分子生物學實驗省公開課一等獎全國示范課微課金獎課件

分子生物學試驗中南民族大學生命科學學院試驗教學中心3月第1頁試驗一植物基因組DNA提取試驗二多聚酶鏈式反應(polymerasechainreaction,PCR)基因擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測試驗三植物總RNA提取試驗四蛋白質(zhì)印跡第2頁高等動物，高等植物基因組相當寵大，如人類細胞基因組由30億個堿基對組成，果蠅基因組有１．４×１０８個堿基對，水稻基因組有１．４×１０９個堿基對。真核細胞基因組中，約１萬－１．５萬個可表示結(jié)構基因，其它大量存在是調(diào)控序列和內(nèi)含子序列。能夠說某特定物種基因組，包含了該物種生長，發(fā)育，繁殖等各項生理活動幾乎全部信息量，因而對真核細胞基因組結(jié)構，組成，以及表示調(diào)控研究是至關主要，而研究起點就是要取得純度高－不含蛋白質(zhì)、糖類、酚、氯仿等污染；得率好－方便有足夠量用于分析；基因組相對完整－－斷裂基因組方便用于以后ＰＣＲ分析，RFLP分析，基因文庫構建，基因探測等研究。試驗一植物基因組DNA提取一.試驗目標及背景

第3頁真核細胞基因組在提取過程中普通有以下幾步，首先是機械法破細胞抽提；然后去除蛋白質(zhì)，糖類等細胞內(nèi)雜質(zhì)污染；最終純化出ＤＮＡ，因為真核細胞基因組較大，在操作中應注意動作輕柔，且在低溫下進行，以最大程度地降低機械和化學作用對ＤＮＡ剪切，從而取得相對完整ＤＮＡ。第4頁十二烷基肌酸鈉(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化銨(hexadyltrimethylammomumbromide，簡稱為CTAB)、十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecylsulfate，簡稱SDS)等離子型表面活性劑，能溶解細胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA得以游離出來。再加入苯酚和氯仿等有機溶劑，能使蛋白質(zhì)變性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很強，經(jīng)離心后即可從抽提液中除去細胞碎片和大部分蛋白質(zhì)。上清液中加入無水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物總DNA溶液。第5頁三、試驗材料水稻幼葉四、主要試劑配方2%CTAB抽提緩沖溶液:CTAB4gNaCl16.364g1MTris-HCl20ml(PH8.0)0.5MEDTA8ml，先用70mlddH2O溶解,再定容至200ml滅菌,冷卻后0.2-1%2-巰基乙醇（400ul）氯仿-異戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml異戊醇，搖勻即可。第6頁五、試驗步驟1.DNA提取

（1）2%CTAB抽提緩沖液在65℃水浴中預熱。（2）取少許葉片（約1g）置于研缽中，用液氮磨至粉狀；（3）加入700ul2%CTAB抽提緩沖液，輕輕攪動；

（4）將磨碎液分倒入1.5ml滅菌離心管中，磨碎液高度約占管三分之二；（5）置于65℃水浴槽或恒溫箱中，每隔10min輕輕搖動，40min后取出；（6）冷卻2min后，加入氯仿-異戊醇（24：1）至滿管，猛烈振蕩2~3min，使二者混合均勻；（7）放入離心機中10000rpm離心10min，與此同時，將600μl異丙醇加入另一新滅菌離心管中；第7頁（8）10000rpm離心1min后，移液器輕輕地吸收上清夜，轉(zhuǎn)入含有異丙醇離心管內(nèi)，將離心管慢慢上下?lián)u動30sec，使異丙醇與水層充分混合至能見到DNA絮狀物；

（10）60sec后，直立離心管，加入720μl75%乙醇及80μl5M醋酸鈉，輕輕轉(zhuǎn)動，用手指彈管尖，使沉淀與管底DNA塊狀物浮游于液體中；（9）10000rpm離心1min后，馬上倒掉液體，注意勿將白色DNA沉淀倒出，將離心管倒立于鋪開紙巾上；第8頁（11）放置30min，使DNA塊狀物不純物溶解；（12）10000rpm離心1min后，倒掉液體，再加入800μl75%乙醇，將DNA再洗30min；（13）10000rpm離心30sec后，馬上倒掉液體，將離心管倒立于鋪開紙巾上；數(shù)分鐘后，直立離心管，干燥DNA（自然風干或用風筒吹干）；（14）加入50μl0.5×TE(含RNase)緩沖液，使DNA溶解，置于37℃恒溫箱約15h，使RNA消解；（15）置于-20℃保留、備用。第9頁2.DNA質(zhì)量檢測瓊脂糖電泳檢測，

12345HindIII總DNA第10頁六、注意事項

（1）葉片磨得越細越好。（2）移液器使用。（3）因為植物細胞中含有大量DNA酶，所以，除在抽提液中加入EDTA抑制酶活性外，第一步操作應快速，以免組織解凍，造成細胞裂解，釋放出DNA酶，使DNA降解。第11頁1.本試驗中所用到各試劑作用是什么?CTAB,氯仿,異丙醇,75%乙醇,EDTA2．提取基因組DNA方法有哪些？各有何優(yōu)缺點？七、問題第12頁一．試驗目標及背景

多聚酶鏈式反應(polymerasechainreaction)簡稱ＰＣＲ技術，是８０年代中期發(fā)展起來一個體外擴增特異ＤＮＡ片段技術。此法操作簡便，可在短時間內(nèi)在試管中取得數(shù)百萬個特異目標ＤＮＡ序列拷貝，ＰＣＲ技術即使問世僅多年時間，但它已快速滲透到分子生物學各個領域，引發(fā)了生物技術發(fā)展一次革命，當前它在分子克隆，目標基礎檢測，遺傳病基因診療，法醫(yī)學，考古學等方面得到了廣泛應用。試驗二PCR試驗技術第13頁ＰＣＲ技術實際上是在模板ＤＮＡ，引物和４種脫氧核苷酸存在條件下依賴于ＤＮＡ聚合酶酶促合反應，ＰＣＲ技術特異性取決于引物和模板ＤＮＡ結(jié)合特異性。反應分三步：①變性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（extension），反應過程見下列圖。第14頁第15頁模板ＤＮＡ在９４℃條件下變性形成單鏈；在５５℃條件下依據(jù)目標基因兩側(cè)序列設計引物分別與其同源序列結(jié)合；７０℃下在耐熱性ＤＮＡ聚合酶Taq酶催化下，在４種dNTP存在條件下延伸形成雙鏈。完成一次循環(huán)。接著又以新合成ＤＮＡ為模板進行一樣反應，如次往復循環(huán)３０次，因為每次循環(huán)目標ＤＮＡ都以２n次冪擴增，３０次循環(huán)后目標DNA量增加１０６－７倍。成功ＰＣＲ反應要求反應有很好特異性，和相當擴增效率。要達此目標ＰＣＲ反應要注意以下問題：二、PCR反應及步驟第16頁１．ＤＮＡ模板：反應中ＤＮＡ量在５０ng～２００ng左右。且ＤＮＡ純度較高，以增加反應特異性。２．dNTP:反應體系中達100μM～200μM。３．Mg2+：Mg2+是Taq酶輔基濃度在2.0mM左右，濃度太低Taq酶活力降低；太高反應特異性降低。４．引物：依據(jù)目標基因兩側(cè)特定序列設計。引物約20堿基左右；Ｇ＋Ｃ含量在40％－70％之間；引物內(nèi)部不能有回該序列；引物３’端不能互補。５．Taq酶：它是從嗜熱桿菌中提取耐熱性ＤＮＡ聚合酶，在９５℃時３０分鐘還有５０％活力。第17頁６．變性溫度：在９３～９５℃之間使模板充分變性。７．復性溫度：５５℃左右，此溫度選擇是依據(jù)模板和引物配對結(jié)合強弱而定，它是反應特異性決定原因。８．延伸溫度：７０～７２℃左右，為Taq酶最適反應溫度。第18頁１０×buffer:500mMKCl100mMTris-HCl(pH9.0)0.1%明膠1%TritonX-100MgCl22.5mM４×dNTP:1mM引物：TGGCCGAGCTG5.0uM模板：20ng/μlTaq酶：5u/μlPCR儀，凝膠成像系統(tǒng)，電泳系統(tǒng)第19頁１．向無菌500μlEppendorf管中依次加入以下溶液：反應物體積10×buffer2.5μl4×dNTP(1mM)2.5μlMgCl2(25mM)2.5μl無菌水10.5μlTaq酶(1U/ul)1μl引物2μl模板ＤＮＡ(20ng)4μl總體積25μl第20頁2．反應體系混勻，離心3．在ＰＣＲ儀上按以下方式循環(huán)94℃變性１分鐘36℃退火１分鐘72℃延伸２分鐘經(jīng)過40個循環(huán)4．72℃延伸反應7分鐘。5．取20μl反應液加4μlLoadingbuffer在6.1.5％瓊脂糖凝膠上120伏，電泳2小時。7.在凝膠成像系統(tǒng)上觀察統(tǒng)計試驗結(jié)

第21頁三、PCR電泳檢測第22頁１．統(tǒng)計試驗結(jié)果，并估測ＰＣＲ擴增產(chǎn)物分子量。四、問題與討論：１．簡述ＰＣＲ基本原理２．進行一次成功ＰＣＲ反應順注意哪些問題。第23頁一、試驗目標經(jīng)過本試驗學習從植物組織中提取RNA方法。二、試驗原理RNA是一類極易降解分子，要得到完整RNA，必須最大程度地抑制提取過程中內(nèi)源性及外源性核糖核酸酶對RNA降解。高濃度強變性劑異硫氰酸胍，可溶解蛋白質(zhì)，破壞細胞結(jié)構，使核蛋白與核酸分離，失活RNA酶，所以RNA從細胞中釋放出來時不被降解。細胞裂解后，除了RNA，還有DNA、蛋白質(zhì)和細胞碎片，經(jīng)過酚、氯仿等有機溶劑處理得到純化、均一總RNA。試驗三RNA提取第24頁三、儀器、藥品與試劑配方(一)

儀器1．

低溫離心機2．

分光光度計3．

瓊脂糖膠電泳系統(tǒng)，用前先用1%NaOH溶液浸泡過夜，之后再用DEPC水浸泡沖洗。4．

高壓滅菌鍋5．

研缽、剪刀、一次性手套等第25頁

一、目標和內(nèi)容目標：掌握SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術，掌握蛋白質(zhì)印跡技術基本原理和方法。內(nèi)容：本試驗采取雞卵清白蛋白為材料，對此蛋白質(zhì)進行SDS—PAGE電泳后，用電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜上，將預先制備好雞蛋清免疫而成抗血清，作為初級抗體，用辣根過氧化物酶標識羊抗兔為第二抗體，在底物存在下，經(jīng)過顯色電泳條帶，測定蛋白質(zhì)性質(zhì)。試驗四蛋白質(zhì)印跡技術（Westernblotting）第26頁二、主要儀器、材料和試劑1、儀器和材料蛋白質(zhì)電泳槽，蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移槽一套（六一儀器廠），硝酸纖維素濾膜（黃巖化工廠），直徑為20cm及10cm玻璃平皿各一個，剪刀、鑷子、刀片、一次性手套，普通濾紙，雞卵清白蛋白，雞卵清免疫兔抗血清，辣根過氧化酶-羊抗兔抗體（1：500稀釋），四氯奈酚或者二氨基聯(lián)苯胺，過氧化氫。第27頁2、試劑（1）TBS要Tris-HClNaCl緩沖液：20mml/LTris-HCl，500mmol/LNaCl，PH：7.5。（2）TBS要Tris-HClNaCl，Tween-20緩沖液：20mmol/LTris-HCl，500mmol/LNaCl，0.05%Tween-20，PH：7.5。（3）抗體溶液：牛血清白蛋白質(zhì)-TBS溶液，1%BSA-TBS。（4）Blocking溶液（封閉液）：10%牛血清-TBS。（5）底物溶液（0.5mg/mL）：25mg四氯奈酚，加5mL甲醇溶解后，加10ml在30℃水浴中溫浴TBS溶液，混合后再加50mlTBS，然后再加入10μl30%過氧化氫馬上使用。（6）轉(zhuǎn)移緩沖液：25mmol/LTris，192mmol/LGlycine20%MethnolL，pH8.3.（7）去離子雙蒸水。第28頁1.焦碳酸二乙酯(DEPC)2.嗎啉代丙烷磺酸(MOPS)3.異硫氰酸胍4.醋酸鈉(NaAc)5.氯仿6.苯酚7.甲醛8.乙醇9.乙二胺四乙酸(EDTA)10.瓊脂糖11.異丙醇第29頁(三)試劑配方1.0.1%DEPC水0.1mlDEPC加入100ml三蒸水中，振搖過夜，再濕熱滅菌。2.2mol/LNaAc、0.5mol/LEDTA、4mol/L異硫氰酸胍、4mol/LLiCl等均用DEPC水配制。3.5ΧMOPS電泳緩沖液(pH7.0)MOPS0.1mol/LNaAc40mmol/LEDTA5mmol/L第30頁四、試驗步驟（一）

總RNA提?。ǚ桨敢唬?.試驗前10天左右播種水稻種子，在3-4葉期，剪取1.2g幼葉。放入研缽，在液氮中研磨成粉末狀，移入10mL離心管。加入4mol/L異硫氰酸胍4mL苯酚3mL2mol/LNaAc(pH4.8)0.3mL氯仿0.6mL混勻，冰浴放置30min。2.4℃，8000r/min，離心13min。3.棄沉淀，取上清至另一潔凈無菌離心管中。4.加入2倍體積無水乙醇，-70℃，0.5h。5.4℃，8000r/min，離心13min。第31頁三、操作操作步驟1、制備兔抗雞蛋清白蛋白血清將雞蛋清與生理鹽水1：1混勻后，與石蠟有完全佐劑和不完全佐劑研磨而成抗原，選擇兩只家兔，皮下多點注射3次，每七天一次，加強一次，每次四個點，每點0.2ml抗原，5周后頸動脈放血、取血清作為WesternBlotting第一抗體。第32頁6.棄上清，在沉淀中加入1mL4mol/LLiCl，使其溶解。7.移入1.5mL離心管中，冰浴2h。8.4℃，13000r/min，離心15min。