魚(yú)類(lèi)生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)2013

PAGEPAGE13魚(yú)類(lèi)生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)動(dòng)物科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院2013年10月實(shí)驗(yàn)一、坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本制備目的學(xué)習(xí)生理學(xué)實(shí)驗(yàn)基本的組織分離技術(shù)；學(xué)習(xí)和掌握制備蛙類(lèi)坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本的方法；了解刺激的種類(lèi)。原理蛙類(lèi)的一些基本生命活動(dòng)和生理功能與恒溫動(dòng)物相似，若將蛙的神經(jīng)-肌肉標(biāo)本放在任氏液中，其興奮性在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)可保持不變。若給神經(jīng)或肌肉一次適宜刺激，可在神經(jīng)和肌肉上產(chǎn)生一個(gè)動(dòng)作電位，肉眼可看到肌肉收縮和舒張一次，表明神經(jīng)和肌肉產(chǎn)生了一次興奮。在生理學(xué)實(shí)驗(yàn)中常利用蛙的坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本研究神經(jīng)、肌肉的興奮、興奮性；刺激與反應(yīng)的規(guī)律和肌肉收縮的特征等，制備坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本是生理學(xué)實(shí)驗(yàn)的一項(xiàng)基本操作技術(shù)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與用品蟾蜍或蛙、任氏液、食鹽、1%H2SO4濾紙、普通剪刀、手術(shù)剪、眼科鑷（或尖頭無(wú)齒鑷）、金屬探針（解剖針）、玻璃分針、蛙板（或玻璃板）、蛙釘、細(xì)線、培養(yǎng)皿、滴管、鋅銅弓（或電子刺激器）、酒精燈。實(shí)驗(yàn)步驟與項(xiàng)目破壞腦、脊髓

取蟾蜍一只，用自來(lái)水沖洗干凈（勿用手搓）。左手握住蟾蜍，使其背部向上，用大拇指或食指使頭前俯(以頭顱后緣稍稍拱起為宜)。右手持探針由頭顱后緣的枕骨大孔處垂直刺入椎管（圖）。然后將探針改向前刺入顱腔內(nèi)，左右攪動(dòng)探針2～3次，搗毀腦組織。如果探針在顱腔內(nèi)，應(yīng)有碰及顱底骨的感覺(jué)。再將探針退回至枕骨大孔，使針尖轉(zhuǎn)向尾端，捻動(dòng)探針使其刺入椎管，搗毀脊髓。此時(shí)應(yīng)注意將脊柱保持平直。針進(jìn)入椎管的感覺(jué)是，進(jìn)針時(shí)有一定的阻力，而且隨著進(jìn)針蟾蜍出現(xiàn)下肢僵直或尿失禁現(xiàn)象。若腦和脊髓破壞完全，蟾蜍下頜呼吸運(yùn)動(dòng)消失,四肢完全松軟，失去一切反射活動(dòng)。此時(shí)可將探針?lè)聪蚰韯?dòng)，退出椎管。如蟾蜍仍有反射活動(dòng)，表示腦和脊髓破壞不徹底，應(yīng)重新破壞。

2.剪除軀干上部、皮膚及內(nèi)臟

用左手捏住蟾蜍的脊柱，右手持粗剪刀在前肢腋窩處連同皮膚、腹肌、脊柱一并剪斷，然后左手握住蟾蜍的后肢，緊靠脊柱兩側(cè)將腹壁及內(nèi)臟剪去(注意避開(kāi)坐骨神經(jīng)),并剪去肛門(mén)周?chē)钠つw，留下脊柱和后肢。3.剝皮

一只手捏住脊柱的斷端（注意不要捏住脊柱兩側(cè)的神經(jīng)），另一只手捏住其皮膚的邊緣,向下剝?nèi)ト亢笾钠つw（圖5.1-2）。將標(biāo)本放在干凈的任氏液中。將手及使用過(guò)的探針、剪刀全部沖洗干凈。

4.分離兩腿

用鑷子取出標(biāo)本,左手捏住脊柱斷端,使標(biāo)本背面朝上，右手用粗剪刀剪去突出的骶骨（也可不進(jìn)行此步）。然后將脊柱腹側(cè)向上，左手的兩個(gè)手指捏住脊柱斷端的橫突，另一手指將兩后肢擔(dān)起，形成一個(gè)平面。此時(shí)用粗剪刀沿正中線將脊柱盆骨分為兩半(注意，勿傷坐骨神經(jīng))。將一半后肢標(biāo)本置于盛有任氏液中備用,另一半放在蛙板上進(jìn)行下列操作。5.辯認(rèn)蛙后肢的主要肌肉，蛙類(lèi)的坐骨神經(jīng)是由第7、8、9對(duì)脊神經(jīng)從相對(duì)應(yīng)的椎間孔穿出匯合而成，行走于脊柱的兩側(cè)，到尾端（肛門(mén)處）繞過(guò)坐骨聯(lián)合，到達(dá)后肢背側(cè)，行走于梨狀肌下的股二頭肌和半膜肌之間的坐骨神經(jīng)溝內(nèi)，到達(dá)膝關(guān)節(jié)腘窩處有分支進(jìn)入腓腸?。▓D5.1-3）。

6.游離坐骨神經(jīng)和腓腸肌

用蛙釘或左手的兩個(gè)手指將標(biāo)本繃直、固定。先在腹腔面用玻璃分針沿脊柱游離坐骨神經(jīng),然后在標(biāo)本的背側(cè)于股二頭肌與半膜肌的肌肉縫內(nèi)將坐骨神經(jīng)與周邊的結(jié)締組織分離直到腘窩，但不要傷及神經(jīng)，其分支待以后用手術(shù)剪剪斷。同樣用玻璃分針將腓腸肌與其下的結(jié)締組織分離并在其跟腱處穿線、結(jié)扎。7.剪去其它不用的組織

操作從脊柱向小腿方向進(jìn)行。（1）剪去多余的脊柱和肌肉

將后肢標(biāo)本腹面向上，將坐骨神經(jīng)連同2～3節(jié)脊椎用粗剪刀從脊柱上剪下來(lái)。再將標(biāo)本背面向上，用鑷子輕輕提起脊椎，自上而下剪去支配腓腸肌以外的神經(jīng)分支，直至腘窩（圖5.1-4(A)），并搭放在腓腸肌上。沿膝關(guān)節(jié)剪去股骨周?chē)募∪猓⒐晒枪蝺?，用粗剪刀剪去股骨上端?/3（保留2/3），制成坐骨神經(jīng)-小腿的標(biāo)本。（2）完成坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本

將脊椎和坐骨神經(jīng)從腓腸肌上取下，提起腓腸肌的結(jié)扎線剪斷跟腱。用粗剪剪去膝關(guān)節(jié)以下部位，便制成了坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本（圖5.1-4(B)）。8.檢驗(yàn)標(biāo)本

用鑷子夾持坐骨神經(jīng)中樞端,如腓腸肌發(fā)生迅速而明顯的收縮，說(shuō)明標(biāo)本的興奮性良好。標(biāo)本浸入盛有任氏液的培養(yǎng)皿中備用。然后再依次用熱玻棒、食鹽（或1%H2SO4濾紙）刺激坐骨神經(jīng)中樞端（或肌肉），觀察肌肉收縮有何變化?如果放上食鹽肌肉無(wú)動(dòng)靜,用任氏液將鹽沖洗掉,再觀察沖洗過(guò)程中肌肉收縮有何變化?

注意事項(xiàng)避免蟾蜍體表毒液和血液污染標(biāo)本，壓擠、損傷和用力牽拉標(biāo)本，不可用金屬器械觸碰神經(jīng)干。在操作過(guò)程中，應(yīng)給神經(jīng)和肌肉滴加任氏液，防止表面干燥，以免影響標(biāo)本的興奮性。標(biāo)本制成后須放在任氏液中浸泡數(shù)分鐘,使標(biāo)本興奮性穩(wěn)定,再開(kāi)始實(shí)驗(yàn)效果會(huì)較好。熱玻棒的溫度防止過(guò)高,以免燙傷標(biāo)本。思考題用各種刺激檢驗(yàn)標(biāo)本興奮性時(shí)，為什么要從中樞端開(kāi)始？刺激有幾種形式?如何解釋對(duì)食鹽的不同處理對(duì)肌肉收縮的影響?實(shí)驗(yàn)二、反射弧的分析目的分析反射弧的組成并證明反射活動(dòng)的完成有賴(lài)于反射弧的完整存在。原理反射活動(dòng)是依靠反射弧實(shí)現(xiàn)的。反射弧包括感受器、傳入神經(jīng)、神經(jīng)中樞、傳出神經(jīng)和效應(yīng)器五部分。反射弧的結(jié)構(gòu)和功能的完整是實(shí)現(xiàn)反射活動(dòng)的必要條件。反射弧的任何一部分受到破壞，反射活動(dòng)將不能實(shí)現(xiàn)。反射弧示意圖實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與用品蛙（或蟾蜍），蛙類(lèi)手術(shù)器械，支架，玻棒，燒杯，玻璃皿，紗布，線，濾紙，棉花，0.5%、1%硫酸，1%可卡因。實(shí)驗(yàn)步驟與項(xiàng)目取一只蛙，破壞大腦，但保留脊髓，即做成脊蛙標(biāo)本。然后用肌夾夾住蛙的下頜（或用大頭針鉤住下頜），并將脊蛙懸掛在支架上。待其安靜后進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。用燒杯盛0.5%硫酸，分別刺激蛙兩后肢趾端，觀察有無(wú)反應(yīng)？為什么？待出現(xiàn)反應(yīng)后，立即用清水洗凈腳趾，并用紗布擦干。2、在蛙左后肢踝關(guān)節(jié)上方，將皮膚作一環(huán)形切口，剝?nèi)∏锌谝韵缕つw（注意除凈趾尖皮膚），再用0.5%硫酸刺激該肢趾端，有無(wú)反應(yīng)？為什么？3、剪開(kāi)右側(cè)大腿背側(cè)的皮膚，再股二頭肌和半膜肌之間分離出坐骨神經(jīng)干，在坐骨神經(jīng)干放一浸過(guò)1%可卡因的小棉球，然后每隔數(shù)秒鐘用0.5%的硫酸刺激該后肢腳趾，直到不引起反應(yīng)為止，為什么？4、當(dāng)右后肢不再出現(xiàn)收縮反應(yīng)時(shí)，立即將浸過(guò)1%硫酸的濾紙片貼在該后肢軀干部皮膚上，該后肢是否仍然出現(xiàn)反應(yīng)？為什么？每隔數(shù)秒同樣刺激一次，直到不能引起右后肢反應(yīng)為止。為什么？5、用蛙針破壞脊髓，再刺激蛙身體的任何部位，有無(wú)反應(yīng)？為什么？注意事項(xiàng)?毀腦時(shí)不可傷及脊髓，以免破壞脊髓反射中樞。?分離坐骨神經(jīng)應(yīng)盡量向上，并盡量剪斷與其相連的分支。?每次酸刺激后應(yīng)立即用清水洗凈腳趾，并用紗布揩干。?剝脫腳趾皮膚要完全，若剩留少量皮膚會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。注坐骨神經(jīng)干中包括傳入神經(jīng)纖維和傳出神經(jīng)纖維。由于傳出神經(jīng)纖維較粗，故其麻醉所需時(shí)間較傳出神經(jīng)纖維為長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)三、凝血時(shí)間的測(cè)定目的學(xué)習(xí)凝血時(shí)間的測(cè)定方法。原理血液流出血管后，受到刺激的血小板就會(huì)釋放出一系列凝血因子，使血中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成網(wǎng)狀的纖維蛋白，血液發(fā)生凝固。測(cè)定凝血時(shí)間可反映血液本身出凝血因子是否缺乏或減少。本實(shí)驗(yàn)用魚(yú)作為實(shí)驗(yàn)材料比常規(guī)的家兔和鼠所用儀器要少，費(fèi)用低，實(shí)驗(yàn)控制更易。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與用品150

g重的鯉魚(yú)，注射器，玻片，尖針，秒表。實(shí)驗(yàn)步驟與項(xiàng)目

取血方法：將魚(yú)用濕布包住，側(cè)臥于木板上，在魚(yú)尾部（腹鰭和尾鰭之間）側(cè)線下方用手去除少許鱗片，將注射器在側(cè)線下方1～2

mm處垂直插入肌肉，碰到脊椎骨后，稍往下方移動(dòng)，插入尾靜脈內(nèi)，輕輕抽取注射器，讓血在負(fù)壓作用自然流入注射器內(nèi)。2、凝血時(shí)間觀察：將注射器內(nèi)的血小心注在事先準(zhǔn)血好的玻片上，記下時(shí)間，每隔30

s用針尖挑血一次，直至挑起細(xì)纖維血絲為止。從開(kāi)始出血到挑出細(xì)纖維血絲的時(shí)間即為凝血時(shí)間。注意事項(xiàng)

濕布包魚(yú)時(shí)僅將身體部位包住，不要包到鰓，以免影響?hù)~(yú)呼吸；如一時(shí)抽不出血可輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)注射器，直至血被抽出為止；針尖挑血應(yīng)向一個(gè)方向直挑，不可多個(gè)方向挑動(dòng)或挑動(dòng)次數(shù)過(guò)多，以免造成破壞纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，造成不凝血的假象。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的凝血時(shí)間。并對(duì)全班的結(jié)果加以統(tǒng)計(jì)，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。討論血液凝固對(duì)機(jī)體的生理意義。

實(shí)驗(yàn)四、影響血液凝固的因素目的以血液凝固時(shí)間作為指標(biāo)，了解對(duì)血液凝固影響的因素，加深對(duì)生理止血過(guò)程的理解。原理

血液凝固是一個(gè)酶的有限水解激活過(guò)程，在此過(guò)程中有多種凝血因子參與。根據(jù)凝血過(guò)程起動(dòng)時(shí)激活因子來(lái)源不同，可將血液凝固分為內(nèi)源性激活途徑和外源性激活途徑。內(nèi)源性激活途徑是指參與血液凝固的所有凝血因子在血漿中，外源性激活途徑是指受損的組織中的組織因子進(jìn)入血管后，與血管內(nèi)的凝血因子共同作用而啟動(dòng)的激活過(guò)程。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與用品雞、2%草酸鉀溶液、EDTA-Na，生理鹽水，液狀石蠟、注射器，試管6支、小燒杯2個(gè)、試管架,竹簽1束(或細(xì)試管刷)實(shí)驗(yàn)步驟與項(xiàng)目

取血方法：將雞保定，側(cè)臥于木板上，打開(kāi)翅膀，找到翼靜脈，酒精棉球消毒，從靜脈的下部?jī)A斜進(jìn)針，插入靜脈內(nèi)，回血后，輕輕抽取注射器，讓血在負(fù)壓作用自然流入注射器內(nèi)。2、試管準(zhǔn)備好試管1

不加任何處理（對(duì)照管）試管2

用液狀石蠟潤(rùn)滑整個(gè)試管內(nèi)表面試管3

放少許棉花試管4

置于有冰塊的小燒杯中試管5

EDTA1滴試管6

加草酸鉀1～2

ml每管加入血液2

ml。將多余的血盛于小燒杯中，并不斷用竹簽攪動(dòng)直至纖維蛋白形成。記錄凝血時(shí)間

每個(gè)試管加血2

ml后，即刻開(kāi)始計(jì)時(shí)，每隔壁15

s

傾斜一次，觀察血液是否凝固，至血液成為凝膠狀不再流動(dòng)為止，記錄所經(jīng)歷的時(shí)間。5、6、7號(hào)試管加入血液后，用拇指蓋住試管口將試管顛倒兩次，使血液與藥物混合。5.如果加EDTA和草酸鉀的試管不出現(xiàn)血凝,可再向兩管內(nèi)分別加入0.025

mol?L-1的CaCl2溶容液2～3滴,觀察血液是否發(fā)生凝固?注意事項(xiàng)采血的過(guò)程盡量要快，以減少計(jì)時(shí)的誤差。對(duì)比實(shí)驗(yàn)的采血時(shí)間要緊接著進(jìn)行。判斷凝血的標(biāo)準(zhǔn)要力求一致。一般以?xún)A斜試管達(dá)45o時(shí)，試管內(nèi)血液不見(jiàn)流動(dòng)為準(zhǔn)。每支試管口徑大小及采血量要相對(duì)一致，不可相差太大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果將實(shí)驗(yàn)結(jié)果及各種條件下的凝血時(shí)間按表填寫(xiě),并進(jìn)行比較、分析解釋產(chǎn)生差異的原因。實(shí)驗(yàn)管號(hào)實(shí)驗(yàn)處理凝血時(shí)間1不加任何處理2用液體石蠟潤(rùn)滑試管內(nèi)表面3放少許棉花4置于有冰塊的燒杯中5加草酸鉀1ml～2mL6EDTA1滴實(shí)驗(yàn)五、胃腸運(yùn)動(dòng)的直接觀察目的觀察動(dòng)物在麻醉情況下的胃腸活動(dòng)及其影響因素，原理胃腸平滑肌具有自動(dòng)節(jié)律性活動(dòng)。胃的運(yùn)動(dòng)有蠕動(dòng)和緊張性收縮；腸的運(yùn)動(dòng)有蠕動(dòng)、分節(jié)運(yùn)動(dòng)和擺動(dòng)等。在正常機(jī)體內(nèi)，胃腸運(yùn)動(dòng)受神經(jīng)的體液因素的調(diào)節(jié)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與用品喂飽的兔，手術(shù)臺(tái)，麻醉藥，常用手術(shù)器械，電刺激器，臺(tái)氏液，臉盆。0.01%乙酰膽堿，0.1%腎上腺素，0.1%阿托品。實(shí)驗(yàn)步驟與項(xiàng)目1、將兔麻醉仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，剪去頸部及腹部背毛。切開(kāi)頸部皮膚，分離一側(cè)迷走神經(jīng)，于其下穿一線備用。剖開(kāi)腹腔，在腎上腺附近找出左側(cè)內(nèi)臟大神經(jīng)，亦于其下穿一線備用。將兔體浸入盛有37℃2、觀察正常胃腸運(yùn)動(dòng)的形式和頻率。3、以中等強(qiáng)度的感應(yīng)電流刺激一側(cè)迷走神經(jīng)離中端，胃腸運(yùn)動(dòng)有何變化？為什么？4、刺激內(nèi)臟大神經(jīng)，胃腸運(yùn)動(dòng)有何變化？切斷內(nèi)臟大神經(jīng)，胃腸運(yùn)動(dòng)又有何變化？為什么？5、用鑷子夾小腸任何一處，觀察有何現(xiàn)象發(fā)生？為什么？6、在小腸上直接滴加0.01%乙酰膽堿數(shù)滴，胃腸運(yùn)動(dòng)有何變化？沖去藥物作用后，再滴加0.1%腎上腺素?cái)?shù)滴，胃腸運(yùn)動(dòng)又有何變化？為什么？思考題胃腸運(yùn)動(dòng)有哪些形式？并說(shuō)明其生理作用。實(shí)驗(yàn)六、滲透壓對(duì)小腸吸收的影響目的了解小腸吸收與腸內(nèi)容物滲透壓之間的關(guān)系。原理小腸是消化產(chǎn)物吸收的主要部位。腸內(nèi)容物滲透壓的大小是制約小腸吸收的因素，在一定范圍內(nèi)，腸內(nèi)容物濃度愈大，吸收愈慢；濃度過(guò)高時(shí)，則出現(xiàn)反滲透現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與用品兔，手術(shù)臺(tái)，麻醉藥，常用手術(shù)器械，絲線，10mL注射器，3%、0.9%和0.3%NaCL溶液。實(shí)驗(yàn)步驟與方法將兔麻醉仰臥固定，剖開(kāi)腹腔，拉出空腸約18cm，輕輕地移去其中的內(nèi)容物，再用絲線結(jié)扎為等長(zhǎng)的A、B、C三段。在A腸段中注入3%NaCL溶液5mL；在B腸段中注入0.9%NaCL溶液5mL；在C腸段中注入0.3%NaCL溶液5mL。然后將各腸段全部放回腹腔中，經(jīng)30分鐘以上，觀察A、B、C三段腸段內(nèi)溶液被吸收的程度有何不同，為什么？實(shí)驗(yàn)七、影響尿生成的若干因素目的了解對(duì)尿生成的若干影響因素。原理尿的生成過(guò)程包括腎小球的濾過(guò)，腎小管與集合管的重吸收和分泌。凡對(duì)這些過(guò)程有影響的因素都可影響尿的生成。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與用品兔，手術(shù)臺(tái)，常用手術(shù)器械，電刺激器，塑料管，膀胱套管，20%葡萄糖，10%Na2SO4或12%尿素，生理鹽水，0.1%腎上腺素，垂體后葉素，5%阿拉伯膠。實(shí)驗(yàn)步驟與項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)前給兔足夠飲水或喂以多汁飼料。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將兔麻醉仰臥保定在手術(shù)臺(tái)上。在下腹部靠近恥骨聯(lián)合前緣，沿腹部正中線切開(kāi)腹壁，暴露膀胱，輕輕將拉出腹腔。在膀胱底部找出一側(cè)輸尿管，在輸尿管的下面穿一細(xì)線備用。在輸尿管上剪一小口，由小口朝腎臟方向插入一根充滿(mǎn)生理鹽水的塑料管，一備用線結(jié)扎固定。塑料管的另一端對(duì)準(zhǔn)記滴器的受滴器，以便記滴?；蛘咴诎螂赘姑嬲邢茸骱砂p合，在縫合圈的中心剪一小口，插入膀胱套管，然后收緊縫線，固定膀胱套管，在套管的另一端連接塑料管，另外，由頸部找出右側(cè)迷走神經(jīng)，并穿線備用，進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。計(jì)數(shù)5-10分鐘內(nèi)尿的正常分泌滴數(shù)。靜注20%葡萄糖5mL，尿量有何變化？為什么？待尿分泌恢復(fù)正常后，再進(jìn)行下項(xiàng)實(shí)驗(yàn)（以下同）。剪斷右側(cè)迷走神經(jīng)，以中等強(qiáng)度的電流刺