獼猴桃無病毒種苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

DBXX

陜西省市地方標(biāo)準(zhǔn)

DBXX/TXXX-20xx

獅猴桃無病毒種苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

Technicalcodefortheproductionofvirus-freekiwifruitstock

（征求意見稿）

20xx-xx-xx發(fā)布20xx-xx-xx實施

陜西省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

前言

本標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則

》起草。

本標(biāo)準(zhǔn)由陜西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：西北農(nóng)林科技大學(xué)、楊凌夢綠生態(tài)農(nóng)業(yè)有限責(zé)任公司。

本規(guī)程起草人：劉占德，張阿玲，史遐，劉艷飛，賀浩浩，高志雄。

本標(biāo)準(zhǔn)為首次發(fā)布。

1適用范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了林猴桃病毒脫除方法、病毒檢測方法、脫毒種苗保存與繁殖。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于搟猴桃脫毒種苗繁育及狒猴桃病毒檢測。

2術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

2.1莖尖培養(yǎng)脫毒Viruseliminationbyshoottipculiure

切取0.2~0.5mm帶毒試管苗莖尖，經(jīng)組織培養(yǎng)獲得無病毒植株的過程。

2.2莖尖超低溫療法脫毒Viruseliminationbyshoottipcryotherapy

切取l.0~2.0mm帶毒試管苗莖尖，經(jīng)液氮處理后進行組織培養(yǎng)獲得無病毒植株的過程。

2.3熱療法結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒Viruseliminationbyihermotherapycombinedwithshoottip

culture

先對帶毒試管苗進行熱處理，熱處理結(jié)束后取莖尖進行莖尖培養(yǎng)獲得無病毒植株的過

程。

2.4化療法結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒Viruseliminationbychemotherapycombinedwithshoottip

culture

先將帶毒試管苗置于含抗病毒藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后取莖尖進行莖尖培養(yǎng)

獲得無病毒植株的過程。

2.5熱療法結(jié)合莖尖超低溫療法脫毒Viruseliminationbytherniotherapycombinedwithshoot

tipcryotherapy

先對帶毒試管苗進行熱處理，熱處理結(jié)束后取莖尖進行超低溫處理，最后經(jīng)組織培養(yǎng)

獲得無病毒植株的過程。

2.6化療法結(jié)合莖尖超低溫療法脫毒Viruseliminationbychemotherapycombinedwithshoot

lipcryotherapy

先將帶毒試管苗置于含抗病毒藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后取莖尖進行超低溫處

理，最后經(jīng)組織培養(yǎng)獲得無病毒植株的過程。

2.7化療法結(jié)合熱療法和莖尖培養(yǎng)脫毒Viruseliminationbychemotherapycombined

withtherniotherapyandshoottipculture

先將帶毒試管苗置于含抗病毒藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，之后進行熱處理，熱處理結(jié)束后

取莖尖進行組織培養(yǎng)獲得無病毒植株的過程。

2.8熱療法結(jié)合化療法和莖尖超低溫療法脫毒Viruseliminalionbyihennotherapycombined

withchemotherapyandshootlipcryoihcrapy

先將帶毒試管苗置于含抗病毒藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，之后進行熱處理，熱處理結(jié)束后

再取莖尖進行超低溫處理，最后經(jīng)組織培養(yǎng)獲得無病毒植株的過程。

2.9無病毒母株virus-freemotherplant

通過病毒脫除處理或直接篩選獲得的、經(jīng)檢測并確認(rèn)不攜帶本文件規(guī)定的病毒的植株。

2.10無病毒苗木virusfreeseedling

未攜帶有本文件規(guī)定的病毒的猿猴桃苗木。

2.11無病毒母本園virus-freemotherblock

用于提供猾猴桃無病毒母株保存的闞地。

3脫毒原理

病毒在植物體內(nèi)分布不均勻，植物莖尖頂端分生組織中的病毒含量較低甚至不含病毒,

熱處埋及抗病毒約物處埋能夠抑制病毒RNA的合成，因此用通過莖尖培養(yǎng)，或結(jié)合熱療

及化療對植物病毒進行脫除：在莖尖超低溫療法脫除植物病毒中，莖尖經(jīng)過冷凍保護處理

后轉(zhuǎn)入液氮中冷凍時，分化程度較低、核質(zhì)比大、自由水含量較低的莖尖頂端分生組織和

幼嫩葉原基細胞更容易存活。由于很多病毒無法侵入莖尖頂端分生組織，因此無病毒的頂

端分生組織可以在液氮冷凍后存活并再生為無病毒植株。

4病毒檢測與脫除

4.1病毒種類

病毒種類見表A.lo包括狒猴桃病毒A(ActinidiavirusA,AcVA)、舜猴桃病毒B

(ActinidiavirusB,AcVB)、物猴桃種傳潛隱病毒(Actinidiaseedbomelatentvirus,

ASbLV)>物猴桃黃化環(huán)斑病毒(.Actinidiayellowingringspotvirus,AYRSpV)、舜猴桃

病毒1{Actinidiavirus1,AcV-l)、梆猴桃黃化病毒1(.Actinidiayellowingvirus1,

AcYVl)、舜猴桃黃化病毒2(Aainidiayellowingvirus2,AcYV2)、蘋果莖溝病毒

(Applestemgroovingvirus.ASGV)、櫻桃卷葉病毒(CherrjLeafRollvirus*CLRV)、

天竺葵帶斑病毒(Pelargoniumzonatespotvirus?PZSV)、柑橘葉斑駁病毒(Citrusleaf

blotchvirus.CLBV)等。

4.2病毒檢測

采用RT-PCR的方法進行病毒檢測。具體參見附錄A。

4.3貓猴桃無病毒母株的獲取

4.3.1材料選擇

選擇品種純正、經(jīng)觀察未發(fā)現(xiàn)病毒病癥狀且生長健壯、性狀優(yōu)良的植株，參照4.2的

方法進行病毒檢測，確定不攜帶4.1規(guī)定的病毒的可作為無病毒母株：經(jīng)檢測，確定植株

已感染4.1規(guī)定的病毒，則應(yīng)進行脫毒處理，病毒脫除后培育的凍猴桃植株，經(jīng)檢測為無

病毒的，也可作為無病毒母株。

4.3.2外植體的建立

選取健壯驕猴桃植株當(dāng)年生新梢作為外植體，剪去葉片，用自來水和洗潔精溶液充分

清洗干凈。將枝條剪成長3~5cm的莖段，于超凈臺內(nèi)用75%酒精表面消毒10~305,再用

1%的次氯酸鈉溶液消毒570min,最后用無菌水沖洗4~5次。將消毒后的外植體切成長

1.5cm的帶芽莖段，用無菌濾紙吸干其表面的水分后，接種至初分化培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)莖段

腋芽萌發(fā)。4周后萌發(fā)的腋芽切下，置于增殖培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，每4?6周繼代一次。

培養(yǎng)溫度24"C±2℃,光照強度3(XX)lx,光照時間16h/d。

4.3.3病毒的脫除

4.33.1莖尖培養(yǎng)脫毒

以4~6周苗齡的凍猴桃?guī)Ф驹嚬苊鐬椴牧?，于超凈工作臺中在體式顯微鏡下切取

0.2~0.5mm的莖尖，將其轉(zhuǎn)接至含增殖培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，每4周繼代一次。當(dāng)莖尖

長成小植株時轉(zhuǎn)至含增殖培養(yǎng)基的組培瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

433.2莖尖超低溫療法脫毒

以4~6周苗齡的驕猴桃?guī)Ф驹嚬苊鐬椴牧?，于超凈工作臺中在體式顯微鏡下切取

l.0~2.0mm的莖尖。先將莖尖置于0.25M蔗糖溶液中預(yù)培養(yǎng)24h；后轉(zhuǎn)置于0.5M蔗糖溶

液中預(yù)培養(yǎng)24h；預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將莖尖轉(zhuǎn)置于加我液中室溫下處理20min；加我完成后,

符莖尖轉(zhuǎn)置于提前預(yù)冷的玻璃化冷凍保護液PVS2中冰上處理20?60min。PVS2處理結(jié)束

前兩分鐘，將莖尖轉(zhuǎn)移至滅菌鋁箔條上的PVS2液滴中，后將鋁箔條置于液氮中處理1h?

液氮處理完畢后將帶有莖尖的鋁箔條從液氮中取出，迅速放入卸載液中解凍20min：卸載

完成后,將莖尖轉(zhuǎn)置至恢兔培養(yǎng)基中,先于24±2℃的溫度條件下黑暗培養(yǎng)"1?后轉(zhuǎn)入正

常光照F培養(yǎng)，每4周繼代一次。莖尖超低溫療法脫除源猴桃病毒所用溶液配方參見附錄

B,脫毒流程參見附錄C。

4.333熱療法結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒

以4~6周苗齡的凍猴桃?guī)Ф驹嚬苊鐬椴牧?，切取約2cm大小的莖段先于正常條件下培

2周,后轉(zhuǎn)至熱處理箱(溫度：30℃~40℃：光照強度：3000lx：光照時間：16h/d).熱

處理的方式主要有三種：對于耐熱品種，可采用恒溫處理；中等耐熱品種及熱敏感品種則

可采用變溫處理或逐步升溫處理。處理時間為2~4周。熱處理結(jié)束后切取0.2~0.5mm莖尖

進行莖尖培養(yǎng)，方法同4.3.3.1。

43.3.4化療法結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒

以4~6周苗齡的獅猴桃?guī)Ф驹嚬苊鐬椴牧?，取約2cm大小的莖段置于含15-100rng/L

利巴韋林的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4~6周，后取5mm莖尖進行莖尖培養(yǎng)，方法同433.1。

43.3.5熱療法結(jié)合莖尖超低溫療法脫毒

以4-6周苗齡的蛛猴桃?guī)Ф驹嚬苊鐬椴牧?，取約2cm大小的莖段先進行熱處理，方法

同433.3。熱療結(jié)束后切取1.0?2.0mm大小的莖尖進行超低溫處理，方法同4.332。

43.3.6化療法結(jié)合莖尖超低溫療法脫毒

以4~6周苗齡的舜猴桃?guī)Ф驹嚬苊鐬椴牧?，切取約2cm大小的莖段進行化療，方法同

433.4?；熃Y(jié)束后切取1.0~2.0mm大小的莖尖講行貂低溫處理，方法同4.332。

4.337化療法結(jié)合熱療法和莖尖培養(yǎng)脫毒

以4~6周苗齡的梆猴桃?guī)Ф驹嚬苊鐬椴牧?，切取約2cm大小的莖段接種至含15-100

mg/L利巴韋林的培養(yǎng)基中先于正常條件下培養(yǎng)2周，之后將其轉(zhuǎn)至熱處理箱繼續(xù)培養(yǎng)2?4

周,熱療和化療方法同4.333和4.3.3.4。熱療和化療結(jié)束后取0.2~0.5mm莖尖進行莖尖培

養(yǎng)，方法同4.3.3.1。

4.338熱療法結(jié)合化療法和莖尖超低溫療法脫毒

以4-6周苗齡的掰猴桃?guī)У迷嚬苊鐬椴牧?，取約2cm大小的莖段先進行熱療和化療，

方法同4.337。熱療和化療結(jié)束后取1.0~2.0mm大小的莖尖進行超低溫處理，方法同

433.2。

4.4病毒脫除后莖尖再生與病毒檢測

經(jīng)脫毒處理的莖尖培養(yǎng)2個月后，出現(xiàn)明顯的莖段伸長(>5mm)并再生出2~3片新

葉時視為再生，隨后將再生莖尖轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，大約培養(yǎng)I個月后，脫毒

處理再生苗出現(xiàn)分株,此時將來源于同一個莖尖的植株轉(zhuǎn)至同一個組培瓶中并編號.繼代

培養(yǎng)4~6周后取樣進行第一次病毒檢測。將檢測結(jié)果為陰性的植株繼續(xù)繼代培養(yǎng)4-6周后

取樣進行第二次病毒檢測，將兩次檢測結(jié)果均為陰性的試管苗初步定為脫毒苗。此后，每

4~6周繼代一次脫毒苗。

4.5生根培養(yǎng)

以不帶病毒的增殖苗為材料，切取約2cm大小的莖段轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基(1/2MS+

0.6mg^IBA,pH=5.8),在24±2C條件下，進行4周左右的生根培養(yǎng)。

4.6煉苗和移栽

從生根培養(yǎng)至幼根長至1cm左右時，將組培瓶移入日光溫室煉苗，遮陰3d不開瓶口,

擰松瓶口放置Id,將瓶口敞開2d,之后進行移栽，控制氣溫不超過30C,空氣相對濕度

在90%以上。

將經(jīng)過煉苗的組培苗洗凈培養(yǎng)基，移栽至基質(zhì)為珍珠巖：泥炭：細沙=1:1:1或發(fā)酵餅

肥：土壤：基質(zhì)1:1:1并用多菌靈消毒晾干后的營養(yǎng)缽(口徑x高為16cmx16cm),澆透

水，置于覆蓋60目防蟲網(wǎng)的溫網(wǎng)室內(nèi)，在營養(yǎng)缽上覆蓋塑料薄膜，期間及時噴水以保持莖

葉濕潤，15d后揭去薄膜。

4.7無病毒苗移栽后病毒復(fù)檢

脫毒苗移栽半年后進行病毒更檢，若復(fù)檢結(jié)果為陰性，則可認(rèn)定為脫毒苗：若匏檢結(jié)

果為陽性，則該再生苗不是脫毒苗，需進行進一步的脫毒處理。此后每年至少做一次病毒

復(fù)檢，以防病毒再次感染。

5無病毒母本園的建立

5.1圃地準(zhǔn)備

圃地所在區(qū)域應(yīng)為非驕猴桃潰瘍病發(fā)生區(qū)與掰猴桃適栽區(qū)。選擇疏松肥沃、排水良好、

微酸性的砂質(zhì)壤土，且5年內(nèi)未栽植過果樹的地塊。

5.2無病毒母株的栽植

經(jīng)檢測確定不攜帶4.1規(guī)定的掰猴桃病毒，或經(jīng)4.3殊猴桃病毒脫除的植株可作為無病毒

母株按株行距為3mx4m定植在網(wǎng)室中。調(diào)查、分析并記錄每單株的園藝學(xué)性狀，待顯示

固有的園藝學(xué)性狀后，選做母本樹，提供無病毒接穗。

5.3無病毒母本園的管理

無病毒母本園常用工具須專用，枝剪、刀、鋸子等在操作每個植株之前均需用75%的

酒精消毒。此外，工作人員進出園圃也應(yīng)消毒，并嚴(yán)格執(zhí)行其池人員進出登記、安全檢疫

制度。

每月定期觀察周內(nèi)掰猴桃無病毒母株是否有病毒病癥狀，每年春梢萌發(fā)后10d進行病毒

檢測，經(jīng)檢測，淘汰不符合2.10定義的植株。

6無病毒苗木的繁育

6.1苗圃準(zhǔn)備

選擇疏松肥沃、排灌水方便、光照良好、冬春季無霜凍的地塊作為苗圃地；冬春季有

霜凍的區(qū)域，在溫室大棚建立苗圃。

6.2砧木準(zhǔn)備

選擇生長健康、無病蟲害的，參照4.2的方法檢測后不攜帶病毒或脫毒后莖粗達0.6

cm以上的舜猴桃砧木苗，嫁接前砧木苗摘心，并去除基部萌薇。

6.3接穗采集

取生長健壯、芽體飽滿、無病害的當(dāng)年生木質(zhì)化的舜猴桃無病毒母株枝條，掛牌標(biāo)記

母株編號。冬季剪下的接穗，應(yīng)立即放在陰涼處，用2%濕沙埋藏備用。

6.4嫁接

春、夏嫁接多采用單芽枝接，也可采用單芽枝腹接法或帶木質(zhì)芽接。

6.5嫁接后管理

6.5.1剪砧及抹除砧槃

嫁接后砧木接口下萌發(fā)的不定芽及時剪除.接芽失敗或風(fēng)折不能再萌發(fā)的.應(yīng)在砧木

是選留一個枝條，以備后期補接。采用單芽枝腹接法或帶木質(zhì)部芽接法的嫁接苗成活后應(yīng)

立即剪砧，剪口離接芽3?4cm,砧木上萌麋應(yīng)及時抹除。。

6.5.2解綁

接穗嫁接部位完全愈合，新梢半木質(zhì)化以后及時解去嫁接時的綁扎帶。為防止風(fēng)劈促

進接口愈合牢固，扎帶自上而下分兩次解除，每次一半，間隔兩周。

6.5.3立支柱及摘心

當(dāng)接芽K到20cm時，在嫁接苗的旁邊插竹竿作立柱，引縛護苗防風(fēng)劈，綁縛時使用

“oc”字形活結(jié)。新梢拉直吊端向上生長，不要纏繞生長。

6.5.4土、水、肥管理

經(jīng)常保持育苗地土壤濕潤，土壤相對濕度在70%~80%之間。有積水時要及時排出,

及時中耕除草，根據(jù)苗木長勢進行葉面噴肥或結(jié)合中耕除草、澆水等進行追肥，用尿素或

磷酸二氫鉀進行葉面施肥，濃度不得超過0.3%,土壤追肥每667m?每次施入尿素或磷酸二

氫鉀7.5~10kg,9月中旬停止施肥，促進苗木木質(zhì)化。

6.5.5摘心

在幼苗生長6~8片葉50-50cm時，應(yīng)及時摘心，以促進組織充實苗木粗壯。

7無病毒苗木出圃

苗木出圃前，定期觀察狒猴桃苗木形態(tài)特征，剔除有病毒病癥狀的植株。病毒脫除的

凍猴桃苗木出圃前，每批次應(yīng)進行1次病毒檢測，按照GB/T2828.10規(guī)定的方法進行抽檢。

若檢測出攜帶病毒，應(yīng)根據(jù)標(biāo)記，追蹤其母株并進行病毒檢泱!。若母株也攜帶病毒，則立

即清除該母株及其周邊臨近的植株；若母樹不帶病毒，則立即清除攜帶病毒的苗木及其周

邊臨近植株。無病毒苗木出圃應(yīng)滿足表1所規(guī)定的質(zhì)量要求。

表I驕猴桃無病毒苗木質(zhì)量

級別

項目

一級二級三級

品種與砧木純正。實生苗和嫁接苗砧木應(yīng)以抗性強的

品種與砧木

美味、對萼、大籽物猴桃為主。

側(cè)根形態(tài)側(cè)根沒有缺失和劈裂傷

側(cè)根分布均勻、舒展而不卷曲

根側(cè)根數(shù)量(條)>4

側(cè)根長度(cm)當(dāng)4B生苗N20.0,二年生苗230.0

側(cè)根粗度(cm)>0.5>0.4>0,3

直曲度(cm)<15.0

高度(cm)>60>50>40

粗度(cm)>1.0>0.8>0.6

苗

實生苗，飽滿芽數(shù)

干>5>4>3

(個)

嫁接苗品種部位，飽滿

>5>4>3

芽數(shù)(個)

皮層鮮活有光澤，無干縮皺皮，無新?lián)p傷，老損傷處

根皮與莖皮

總面積不超過1.0cm?

愈合良好。枝接要求接口部位砧穗粗細一致，沒有大

腳(砧木粗、接穗細)、小腳(砧木細、接硬粗)或

接合部愈合情況

嫁接部位四起臃腫現(xiàn)象：芽接要求接口愈合完整，沒

有空、翹現(xiàn)象。

木質(zhì)化程度完全木質(zhì)化

無根結(jié)線蟲、無蛤殼蟲、無潰瘍病、無疫霉病、無根

病蟲害

腐、無飛虱、無蛾類等。無國家規(guī)定的檢疫對象。

病毒檢測不攜帶4.1規(guī)定的病毒種類

8無病毒苗木的標(biāo)識與包裝

8.1標(biāo)識

搟猴桃無病毒母株標(biāo)簽應(yīng)包括品種、母株編號、病毒檢測單位、母株培育單位等信息。

舜猴桃無病毒苗木標(biāo)簽應(yīng)包括品種、等級、株數(shù)、病毒檢測單位、生產(chǎn)單位、地址等信息。

8.2包裝

搟猴桃無病毒苗木應(yīng)按照品種和等級分別包裝。包裝內(nèi)外應(yīng)附有苗木標(biāo)簽。

附錄A

(資料性附錄)

貓猴桃病毒檢測方法(RT-PCR法)

A.1適用范圍

本附錄提供的RT-PCR法適用于己知核酸序列的物猴桃病毒的檢測。

A.2儀器設(shè)備

恒溫水浴鍋；渦旋儀：高速冷凍離心機；-20C冰箱：超微量分光光度計；PCR儀：

電泳儀：凝膠成像儀。

A.3試劑

CTAB裂解液、隹磕基乙醇、液氮、氯仿、異戊醉、氯化鋰、無水乙醇、RNase-free水、

反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴增試劑盒、核酸染料、TAE緩沖液。

A.4操作步驟

A.4.1總RNA提取

(I)于1.5mL無酶離心管中加入600HLeTAB裂解液和40蟹伊利基乙醇,65c預(yù)

熱；

(2)稱取0.1g待檢植株葉片樣品于液氮中迅速研磨至粉末狀，將粉末轉(zhuǎn)至a中的離

心管，渦旋混勻30s,65'C水溶10min,期間顛倒混勻2-3次：

(3)加入等體積的氯仿異戊醇混合液(V:V=24:1),顛倒混勻，4C條件下，11000

rpm離心10min：

(4)取500池上清液，加入等體枳的氯仿異戊醇混合液(V:V=24:l),顛倒混勻，4*C

條件下，11000rpm離心10min：

(5)取400RL上清液,加入二分之一體積的氯化液溶液(6M),顛倒混勻，-20°C

沉淀2-3h：

(6)4℃條件下，12000rpm離心10min,棄上清；

(7)加入500HL75%乙醇洗滌沉淀，4c條件下，12000rpm短暫離心30s,棄上清。

(8)加入500nL無水乙醇洗滌沉淀，4℃條件下，12000rpm短暫離心30s,棄上清

并吸除殘留液體，后將離心管倒扣晾干5min。

(9)加入3()pLRNase-free水溶解沉淀，檢測所提取總RNA的濃度、純度及完整性。

若總RNA質(zhì)量合格，則立即進行cDNA合成或置于-80C超低溫冰箱保存?zhèn)溆?；若?/p>

RNA質(zhì)量不合格，則需重新提取。

A.4.2cDNA合成

按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行操作。

A.4.3PCR擴增

A.4.3.1PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)液組成為：12.5piL2xTaqMix,IgLcDNA模板,上下游引物（lO^M）各1

卜（，無菌蒸譚水補足至終體積25pL。目標(biāo)病毒對應(yīng)的特異性檢測引物及擴增產(chǎn)物大小見

表A.1。

A.4.3.2PCR反應(yīng)程序

PCR擴增程序為：94℃預(yù)變性5min：94c變性30s,54c退火30s,72c延伸15-

40s,循環(huán)35次;72c終延伸5min。

A.4.4PCR產(chǎn)物檢測

制備1%瓊脂糖凝膠，對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測。電泳結(jié)束后，將瓊脂糖凝膠置于凝

膠成像儀中成像，并拍照記錄。

A.4.5檢測結(jié)果分析

（1）當(dāng)檢測樣品中出現(xiàn)目標(biāo)條帶.陰性對照和空白對照未出現(xiàn)目標(biāo)條帶時,視為陽性.

即檢測樣品中攜帶相應(yīng)病毒。

（2）當(dāng)檢測樣品中未出現(xiàn)目標(biāo)條帶，陰性對照和空白對照也未出現(xiàn)目標(biāo)條帶時，視為

陰性，即檢測樣品中不攜帶相應(yīng)病毒。

（3）當(dāng)陰性對照或空白對照出現(xiàn)目標(biāo)條帶時，無論檢測樣品中是否出現(xiàn)目標(biāo)條帶，檢

測結(jié)果均視為無效，應(yīng)重新檢測。

表A.1狒猴桃病毒檢測引物序列及擴增產(chǎn)物大小

病毒名稱引物序列(5VF)產(chǎn)物大小(bp)

都猴桃病毒AF:CATGGCAAAGAATATCTCAAG471

(AcVA)R:AGATCCAACCCAGAGTTGAAA

梆猴桃病毒BF:GTTTGCGAGGAGACGTAGGGC342

(AcVB)R:AGTTAAGTGCTCTYGGRGGTGTG

魅猴桃病毒CF:AAAGAACCCTACCTCCACC1106

(AcVC)R:CCATCTATATCTCAACAGCCTGCTCG

疥猴桃病毒DF:AGGACACTCAAGCCTCAACATC847

(AcVD)R:TTGTAGGCGACCCACAGAAG

獅猴桃褪綠環(huán)斑病毒F:ATCCAAGAATTCCTTAACAGCA477

(AcCRaV)R:TGTGCAATCATGGCTTATCAGA

麻猴桃黃化病毒1F:CAACGCCGCAAACATCCTTAT624

(AcYVl)R:CACCTGCTTCTCACAAACAGTCTCA

掰猴桃黃化病毒2F:AAAACAACTCAACAGAAACGCACTA530

(AcYV2)RTTCCCTGAAGTAGACAGAATAGACG

梆猴桃黃化環(huán)斑病毒F:TrrGGACTGGGAACGTAGAGG337

(AYRSpV)R:CGAGAAAGTGAGGTTATCGGG

舜猴桃種傳潛隱病毒F:GCDAARGCNGGNCARACHHTVGCBTGYTT363

(ASbLV)R:RAAYTCNCCNSWRAANCKCAT

掰猴桃病毒1F:AGGAATATTGGATCGGTTGTCG208

(AcV-1)R:GATGGTCAGTCTTAATCTCC

殊猴桃山樗病毒2F:CTGCTATACATCCTGAATGGT985

(AcEV-2)R:GATGTCTTTGTACTAGATGC

蘋果莖溝病毒F:CCCGCTGTTGGATTTGATACACCTC499

(ASGV)R:GGAATTTCACACGACTCCTAACCCTCC

柑橘葉斑駁病毒F:GAAAAGCAACGAAAGCAACCTA328

(CLBV)R:CGAACAAGATGTGATTCTCG

櫻桃卷葉病毒F:GTCGGAAAGATT/XCGTAAAAGG416

(CLRV)R:TGGCGACCGTGTAACGGCA

天竺葵輪斑病毒F:GATAAATTCAGAGCTCTCGG997

(PZSV)R:ATCTCTGCAGAITGTGTrCC

黃瓜花葉病毒F:GAGTCGTGCGTTTTCTTTGTGTTTT183

(CMV)R:AATGGCGAGGGTTTTyVTTGAGTC

馬鈴薯X病毒F:AGTGCGCGAGGTTTACCAATC790

(PVX)R:GTGGTTTGCCGCGAACGATTC

番茄壞死斑點相關(guān)病F:ATGATTTGTTTGGGGTTATG350

毒(TNSaV)R:GAATGGTTCTCCCTCTATGG

附錄B

（資料性附錄）

表B.1超低溫療法脫除麻猴桃病毒所用溶液配方

組分

溶液名稱

MS蔗糖丙三醇乙二醇二甲基亞碉

0.25M蔗糖溶液4.43g/L0.25M///

0.5M蔗糖溶液4.43g/L0.5M///

加載液4.43g/L0.4M2M//

PVS24.43g/L0.4M30%(w/v)15%(w/v)15%(w/v)

卸載液4.43g/L1.2M///

附錄c

（資料性附錄）

搐博目生

圖C.1莖尖超低溫療法脫除梆猴桃病毒流程圖

《貓猴桃無病毒種苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》

編制說明

一、工作概況

1.1任務(wù)來源

本標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)《陜西省市場監(jiān)督管理局關(guān)于下達2022年陜西省地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂

計劃項目的通知》要求起草,項目編號SDBXM111-2022。

1.2目的與意義

獅猴桃原產(chǎn)于中國，是一種營養(yǎng)價值極高的水果，有“VC之王”之稱，在全球

水果生產(chǎn)中占有重要位置。目前全球有30多個國家栽培掰猴桃，主產(chǎn)國有中國、意

大利、新西蘭和智利。截至2019年年底，全球栽培面積已達36.3萬公頃，產(chǎn)量達

430萬噸。其中我國的栽培規(guī)模最大，栽培面積29.1萬公頃，產(chǎn)量300.6萬噸，分別

占世界舜猴桃栽培面積和產(chǎn)量的80.2%和69.9%o陜西作為中國最大的舜猴桃產(chǎn)區(qū)，

栽培面積及產(chǎn)量分別占全國的30%和40%o

然而，近年米隨著舜猴桃栽培面積的不斷擴大，獅猴桃病毒病的擴散和蔓延也成

為威脅滁猴桃安全生產(chǎn)的隱患之一。目前，共鑒定出24種可侵染梆猴桃的病毒，包

括12種新病毒和12種已知的、狒猴桃是其新寄主的病毒，而在我國栽培掰猴桃中鑒

定出的病毒有17種。狒猴桃感染病毒后通常會表現(xiàn)出葉片花葉、斑駁、褪綠和畸形

等癥狀，嚴(yán)重時會引起樹干枯死、樹皮開裂、果實大小不均勻等癥狀，極大影響產(chǎn)量

和質(zhì)量，造成嚴(yán)重經(jīng)濟損失。有研究指出，狒猴桃病毒病在陜西不同地區(qū)，不同殊猴

桃種及品種上廣泛發(fā)生，且對陜西貓猴桃產(chǎn)量及品質(zhì)造成了嚴(yán)重影響。

植物病毒是專性細胞內(nèi)寄生物，只寄生在寄主的活細胞內(nèi)，可通過營養(yǎng)繁殖世代

傳播，還可通過昆蟲媒介從受病毒感染的植物傳播到健康的植物，長期以來一直是農(nóng)

業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的制約因素。掰猴桃常通過嫁接繁殖，因此導(dǎo)致了病毒在掰猴桃植

株上的積累和傳播。雖然化學(xué)藥品在控制病毒病方面有潛在的應(yīng)用，但培育無病毒植

物才是有效控制它們的一種農(nóng)業(yè)策略。目前.，世界各地廣泛種植無病毒植物，以控制

許多重要經(jīng)濟作物的病毒性疾病，如塊莖作物、草本觀賞植物。從其他國家進口新品

種及國家或地區(qū)之間交換育種材料也都需要無病毒材料。此外，植物種質(zhì)資源保存也

強調(diào)使用無病毒植物。因此，建立薄猴桃病毒脫除技術(shù)體系，制定“跺猴桃脫毒種苗

生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程”具有重要的生產(chǎn)及經(jīng)濟意義，為后續(xù)滁猴桃脫毒苗的生產(chǎn)提供理論基

礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1.3主要工作過程

項目任務(wù)下達后，立即成立了梆猴桃無病毒種苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程地方標(biāo)準(zhǔn)起草小組,

組織起草小組對測試標(biāo)準(zhǔn)的意義和總體技術(shù)要求進行學(xué)習(xí)，制定了本標(biāo)準(zhǔn)的工作方案、

技術(shù)路線、主要研究方法，標(biāo)準(zhǔn)的具體格式，確定了標(biāo)準(zhǔn)的總體框架和制定原則，明

確了標(biāo)準(zhǔn)制定的具體工作計劃和進度。起草小組通過多年自身試驗研究資料的整理，

結(jié)合對其他同行業(yè)無病毒種苗生產(chǎn)的數(shù)據(jù)資料的研究等方法，在總結(jié)起草單位多年來

徐猴桃無病毒種苗培育和實踐的基礎(chǔ)上，全面開展了該標(biāo)準(zhǔn)的制定工作。

1.4起草單位

標(biāo)準(zhǔn)由西北農(nóng)林科技大學(xué)主導(dǎo)，楊凌夢綠生態(tài)農(nóng)業(yè)有限責(zé)任公司協(xié)助起草。

二、標(biāo)準(zhǔn)編寫原則和研究內(nèi)容

包括標(biāo)準(zhǔn)編制所遵循的原則，以及標(biāo)準(zhǔn)結(jié)構(gòu)、要索、技術(shù)要求、關(guān)鍵指標(biāo)的確定

依據(jù)和主要內(nèi)容；地方標(biāo)準(zhǔn)修訂項目還應(yīng)當(dāng)列出和原標(biāo)準(zhǔn)主要差異情況。

本標(biāo)準(zhǔn)遵循適用性、先進性、統(tǒng)一性和協(xié)調(diào)性的原則，始終將經(jīng)濟效益、生態(tài)效

益和社會效益有機結(jié)合，協(xié)調(diào)統(tǒng)一。

本標(biāo)準(zhǔn)共有8章，嚴(yán)格按照GB/T1.1-2020的規(guī)定編寫，本標(biāo)準(zhǔn)包括封面、引言、

名稱、適用范圍、術(shù)語和定義、要求等要素。主要內(nèi)容包括標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍、術(shù)語和

定義、脫毒原理、病毒檢測與脫除、無病毒母本園的建立、無病毒苗木的繁育、無病

毒苗木出圃及包裝標(biāo)識等。

三、實證研究

本標(biāo)準(zhǔn)實施驗證工作開展了大量的試驗，尤其是對于滁猴桃病毒檢測與脫除方法

進行了系統(tǒng)的研究，確定了關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)。

3.1化學(xué)療法脫毒處理利巴韋林濃度篩選

對感染AcVA、AcVB和AcCRaV三種病毒的大籽跳猴桃試管苗使用0、25、50、

75.lOOmg/L的利巴韋林增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)42d,對使用不同濃度利巴韋林進行處理

的試管苗生長狀況進行觀測并拍照記錄，結(jié)果如圖3-1所示，在處理的第14d,使用

25、50、75mg/L利巴書林處理植棟的生長情況一致與對照植株相似。在處理的28d,

筑著利巴韋林濃度的升高，植株生長變化明顯，利巴韋林濃度為5()mg/L時，植株長

勢最好，利巴韋林濃度為100mg/L時，植株部分葉片開始發(fā)黃，植株增殖受到輕微抑

制。處理結(jié)束時(42d),試管苗生長變化明顯，尤其在75、100mg/L利巴韋林濃度處

理下，植物病毒感染的癥狀均表現(xiàn)在葉片上，旦后者比前者癥狀更明顯，植株的增殖

受到了明顯的抑制作用。與對照相比，50mg/L利巴韋林濃度下植株的長勢最好。因

此，得出隨著利巴韋林濃度的加大，植株的生長先增強后減弱，在50mg/L的利巴韋

林濃度下長勢最好，所以后續(xù)脫毒試驗以25、50、75mg/L利巴韋林的濃度進行處理。

圖3-1利巴韋林化療后14、28和42天的離體大籽舜猴桃植株的生長情況

Fig.3-1GrowthofinvitroActinidiamacrospermaplantsafterchemotherapytreatmentswithribavirinfor

14.28.and42days

對照:離體大籽掰猴桃植株在標(biāo)準(zhǔn)生長室內(nèi)培養(yǎng);R25、R50、R75和R100:離體大籽搟猴桃植株在生

長室中培養(yǎng)在添加利巴韋林的增殖培養(yǎng)基上，濃度分別為25、50、75.lOOmg/Lo

CK：InvitroActinidiamacrospenmplantswereculturedinastandardgrowthroom;R2,R50andR75in

vitroActinidiamacrospermaplantswerecukurcdinagrowthroomonMSmediumsupplementedwith

ribavirinat25,50and75mg/L,respectively

3.2基于化學(xué)療法的脫毒處理對帶毒試管苗營養(yǎng)生長和增殖的影響

3.2.1化學(xué)療法脫毒處理對試管苗營養(yǎng)生長和增殖的影響

將帶毒大籽試管苗外施0、25、50、75mg/L利巴韋林在增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)6周

后，測量不同濃度利巴韋林處理時大籽駢猴桃試管苗營養(yǎng)生長和增殖。營養(yǎng)生長統(tǒng)計

結(jié)果如表3-1所示，在使用4個濃度利巴韋林對植株進行脫毒處理時，植株在節(jié)間數(shù)、

葉長、葉寬指標(biāo)上沒有出現(xiàn)顯著性差異，但是50mg/L的利巴韋林處理對植株的株高、

鮮重以及葉片數(shù)產(chǎn)生了顯著影響。高濃度利巴韋林(50mg/L)處理產(chǎn)生了20.4個葉

片，顯著高于對照組的14.4個葉片，旦在株高上達到了23.26mm,顯著高于對照組的

15.74mm,高于25、75mg/L處理下的植株表現(xiàn)但不顯著；節(jié)間長達到了最長的

4.38mm,顯著高于對照組和使用75mg/L的利巴韋林處理植株；節(jié)間數(shù)高于其他處理

但不顯著；鮮重、干重及干重均顯著高于對照處理；僅有葉寬葉長出現(xiàn)了低于其他處

理的現(xiàn)象。

不同脫毒處理對“大籽”獅猴桃試管苗增殖結(jié)果的影響統(tǒng)計結(jié)果如圖3-2所示，

使用50mg/L的利巴韋林處理對植株的增殖數(shù)產(chǎn)生了顯著影響，高濃度利巴韋林

(50mg/L)處理可以增殖5.4個植株，顯著高于對照組和使用R25、75mg/L的處理的

3、3.8、3.6個植株。所以，在正常處理6周的條件下，隨著利巴韋林濃度的上升，

50mg/L利巴韋林處理下大籽林猴桃植株綜合生長指標(biāo)最好，與處理6周時植株的生長

情況一致。

3.2.2化學(xué)療法結(jié)合熱處理對試管苗營養(yǎng)生長和增殖的影響

將帶毒大籽試管苗外施0、25、5()、75mg/L利巴韋林在增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周，

然后再經(jīng)過4周的熱處理后均可以成活。對該處理下試管苗營養(yǎng)生長和增殖狀況進行

測量并記錄。試管苗的營養(yǎng)生長統(tǒng)計結(jié)果如表3-1所示，經(jīng)過熱處理后，使用25、

50mg/L利巴韋林處理后的試管苗植株高度達到了24.27、25.34mm,顯著高于對照組

植株的13.42mm,使用75mg/L利巴韋林處理下試管苗株高為17.02mm,高于對照組

植株株高但不顯著。節(jié)間數(shù)、葉寬、鮮重、干重在不同濃度利巴韋林處理下和對照組

無顯著差異，但從增殖系數(shù)來看(圖3-2),50mg/L濃度利巴韋林處理后的植株增殖

系數(shù)最大為4.6,顯著高于對照組和使用75mg/L處理的3.4和3.2。說明伴隨著熱處理

脫毒，當(dāng)利巴韋林濃度增加到了75mg/L時，大籽掰猴桃植株增殖受到了抑制。

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表31不同濃度利巴韋林處理和不同濃度利巴韋林處理結(jié)合熱處理對大杼試管苗營養(yǎng)生長的影