微生物的選擇培養(yǎng)和計數-遼寧省錦州市義縣高年級中學人教版高中生物選擇性必修3課件

義縣高中劉占江微生物的選擇培養(yǎng)和計數高壓蒸汽滅菌液體培養(yǎng)基微生物的基本培養(yǎng)技術1、實驗室培養(yǎng)微生物條件1）提供微生物生長繁殖所需營養(yǎng)和環(huán)境條件—培養(yǎng)基2）確保其它微生物無法混入—無菌技術高壓蒸汽滅菌溫故知新：2、培養(yǎng)基的營養(yǎng)構成:碳源、氮源、水、無機鹽等1）碳源：無機碳源：CO2、CO32-、HCO3-有機碳源：葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物2）氮源：無機氮源：NH4＋、NO3-、NH3等有機氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等注：含C、H、O、N的有機物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源3）無機鹽：Ca、K、Mg為大量元素Zn、Cu、Mn、Co、Mo等微量元素類型適用范圍操作方法消毒滅菌較為溫和理化方法，殺死部分微生物（不包括芽孢、孢子）強烈的理化方法，殺死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法日常生活100℃煮沸5～6min巴氏消毒法不耐高溫的液體62～65℃煮30min或80-90℃煮30s-1min化學藥劑生物活體、水源等擦拭等,如用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源紫外線紫外線照射30min灼燒滅菌接種的金屬工具、接種時用的試管口或瓶口等直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒干熱滅菌耐高溫、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金屬用具等物品放入干熱滅菌箱,160～170℃加熱2～3h濕熱滅菌培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿等,生產和實驗室常用高壓蒸汽滅菌鍋內,100kPa,溫度121℃,15～30min無菌的方法：接種室、接種箱，超凈工作臺課題背景自然界中微生物數量繁多，種類龐雜，要想從中分離出需要的特定微生物并不容易，尤其當要分離的微生物在混合菌群中不是優(yōu)勢種群時，更難實現。稀釋涂布平板法呈現的雜菌群那么我們又如何達成這一目標呢？科學家們應用選擇性培養(yǎng)基解決了這一難題。二、微生物的選擇培養(yǎng)和計數（一）選擇培養(yǎng)基美國黃石國家公園的一個熱泉

1973年，科學家從美國黃石國家公園的熱泉中篩選出水生棲熱菌，進而提取出耐高溫的DNA聚合酶。

為什么水生棲熱菌能從熱泉中篩選出來呢？

實驗室微生物的篩選時，可人為提供有利于目的菌生長的條件（包括營養(yǎng)、溫度、pH等），同時抑制或阻止其他微生物生長。

在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱為選擇培養(yǎng)基。因為水生棲熱菌能在70-80℃的高溫條件下生存，而絕大多數微生物在此條件下不能生存。培養(yǎng)基中加氨芐青霉素具有氨芐青霉素抗性的菌落沒有氨芐青霉素抗性的細菌培養(yǎng)基應有菌落沒有氨芐青霉素抗性的細菌被淘汰怎樣選擇出抗氨芐青霉素能力的細菌?舉例1加入青霉素：不加氮源：不加含碳有機物：——分離出酵母菌、霉菌等真菌(青霉素能殺死細菌、放線菌)——分離出固氮菌

——分離出自養(yǎng)型微生物補充資料1-幾種選擇培養(yǎng)基舉例那么如果讓你分離土壤中分解尿素的細菌，你應該怎么設計呢？思考-討論選擇培養(yǎng)基配方的設計尿素的立體結構

尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化學性質穩(wěn)定，是現代農業(yè)生產中一種重要的氮肥。尿素被土壤中某些細菌分解成NH3,再被轉化為NO3-、NH4+等被植物吸收。這些細菌之所以能分解尿素，是因為能合成脲酶，來催化尿素分解。討論：1、你如何設計培養(yǎng)基配方，將土壤稀釋液中能分解尿素

的細菌分離出來？2、該培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基有哪些共同點和不同點？培養(yǎng)基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g瓊脂20.0g蒸餾水定容到1000mlKH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g瓊脂15.0g蒸餾水定容到1000ml配方一：培養(yǎng)細菌配方二：培養(yǎng)可以分解尿素的細菌

補充資料2-普通培養(yǎng)基與選擇培養(yǎng)基的比較1、從物理性質看此培養(yǎng)基屬于哪類？從用途上屬于哪類培養(yǎng)基？固體培養(yǎng)基配方二是以尿素作唯一氮源的選擇培養(yǎng)基2、此培養(yǎng)基中共有哪些成分？在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？碳源：配方二氮源：成分：碳源、氮源、水、無機鹽（二）微生物的選擇培養(yǎng)如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的細菌，還需對土壤菌液進行稀釋及科學的微生物數量測定方法---稀釋涂布平板法。2、實驗的具體操作：

2）土壤取樣從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌1）制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基1、稀釋涂布平板法是將菌液進行一系列梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。6支試管，分別加入9ml無菌水1ml1021ml1031ml1041ml1051ml1061ml1073）樣品梯度稀釋：微量移液器稀釋10倍菌液101土壤10g在火焰旁稱取土壤10g，加入90ml無菌水中，搖勻，制成稀釋10倍的土壤菌液。

分別取1ml上清液，加入盛有9ml無菌水的試管中，制成不同稀釋倍數的菌液。取6支試管，分別加入9ml無菌水。1、將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中滴2、取少量稀釋液（不超過0.1ml

），滴加到培養(yǎng)基表面灼3、將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃盡后，冷卻8-10s。涂4、用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時可轉動培養(yǎng)皿，使涂布均勻各梯度分別涂布3個平板1個不涂布作空白對照浸4）取樣涂布平板：放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)1～2d5）培養(yǎng)與觀察稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍空白對照恒溫培養(yǎng)箱（三）微生物的數量測定稀釋涂布平板法除用于分離微生物外，也常用于統(tǒng)計樣品中活菌數。在稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基上表面生長的一個單菌落來源于樣品稀釋液中的一個活菌，通過統(tǒng)計平板上的菌落數，可推測出樣品中大約有多少活菌。1、原理：2、計數原則：一般選擇菌落數在30—300的平板上進行計數。注意事項①為了保證結果準確，一般選擇菌落數在30—300的平板上進行計數。②為增強實驗說服力與準確性，設計實驗時，需要涂布至少三個平板作為重復組。③統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數目低。④分析實驗結果時，要考慮重復組結果是否接近，如果相差太大，意味著操作有誤，需重新實驗。實例分析1：甲同學做此實驗在稀釋倍數105獲得3個平板，菌落數分別是80、90、100，涂布平板時均使用0.1ml菌液，試計算每克土壤中可以分離尿素的細菌數目？3、計算：每克樣品中的菌落數＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數。（80+90+100）/30.1×105=9×107個

兩位同學用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數。從對應稀釋倍數為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結果。1、甲同學在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數為230。

2、乙同學在該濃度下涂布了A、B、C三個平板，統(tǒng)計的菌落數分別為21、

212、256，該同學以這三個平板上菌落數的平均值163作為統(tǒng)計結果。

你認為這兩位同學的作法正確嗎？如果有問題，錯在哪？

甲：沒有重復實驗（至少涂布3個平板）

乙：其中一個平板計數結果與其他兩個相差太大，操作過程可能出現了錯誤。實例分析2：1、顯微鏡直接計數：這種方法是利用特定細菌計數板或血細胞計數板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數量每毫升原液所含細菌數＝每小格平均細菌數×400×10000×稀釋倍數缺點：不能區(qū)分死菌與活菌不適于對運動細菌的計數（比例計數法）待測樣品等量的已知含量的紅細胞

混勻涂抹測定：

紅細胞數目細菌數目計算單位體積內的細菌數目

將含已知數目的紅細胞液體與待測的菌液按1：1均勻混合，在顯微鏡下數出各自的數目，然后求菌液中的細胞數目。細菌紅細胞2、顯微鏡直接計數是測定微生物的方法。

舉例：已知紅細胞濃度為M個/mL，從體積為NmL的大腸桿菌培養(yǎng)液中取出大腸桿菌液與紅細胞液等量均勻混合后，涂片，染色，鏡檢。在同一視野中發(fā)出有紅細胞W個，大腸桿菌Y個，求NmL大腸桿培養(yǎng)液中大腸桿菌的個數X是多少？X＝N×M×YW(個)觀察到的紅細胞平均數/觀察到的細菌平均數＝紅細胞含量/細菌含量公式思考-討論土壤中分解尿素的細菌的分離和計數尿素的立體結構課題目的1、從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌

2、統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌研究思路土壤取樣制備培養(yǎng)基樣品稀釋與取樣涂布微生物的培養(yǎng)與觀察1、土壤取樣1）取樣的位置：

土壤含有大量的微生物，，是微生物的天然培養(yǎng)基。細菌適宜在酸堿度接近

中性的潮濕土壤中生長，絕大多數的細菌分布距地表3～8cm的土壤層。2）取樣要求：先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。

2、制備培養(yǎng)基制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。3、樣品的稀釋測土壤中細菌數量，一般選用1x104

、1x105

和1x106倍的稀釋液進行平板培養(yǎng)。4、微生物的培養(yǎng)與觀察30-370C溫度下培養(yǎng)1-2d，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數。

3、操作提示2）無菌操作3）做好標記

本實驗使用的平板和試管比較多，為避免混淆，使用前要做好標記4）制定計劃對于耗時較長的生物實驗，要事先規(guī)劃時間，以便提高工作效率，在操作時更加有條不紊1）不要將過熱的涂布器放在盛有酒精的燒杯中，以免引燃酒精。a、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。b、應在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入

錐形瓶中，塞好棉塞。c、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。

結果分析與評價1、結合對照組，分析培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及