PikoReal使用培訓(xùn)-致病菌檢測.ppt

1、皮科真熒光定量PCR使用訓(xùn)練-病原菌檢測內(nèi)容：1、熒光定量PCR的基本原理介紹2、皮科學(xué)功能介紹3、病原菌檢測實(shí)驗(yàn)和結(jié)果分析、PCR和定量PCR 基本原理介紹、生命遺傳物質(zhì)DNA (RNA的少數(shù)種類)是各種基本排列順序不同的生物的特定，中心定律，堿基對(duì)原則，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 聚合酶鏈反應(yīng)，in vitro DNA復(fù)制PCR反應(yīng)in vitro RNA逆轉(zhuǎn)錄是CDNA RT- PCR反應(yīng)，通過PCR或RT- PCR反應(yīng)下游循環(huán)熱循環(huán)提供熱循環(huán)環(huán)境的裝置熱循環(huán)(PCR儀表)、temperature、time、cycle1、cycle2、PCR的基本原理、模板(DNA or RNA DNA聚合

2、酶，胃，PCR反應(yīng)，PCR的基本原理，PCR實(shí)驗(yàn)流程圖也為： b，PCR產(chǎn)品電泳，EB染色，兩個(gè)產(chǎn)品，兩個(gè)特定引物放大的片段，多個(gè)產(chǎn)品， 繼續(xù)開發(fā)幾個(gè)重要應(yīng)用領(lǐng)域的新應(yīng)用領(lǐng)域：科學(xué)研究和診斷法醫(yī)鑒定食品檢驗(yàn)、PCR應(yīng)用、PCR技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)、缺點(diǎn)：擴(kuò)增和檢測分離使用熒光染料EB檢測DNA毒性實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果比較性通量過低、放大、檢測、PCR技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)、缺點(diǎn)： 相同的模板在相同的PCR設(shè)備下重復(fù)96次增強(qiáng)放大曲線，PCR反應(yīng)進(jìn)入平臺(tái)，合成新鏈的原料不足，酶的活性下降，新DNA的數(shù)量緩慢增加，最終停止生長。、熒光定量PCR 基本原理熒光染料和探針應(yīng)用簡介、光源、熒光定量PCR 基本原理、熱循環(huán)、探

3、測器、實(shí)時(shí)檢測每個(gè)循環(huán)的PCR產(chǎn)品量、添加到熒光染料中的PCR系統(tǒng)、模板、引物、dNTP 放大曲線循環(huán)數(shù)與初始模板濃度的對(duì)值形成線性關(guān)系，Cq，熒光定量PCR 基本原理，未知濃度樣本，Cq=-k LG X0 b，標(biāo)準(zhǔn)曲線：差異：一般PCR:反應(yīng)結(jié)束最終產(chǎn)物的數(shù)量大致可測量-半定量熒光定量PCR儀：初始融合曲線分析(TM)，非特異性熒光染料-SYBR- Green，Tm: DNA產(chǎn)物50%是鏈解開時(shí)的溫度DNA片段只有一個(gè)特定Tm，所以通過溶解曲線分析，放大產(chǎn)物是目的片段，Tm，非特異性熒光染料-SYBR-ggr 常用標(biāo)記探針的染料：1通道：FAM 2通道：HEX 3通道：Rox 4通道：CY5

4、，病原微生物：沙門氏菌單核細(xì)胞增殖李斯特菌大腸桿菌(單一和多重?zé)晒舛縋CR單通道(單色):一個(gè)PCR管中有一個(gè)基因定量(多用途SybrGreen)雙通道(雙色):一個(gè)PCR管中有兩個(gè)基因的定量多通道(多色):在一個(gè)PCR管中有三個(gè)或更多基因定量，經(jīng)常使用，F(xiàn)AM 不需要使用穩(wěn)定的激發(fā)信號(hào)ROX染料的光強(qiáng)度校正檢測器：CCD相機(jī)可以同時(shí)快速收集整個(gè)平板的多個(gè)熒光信號(hào)數(shù)據(jù)，高靈敏度PCR模塊：96孔半導(dǎo)體PCR，PikoREAL的硬件系統(tǒng)：功能：絕對(duì)定量，雙探針方法，HRM方法，相對(duì)定量，基因型分析，基因型分析更適合于5-10ul小反應(yīng)系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)成本降低2倍3，小、快、穩(wěn)定、安靜，病原菌檢測實(shí)驗(yàn)

5、操作和結(jié)果分析，檢測過程，25g或25ml樣品225ml增稠菌培養(yǎng)液，在混合、適當(dāng)溫度下24小時(shí)培養(yǎng)，1ml培養(yǎng)液，分解液， OXOID通常使用預(yù)增菌培養(yǎng)液：塞默菲咨詢熱線：800-810-5118，1，增菌-按照說明書操作，2，細(xì)菌分解，反應(yīng)液和商業(yè)化準(zhǔn)備，1)細(xì)菌分解：獲取要測試的樣品2)準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品：陰性對(duì)照樣品，陽性對(duì)照樣品(4濃度)3)根據(jù)試驗(yàn)樣品制造所需的反應(yīng)液量4)，將反應(yīng)液添加到反應(yīng)板上，分別在相應(yīng)的孔中添加陰性對(duì)照樣品，陽性對(duì)照樣品，試驗(yàn)對(duì)象樣品。，根據(jù)測試套件操作手冊(cè)進(jìn)行如下操作：測試試劑可以選擇各國內(nèi)和進(jìn)口企業(yè)套件。例如，金黃色葡萄球菌檢測，1，樣本擴(kuò)增菌25g或25ml樣

6、本10%氯化鈉胰蛋白胨豆湯37度，24小時(shí)Staphylococcus aureus:Staphylococcus aureus，STAPb，10倍稀釋標(biāo)準(zhǔn)(如果僅產(chǎn)生陰陽結(jié)果，則不需要系列濃度的陽性)1)帶4個(gè)2毫升離心管，標(biāo)記為2，3，4，5(濃度5106，5105，5104，5103復(fù)印/ml)。(2)每管36ul水3)作為4ul陽性對(duì)照添加到1號(hào)管，沖擊混合后以4ul添加到2號(hào)管，2號(hào)管沖擊混合后以4ul添加到3號(hào)管。相應(yīng)地處理4號(hào)管道。4，反應(yīng)流體準(zhǔn)備1(絕對(duì)定量方法)計(jì)算所需的每個(gè)反應(yīng)流體組件，2ml離心管，沖擊混合均勻絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)：5 (5濃度，未知樣本副本數(shù)可量化)語音對(duì)比：1

7、未知樣本：n (n是未知樣本數(shù))，11 每個(gè)方程式后乘以2或3，計(jì)算反應(yīng)液準(zhǔn)備1(陰陽確定法)所需的每個(gè)反應(yīng)液成分，按表格量添加2ml離心管，均勻混合沖擊，3000rmp離心力10秒，預(yù)備。 絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)：1 (1濃度，作為陽性參考)語音對(duì)照：1未知樣品：n (n是未知樣品數(shù))，110%表示在準(zhǔn)備和樣品過程中補(bǔ)償損失，例如每個(gè)樣品需要2或3個(gè)迭代。每個(gè)表達(dá)式后乘以2或3:5，前a，96孔Piko板，示例輔助設(shè)備上分別有反應(yīng)流體18ul B，分解的示例，un孔，每個(gè)示例1孔；采用稀釋號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)，按順序添加到最后一行的孔中。向0孔添加2ul水。示例陣列建議：S-benign標(biāo)準(zhǔn)，0-voice對(duì)照，

8、un-unknow樣本，6，膠片地膜覆蓋，離心，放入qPCR，7，設(shè)置程序，按Run啟動(dòng)PCR反應(yīng)，雙擊編程桌面設(shè)備圖標(biāo)，打開軟件，編程，添加新循環(huán)，添加溶解曲線檢測，上下移動(dòng)或刪除反應(yīng)階段，輸入或輸出反應(yīng)程序，啟動(dòng)程序運(yùn)行，添加反應(yīng)階段，添加數(shù)據(jù)收集階段，編程，修改參數(shù)，或者，進(jìn)入Plate Layout以設(shè)置平板。單擊、8、電路板布局、Plate Layout轉(zhuǎn)至電路板布局界面，查找示例，輸入名稱，然后確定示例屬性。-在執(zhí)行程式之前、執(zhí)行中、可設(shè)定和修改執(zhí)行結(jié)束、每個(gè)反應(yīng)孔的范例資訊、電路板配置圖、輸入范例名稱等資訊、群組范例、復(fù)制孔資訊、刪除、貼上、取消、選取范例模組類型、輸入電路板配置圖、輸出、選取范例屬性、群組、7、未知樣品孔的設(shè)置和命名將顯示相對(duì)定量，單擊，1，2，3，4，5，6，7，絕對(duì)定量-漸變稀釋標(biāo)準(zhǔn)，確定陰陽-只有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，9，結(jié)果分析，程序運(yùn)行結(jié)束，分析選項(xiàng)，進(jìn)入分析界面，結(jié)果分析主界面采樣位置，顯示定量結(jié)果Cq，份數(shù)，設(shè)置選