(nóng)作物的抗逆性B1234567891011121314151617[解析]啟動(dòng)子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因上游，是RNA聚合酶

識(shí)別和結(jié)合的部位，能夠啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，A正確；根據(jù)題干信息“組成型啟動(dòng)子，驅(qū)動(dòng)

基因在所有細(xì)胞、組織和器官中持續(xù)表達(dá)”可知，細(xì)胞分化與組成型啟動(dòng)子有關(guān)，

B錯(cuò)誤；組織特異性啟動(dòng)子，調(diào)控基因只在某些特定的部位中表達(dá)，據(jù)此推知，乳

腺生物反應(yīng)器的構(gòu)建需要將組織特異性啟動(dòng)子與目的基因連接，保證目的基因在乳

腺細(xì)胞中表達(dá)，C正確；根據(jù)題干信息“誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，通常在光、鹽等信號(hào)作用

下，使目的基因的轉(zhuǎn)錄水平有所提高”可知，鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在高鹽環(huán)境中被激

活，可增加農(nóng)作物的抗逆性，D正確。12345678910111213141516173.[2023武漢武昌區(qū)質(zhì)檢]關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)，下列敘述正確的是

(

B

)A.實(shí)驗(yàn)中用95％的酒精預(yù)冷后可以更好地溶解DNAB.將粗提物溶于NaCl后，加入二苯胺試劑，混合均勻后，沸水浴鑒定C.將研磨液加入切碎的洋蔥，充分研磨后過(guò)濾，棄去上清液D.還可選用新鮮菜花、香蕉或豬肝、豬血等作為本實(shí)驗(yàn)的材料B1234567891011121314151617[解析]

DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精，利用這一原理，可初步將DNA

與蛋白質(zhì)分離，A錯(cuò)誤；鑒定DNA時(shí)，將粗提物溶于NaCl，并與二苯胺試劑混合后

進(jìn)行沸水浴，觀察顏色變化，B正確；將研磨液加入切碎的洋蔥，充分研磨后過(guò)

濾，棄去沉淀物，收集上清液，C錯(cuò)誤；哺乳動(dòng)物成熟紅細(xì)胞中沒(méi)有細(xì)胞核和細(xì)胞

器，因此豬血不可用于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)，D錯(cuò)誤。12345678910111213141516174.[2024福州一測(cè)]下列關(guān)于凝膠電泳實(shí)驗(yàn)操作，敘述錯(cuò)誤的是(

B

)A.加樣孔應(yīng)靠近負(fù)極端，以便帶負(fù)電的DNA分子向正極移動(dòng)B.接通電源后電泳一段時(shí)間，離加樣孔越近的DNA分子越小C.紫外燈照射下，凝膠上條帶的熒光強(qiáng)度與DNA含量呈正相關(guān)D.通過(guò)觀察指示劑在凝膠中遷移的位置來(lái)判斷何時(shí)停止電泳B1234567891011121314151617[解析]脫氧核苷酸是組成DNA分子的單體，其中的磷酸基團(tuán)能解離出氫離子，使

DNA分子帶負(fù)電，加樣孔靠近負(fù)極端，有利于DNA分子向正極移動(dòng)，A正確。在凝

膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)，DNA分

子越小，其在凝膠中的遷移速率越快，電泳一段時(shí)間后，離加樣孔越遠(yuǎn)，B錯(cuò)誤。

DNA含量越高，在紫外燈照射下，凝膠上條帶的熒光強(qiáng)度就越強(qiáng)，C正確。待指示

劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳，D正確。12345678910111213141516175.[2023北京東城區(qū)二模]下列關(guān)于PCR技術(shù)的敘述，正確的是(

B

)A.PCR反應(yīng)體系中需要添加耐高溫的解旋酶和DNA聚合酶B.PCR過(guò)程中在引物的3'端添加脫氧核苷酸實(shí)現(xiàn)子鏈延伸C.利用PCR對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)需要基因序列全部已知D.在設(shè)計(jì)兩種引物時(shí)，需要讓引物和引物之間的堿基序列互補(bǔ)[解析]

PCR反應(yīng)體系中需要添加耐高溫的DNA聚合酶，不需要添加解旋酶，A錯(cuò)

誤；合成子鏈時(shí)，引物先與模板鏈配對(duì)結(jié)合，然后在引物的3'端進(jìn)行子鏈延伸，B正

確；利用PCR對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，知道目的基因兩端的一小段序列即可，C錯(cuò)

誤；在設(shè)計(jì)兩種引物時(shí)，兩種引物之間的堿基序列不能互補(bǔ)配對(duì)，D錯(cuò)誤。B12345678910111213141516176.[2024浙江大聯(lián)考]用氨芐青霉素抗性基因(

Amp

R)、四環(huán)素抗性基因(

Tet

R)作為標(biāo)

記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶切割后的

質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體(重組質(zhì)粒)，并導(dǎo)入受體菌中。根據(jù)題目所提供的信息，

下列敘述正確的是(

A

)A.質(zhì)粒用限制酶

Hin

dⅢ切割后含有2個(gè)游離的磷酸基團(tuán)B.若用限制酶

Hin

dⅢ和

Sca

Ⅰ切割，一定可防止目的基因與質(zhì)

粒的反向連接C.若用限制酶

Pvu

Ⅰ切割，在含四環(huán)素培養(yǎng)基中形成的菌落，一

定含有目的基因D.若用限制酶

Sph

Ⅰ切割，篩選時(shí)應(yīng)先將轉(zhuǎn)化處理的菌液涂布到

含四環(huán)素的培養(yǎng)基中，待長(zhǎng)成菌落，再影印接種到含氨芐青

霉素的培養(yǎng)基中A1234567891011121314151617[解析]題圖質(zhì)粒中限制酶

Hin

dⅢ的切割位點(diǎn)有1個(gè)，用該限制酶切割質(zhì)粒，獲得1

個(gè)DNA片段，其含有2個(gè)游離的磷酸基團(tuán)，A正確。由于題圖質(zhì)粒中限制酶

Sca

Ⅰ的

切割位點(diǎn)有兩個(gè)，若用限制酶

Hin

dⅢ和

Sca

Ⅰ進(jìn)行切割，不一定能防止目的基因和質(zhì)

粒的反向連接，B錯(cuò)誤。由題圖可知，氨芐青霉素抗性基因中含有限制酶

Pvu

Ⅰ的切

割位點(diǎn)，若用限制酶

Pvu

Ⅰ切割質(zhì)粒，則氨芐青霉素抗性基因會(huì)被破壞，而四環(huán)素抗

性基因正常，在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中，導(dǎo)入重組質(zhì)粒(含目的基因)或空質(zhì)粒的受

體菌均能形成菌落，C錯(cuò)誤。由題圖可知，四環(huán)素抗性基因中含有限制酶

Sph

Ⅰ的切割位點(diǎn)，若用限制酶

Sph

Ⅰ切割質(zhì)粒，則會(huì)破壞四環(huán)素抗性基因，而氨芐青霉素抗性基因正常，進(jìn)行篩選時(shí)，可先將轉(zhuǎn)化處理的菌液涂布到含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中，待長(zhǎng)成菌落(導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體菌和導(dǎo)入空質(zhì)粒的受體菌都能在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中形成菌落)，再影印接種到含四環(huán)素的培養(yǎng)基中，在含四環(huán)素的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)的受體菌即為導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體菌，D錯(cuò)誤。12345678910111213141516177.楊樹(shù)被根瘤農(nóng)桿菌感染后會(huì)長(zhǎng)出瘤狀物，稱為冠癭瘤。冠癭瘤內(nèi)的冠癭堿是一種

含氮有機(jī)物，這種有機(jī)物是根瘤農(nóng)桿菌生存所需的碳源和氮源。冠癭瘤的形成是由

于根瘤農(nóng)桿菌攜帶天然的Ti質(zhì)粒，該質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)如圖所示。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是

(

C

)A.Ti質(zhì)粒上的生長(zhǎng)素基因可在楊樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用B.Ti質(zhì)粒上的T－DNA區(qū)域至少含有一個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)C.冠癭堿合成基因在根瘤農(nóng)桿菌細(xì)胞中表達(dá)并分泌到細(xì)胞外D.根瘤農(nóng)桿菌內(nèi)Ti質(zhì)粒的存在決定了其感染植物的范圍C1234567891011121314151617[解析]

Ti質(zhì)粒上的生長(zhǎng)素基因可隨T－DNA整合到楊樹(shù)細(xì)胞的染色體DNA上，并進(jìn)

行表達(dá)，故Ti質(zhì)粒上的生長(zhǎng)素基因可在楊樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用，A正確；Ti質(zhì)

粒上的T－DNA區(qū)域至少含有一個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，以便插入目的基因，B正確；

冠癭堿合成基因會(huì)隨T－DNA整合到楊樹(shù)細(xì)胞的染色體DNA上，并在楊樹(shù)細(xì)胞中表

達(dá)，C錯(cuò)誤；根瘤農(nóng)桿菌內(nèi)Ti質(zhì)粒的存在決定了其能感染雙子葉植物和裸子植物，

而對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力，D正確。1234567891011121314151617二、非選擇題8.[寫(xiě)出實(shí)驗(yàn)思路/2024貴陽(yáng)模擬，12分]研究發(fā)現(xiàn)作物M的品系甲有抗蟲(chóng)等多種優(yōu)良

性狀，但甜度不高。為了改良品系甲，增加其甜度，育種工作者做了如下實(shí)驗(yàn)：從

品系乙中提取與甜度有關(guān)的S基因，通過(guò)基因重組技術(shù)，以Ti質(zhì)粒為載體，以品系甲

的葉片細(xì)胞為受體細(xì)胞，培育出轉(zhuǎn)S基因的新品系?；卮鹣铝袉?wèn)題。(1)利用PCR技術(shù)從品系乙的基因組中獲取S基因時(shí)，需要在一定的緩沖液中進(jìn)行，

除需提供引物、原料外，還需提供的物質(zhì)有

?，

用于獲取S基因的引物需滿足的條件是

?

，在利用PCR技術(shù)獲取目的基因的過(guò)程中，4種脫氧核苷酸加在引物

的

(填“3'”或“5'”)端。耐高溫的DNA聚合酶、DNA模板能與S基因母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)、

短單鏈核酸3'

1234567891011121314151617[解析]利用PCR技術(shù)擴(kuò)增S基因時(shí)，需要有引物、4種脫氧核苷酸(原料)、耐高溫

的DNA聚合酶(

Taq

酶)、DNA模板等。用于獲取S基因的引物需滿足的條件是能與S基因母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)、短單鏈核酸。PCR擴(kuò)增的原理是DNA雙鏈復(fù)

制，PCR過(guò)程中，4種脫氧核苷酸加在引物的3'端。1234567891011121314151617(2)如圖是S基因和載體上的限制酶的酶切位點(diǎn)。為了成功構(gòu)建基因表達(dá)載體，確保

目的基因插入載體的方向正確，最好選用限制酶

切割S基因

和載體；由圖可知，構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，S基因須插在T－DNA上，T－DNA的作

用是

?。Xba

Ⅰ、

Hin

d

Ⅲ

將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上1234567891011121314151617[解析]

據(jù)圖分析，S基因上含有限制酶

Bam

HⅠ的酶切位點(diǎn)，而限制酶

Sal

Ⅰ的酶切位點(diǎn)在T－DNA以外的區(qū)域，因此在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，以上兩種限制酶均不能用。S基因上下游均有限制酶

Eco

RⅠ的酶切位點(diǎn)，若使用該限制酶切割S基因和載體，則易導(dǎo)致目的基因、載體自身環(huán)化以及目的基因反向連接，因此最好選用限制酶

Xba

Ⅰ、

Hin

dⅢ切割S基因和載體。構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，S基因(目的基因)必須插在T－DNA上，因?yàn)門(mén)－DNA可將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上。1234567891011121314151617(3)若要通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)S基因是否在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)出目的蛋白，請(qǐng)簡(jiǎn)要寫(xiě)出實(shí)驗(yàn)

思路。從轉(zhuǎn)基因植株相應(yīng)細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，使用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原—抗體雜交，檢測(cè)

是否表達(dá)出S蛋白。[解析]若要通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)S基因是否在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)出目的蛋白，可采用抗原—抗體雜交技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)思路：從轉(zhuǎn)基因植株相應(yīng)細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，使用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原—抗體雜交，檢測(cè)是否表達(dá)出S蛋白。12345678910111213141516179.[2023昆明質(zhì)檢，15分]如圖為“乙肝基因工程疫苗”生產(chǎn)過(guò)程圖解，質(zhì)粒上箭頭

所指部位為相應(yīng)的限制酶的切割位點(diǎn)。質(zhì)粒中

LacZ

基因編碼產(chǎn)生的酶可以分解培養(yǎng)

基中的X－gal，產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色；否則菌落為白色。1234567891011121314151617回答下列問(wèn)題。(1)過(guò)程①選用限制酶的最佳方案是

?。A.

Eco

RⅤ和

Eco

RⅠB.

Bam

HⅠ和

Eco

RⅠC.

Eco

RⅤ和

Bam

HⅠD.只有

Bam

HⅠ(2)構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，一般將目的基因插在啟動(dòng)子和終止子之間。啟動(dòng)子的作用

是

?。B

RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄出mRNA

[解析]

構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，一般將目的基因插在啟動(dòng)子和終止子之間。啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。[解析]若選擇

Eco

RⅤ，會(huì)破壞青霉素抗性基因和目的基因，影響篩選，結(jié)合題

圖可知，構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)選用限制酶的最佳方案是

Bam

HⅠ和

Eco

RⅠ，故選B。1234567891011121314151617(3)為了篩選含目的基因表達(dá)載體的大腸桿菌，可在培養(yǎng)大腸桿菌的通用培養(yǎng)基中額

外加入

和

，培養(yǎng)一段時(shí)間后挑選出

(填“藍(lán)色”或

“白色”)