基因工程的基本操作程序（課件精講）-高二生物課件精講習(xí)題精練（人教版2019選擇性必修3）-1

第2節(jié)基因工程的基本操作程序第3章基因工程學(xué)習(xí)目標(biāo)核心素養(yǎng)闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞和目的基因的檢測(cè)與鑒定。1.科學(xué)思維：結(jié)合生產(chǎn)實(shí)例，舉例說(shuō)出基因工程的基本操作程序。2．科學(xué)探究：針對(duì)人類生產(chǎn)和生活的某一需求，嘗試提出初步的基因工程構(gòu)想，完成初步設(shè)計(jì)。一、基因工程的基本操作程序目的基因的篩選與獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測(cè)與鑒定前提核心關(guān)鍵保證思考:獲得目的基因之后直接轉(zhuǎn)入受體嗎？不是游離的DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞，一般會(huì)直接被分解，就算可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)，游離的DNA片段也無(wú)法隨著細(xì)胞分裂進(jìn)行復(fù)制，導(dǎo)致子代細(xì)胞不再含有目的基因。(二)基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）1.操作目的：讓目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代，同時(shí)，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。2.基因表達(dá)載體的構(gòu)成啟動(dòng)子目的基因限制酶切割位點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)標(biāo)記基因終止子（若需要能完成自主復(fù)制，還應(yīng)有復(fù)制原點(diǎn)）目的基因啟動(dòng)子終止子標(biāo)記基因（1）啟動(dòng)子(二)基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）2.基因表達(dá)載體的構(gòu)成啟動(dòng)子目的基因限制酶切割位點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)標(biāo)記基因終止子思考:表達(dá)載體為什么一定要有啟動(dòng)子？

生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才能有利于基因的表達(dá)；通過(guò)cDNA文庫(kù)獲得的目的基因沒(méi)有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體細(xì)胞無(wú)法轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子：位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。操縱基因結(jié)構(gòu)基因

啟動(dòng)子RNA聚合酶（1）啟動(dòng)子(二)基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）2.基因表達(dá)載體的構(gòu)成啟動(dòng)子目的基因限制酶切割位點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)標(biāo)記基因終止子①本質(zhì):一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段②位置:位于基因的上游（首端），緊挨轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)。③特殊類型：誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。④誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的特點(diǎn)：當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，可以激活或抑制目的基因的表達(dá)

。（2）終止子(二)基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）2.基因表達(dá)載體的構(gòu)成啟動(dòng)子目的基因限制酶切割位點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)標(biāo)記基因終止子①本質(zhì):一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段。②位置:位于基因的下游。③功能：使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來(lái)。（3）標(biāo)記基因①作用：是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的重組DNA分子細(xì)胞篩選出來(lái)。②常見(jiàn)類型:抗生素抗性基因、熒光蛋白基因等。啟動(dòng)子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)位置功能補(bǔ)充：?jiǎn)?dòng)子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對(duì)比DNA片段DNA片段mRNA上三個(gè)相鄰的堿基mRNA上三個(gè)相鄰的堿基目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來(lái)翻譯的起始信號(hào)（編碼氨基酸）翻譯的結(jié)束信號(hào)（不編碼氨基酸）質(zhì)粒啟動(dòng)子限制酶切割位點(diǎn)終止子標(biāo)記基因復(fù)制原點(diǎn)限制酶目的基因限制酶切割位點(diǎn)限制酶獲取目的基因連接酶重組DNA分子

載體（質(zhì)粒）含有目的基因的DNA片段同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割帶有黏性末端（或平末端）的切口帶有相同黏性末端（或平末端）的目的基因片段DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）基因表達(dá)載體構(gòu)建模式圖(二)基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程思考：切割載體和切割含有目的基因的DNA片段的限制酶應(yīng)符合什么條件？

為什么？應(yīng)為同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶；產(chǎn)生相同的黏性末端或平末端，以便通過(guò)DNA連接酶連接；不一定，載體和目的基因都可能出現(xiàn)自身環(huán)化；三種：載體-載體、目的基因-目的基因、載體-目的基因用同一種限制酶切割質(zhì)粒和含有目的基因的DNA，再用DNA連接酶處理后，一定會(huì)形成重組DNA分子嗎？用同一種限制酶切割質(zhì)粒和含有目的基因的DNA，再用DNA連接酶處理后，可能有幾種產(chǎn)物（只考慮兩兩連接）？思考：用同一種限制酶切割質(zhì)粒和含有目的基因的DNA，再用DNA連接酶處

理后，形成的“載體-目的基因”產(chǎn)物一定符合要求嗎？不一定，目的基因可能反向連接到質(zhì)粒上。同時(shí)用兩種限制酶切割含目的基因的DNA片段和載體（使得目的基因的一端與載體一端的黏性末端相同，而目的基因的另一端與載體另一端的黏性末端相同）。這種方法針對(duì)性差，完全靠運(yùn)氣，也無(wú)法確定哪些基因?qū)肓耸荏w細(xì)胞。如何避免上述問(wèn)題？將生物的所有DNA直接導(dǎo)入受體細(xì)胞不是更簡(jiǎn)便嗎？如果這么做，效果會(huì)怎樣？一、基因工程的基本操作程序目的基因的篩選與獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測(cè)與鑒定前提核心關(guān)鍵保證

為何要把重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞？

受體細(xì)胞可以分為那些類型？依據(jù)他們的結(jié)構(gòu)與功能推測(cè)，導(dǎo)入方法相同嗎?

如何選擇受體細(xì)胞，才能讓轉(zhuǎn)基因猴全身體細(xì)胞都帶有目的基因？

培育抗蟲(chóng)棉時(shí)也必須選用這種細(xì)胞嗎，為什么？(三)

將目的基因（重組質(zhì)粒）導(dǎo)入受體細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞—花粉管通道法①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；②在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊。受體細(xì)胞：受精卵地位：我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)實(shí)例：將Bt基因?qū)朊藁?xì)胞“轉(zhuǎn)化”概念：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實(shí)質(zhì)都是基因重組。農(nóng)桿菌生活在土壤中的微生物，自然條件下可侵染雙子葉植物和裸子植物，而對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有侵染能力。農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。(三)

將目的基因（重組質(zhì)粒）導(dǎo)入受體細(xì)胞2.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞—農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法1.將新鮮的從葉片上取下的圓形小葉與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并再生成植株；2.將花序直接浸沒(méi)在含農(nóng)桿菌的溶液中一段時(shí)間，然后培養(yǎng)植株并獲得種子，再進(jìn)行篩選、鑒定。(三)

將目的基因（重組質(zhì)粒）導(dǎo)入受體細(xì)胞2.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞—農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法示意圖Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建基因表達(dá)載體含目的基因的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞目的基因插入染色體DNA中植物細(xì)胞表現(xiàn)出新性狀的植株植物組織培養(yǎng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的實(shí)驗(yàn)思路（過(guò)程）：將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA中，通過(guò)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，就可以使目的基因進(jìn)入植物細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，使目的基因能夠維持穩(wěn)定和表達(dá)。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法示意圖農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的實(shí)驗(yàn)思路（過(guò)程）：將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA中，通過(guò)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，就可以使目的基因進(jìn)入植物細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，使目的基因能夠維持穩(wěn)定和表達(dá)。兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞染色體的DNA上。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法示意圖農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的實(shí)驗(yàn)思路（過(guò)程）：將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA中，通過(guò)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，就可以使目的基因進(jìn)入植物細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，使目的基因能夠維持穩(wěn)定和表達(dá)。兩次導(dǎo)入：第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌；第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞（非人工操作）。

適用于單子葉植物

基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。(三)

將目的基因（重組質(zhì)粒）導(dǎo)入受體細(xì)胞3.將目的基因?qū)氲街参锛?xì)胞中方法--基因槍法

由于不同轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品所需要的目的基因不同，受體細(xì)胞又有植物、動(dòng)物、微生物之分，因此基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法不是千篇一律的,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法也不是完全相同的。(三)

將目的基因（重組質(zhì)粒）導(dǎo)入受體細(xì)胞4.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞——顯微注射法利用顯微注射將目的基因注入動(dòng)物受精卵中（因?yàn)槭芫讶菀妆憩F(xiàn)出全能性），這個(gè)受精卵將發(fā)育成具有新性狀的動(dòng)物。將目的基因?qū)雱?dòng)物受精卵最有效的方法。顯微注射將目的基因注射到動(dòng)物受精卵中（1）受體細(xì)胞：常用原核生物作為受體細(xì)胞，其中以大腸桿菌最廣泛。

優(yōu)點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少、易于培養(yǎng)。（2）Ca2+處理法（感受態(tài)細(xì)胞法）的一般過(guò)程Ca2+處理大腸桿菌使細(xì)胞處于一種能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)將重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中Ca2+的作用：增加細(xì)胞壁的通透性這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞一般利用溫度變化導(dǎo)入(三)

將目的基因（重組質(zhì)粒）導(dǎo)入受體細(xì)胞5.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞——Ca2+處理法思考：當(dāng)真核生物的基因以原核生物作為受體細(xì)胞時(shí)。

真核生物的基因有內(nèi)含子，原核生物沒(méi)有真核生物所具有的切除內(nèi)含子對(duì)應(yīng)的RNA序列的機(jī)制，其初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中與內(nèi)含子對(duì)應(yīng)的RNA序列不能被切除，因此無(wú)法表達(dá)出該蛋白。使用cDNA作為目的基因或使用酵母菌等真核生物作為受體細(xì)胞。

原核生物缺少高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，無(wú)法對(duì)真核生物的蛋白質(zhì)進(jìn)行正確的加工。人工體外再加工或使用酵母菌等真核生物作為受體細(xì)胞若無(wú)法獲得該蛋白，原因可能是什么？若可以獲得該蛋白，但是蛋白質(zhì)無(wú)活性，原因可能是？以上情況如何解決？以上情況如何解決？實(shí)例：利用轉(zhuǎn)基因大腸桿菌生產(chǎn)藥物

原核生物作為受體細(xì)胞產(chǎn)生的真核生物的蛋白質(zhì)通常沒(méi)有生物活性，需要在體外進(jìn)行再加工。一、基因工程的基本操作程序目的基因的篩選與獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測(cè)與鑒定前提核心關(guān)鍵保證

目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性，只有通過(guò)檢測(cè)與鑒定才能知道。生物大分子具有特異性

----分子水平的檢測(cè)特定基因控制特定性狀,如抗蟲(chóng)、抗旱等

----性狀水平的檢測(cè)檢測(cè)—鑒定——3.檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等2.檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA1.檢測(cè)受體細(xì)胞的染色體DNA上是否插入了目的基因(四)

目的基因的檢測(cè)與鑒定1.分子水平檢測(cè)目的基因DNA分子雜交檢測(cè)mRNA檢測(cè)表達(dá)的蛋白質(zhì)分子雜交抗原—抗體雜交PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)標(biāo)記基因標(biāo)記基因(四)

目的基因的檢測(cè)與鑒定(1)首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA；檢測(cè)目的基因:DNA分子雜交(2)將含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針；(3)

使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中?；蛱结?簡(jiǎn)稱探針，是一段帶有檢測(cè)標(biāo)記（同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑），且順序已知的，與目的基因互補(bǔ)核酸序列(DNA或RNA)。15N15N變性變性1.分子水平(四)

目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA:DNA分子雜交

用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA。1.分子水平(四)

目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)表達(dá)的蛋白質(zhì):抗原—抗體雜交15N15N變性變性DNA分子雜交基因探針待測(cè)DNA單鏈DNA或RNA片斷，帶有某種標(biāo)記，能與目標(biāo)DNA或RNA的一條鏈發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)。

抗原—抗體雜交分子雜交（2）方法:RNA分子雜交（3）方法:抗原—抗體雜交鑒定——抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲(chóng)，如蟲(chóng)吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說(shuō)明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲(chóng)吃后中毒死亡，則說(shuō)明攝入了抗蟲(chóng)基因并得到表達(dá)。2.個(gè)體水平(四)

目的基因的檢測(cè)與鑒定若不能表達(dá)，要對(duì)抗蟲(chóng)基因再進(jìn)行修飾。補(bǔ)充思考：在抗原-抗體雜交中，目的蛋白是作為抗原還是抗體？抗原轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法成功標(biāo)志抗蟲(chóng)植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物飼喂害蟲(chóng)（抗蟲(chóng)接種實(shí)驗(yàn)）害蟲(chóng)死亡病毒（菌）感染（抗病接種實(shí)驗(yàn)）未侵染上病斑鹽水澆灌正常生長(zhǎng)噴灑除草劑正常生長(zhǎng)提取細(xì)胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進(jìn)行功能活性比較功能、活性正常個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定具體有哪些做法？1.質(zhì)粒上的抗性基因在基因工程中的主要作用是(