免疫膠體金的制備(康柳英).ppt

1、免疫膠體金的制備,原理 制備過程 1.膠體金的制備 2.膠體金標(biāo)記蛋白 3.膠體金標(biāo)記蛋白的純化,原理,氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機(jī)理可能是膠體金顆粒表面負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。,一. 膠體金的制備,膠體金溶液制備的基本原理是向一定濃度的金溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子變成金原子。使用不同種類、不同劑量的還原劑，可以控制所產(chǎn)生的膠體金粒子大小。即粒子大小取決于反應(yīng)溶液中最初還原試劑和還

2、原核的數(shù)量。還原劑濃度越高，核濃度也越高，氯化金的還原也就從更多的還原中心開始，因此產(chǎn)生的膠體金粒子數(shù)量越多，但體積也越小。,常用方法,1檸檬酸三鈉還原法 2鞣酸檸檬酸三鈉還原法 3. 白磷還原法 4. 抗體血酸還原法 5. 硼氫化鈉還原法 6. 乙醇超聲波還原法,步驟(檸檬酸三鈉法),(1) 取5000ml圓底燒瓶一個(gè)，加4000 ml雙蒸水及160 ml 1%氯化金，加熱沸騰2-5分鐘； (2) 根據(jù)需要準(zhǔn)確加入不同量的2檸檬酸三鈉水溶液，混勻，再保持沸騰5分鐘，溶液顏色首先變黑，再逐漸變紅，粒子體積較小時(shí)，溶液呈桔紅色，而粒子體積較大時(shí)，則顏色偏向紫色。 (3) 冷卻后以蒸餾水恢復(fù)到原體

3、積。,金溶膠顆粒的直徑和制備時(shí)加入的檸檬酸三鈉量是密切相關(guān)的，保持其他條件恒定，僅改變加入的檸檬酸三鈉量，可制得不同顏色的金溶膠，也就是不同粒徑的金溶膠，見附表,注意事項(xiàng),（1）玻璃器皿必須徹底清洗，最好是經(jīng)過硅化處理的玻璃器皿，或用第一次配制的膠體金穩(wěn)定的玻璃器皿，再用雙餾水沖洗后使用。否則影響生物大分子與金顆粒結(jié)合和活化后金顆粒的穩(wěn)定性，不能獲得預(yù)期大小的金顆粒 （2）試劑配制必須保持嚴(yán)格的純凈，所有試劑都必須使用雙餾水或三餾水配制，或者在臨用前將配好的試劑經(jīng)超濾或微孔濾膜過濾，以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質(zhì)。 （3）配制膠體金溶液的pH以中性（pH7.2）較好。 （4）氯金酸極易

4、吸潮，對(duì)金屬有強(qiáng)烈的腐蝕性，不能使用金屬藥匙，避免接觸天平稱盤。 （5）膠體金溶液最好保存在4冰箱中；也可保存在室溫下，一般可保存1-2個(gè)月。但決不可保存在0以下，否則金粒子發(fā)生凝聚。,二.膠體金標(biāo)記蛋白的制備,1. 蛋白質(zhì)的處理 2. 蛋白與膠體金結(jié)合最佳pH確定 3. 最小蛋白濃度的確定 4. 膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合 5. 膠體金標(biāo)記蛋白的純化,蛋白質(zhì)的處理,目的: （1）去除高濃度的鹽分，高濃度的鹽分往往干擾蛋白與膠體金的吸附結(jié)合，或?qū)е履z體金粒子的凝聚，這一步往往采用低濃度緩沖液中進(jìn)行。 （2）使蛋白分子盡量分散為單體，凍干蛋白或高濃度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚為多聚體大分子，可同時(shí)與多

5、個(gè)膠體金粒子結(jié)合，影響標(biāo)記的靈敏度和定量分析。 （3）使蛋白具有適當(dāng)?shù)姆肿恿?。蛋白分子量過小（30KD), 形成的蛋白復(fù)合體往往是不穩(wěn)定，可短時(shí)間內(nèi)失活。而分子量過大時(shí)，被認(rèn)為影響探針的靈敏度，特別是已知蛋白的結(jié)構(gòu)與活性中心的情況下，去除對(duì)活性武影響的結(jié)構(gòu)部分是提高標(biāo)記靈敏度，延長(zhǎng)探針壽命（防止凝集）的有效辦法。把分子量過小的蛋白與其它蛋白（如BSA，牛血清蛋白等）結(jié)合后，能制備出穩(wěn)定性更佳的探針。,蛋白與膠體金結(jié)合最佳pH確定,1. 取若干個(gè)1.5ml試管，分別加入1 ml 膠體金 2. 用1% K2CO3將pH分別調(diào)為6，7，8，9，10；（20#管在7左右，實(shí)際中我們絕大部分是按變色點(diǎn)來

6、選） 3. 按pH從低到高分別加入20ul濃度為1 mg/ml的蛋白，混合，室溫下放置15min； 4. 觀察膠體金顏色變化，記錄保持紅色的最低pH,最小蛋白濃度的確定,1. 取若干個(gè)1.5ml試管，每個(gè)分別加入最佳pH的膠體金1 ml ； 2. 依次加入不同量的蛋白（一般濃度為0.5-1 mg/ml）120 ul，（一般抗體按10，15，20ug/ml;抗原按30，40ug/ml),混勻，室溫下放置15min；(加驗(yàn)?zāi)zC20ul/ml看膠的顏色來確定） 3. 顏色仍保持紅色的最小蛋白用量即最小蛋白濃度。,膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合,1. 用1% K2CO3調(diào)節(jié)金溶膠至所需pH。 2. 于100ml

7、 金溶膠中加入最佳標(biāo)記量的蛋白質(zhì)溶液，攪拌分鐘,放置15min 。 3.加入一定量的穩(wěn)定劑以防止抗體蛋白與膠體金聚合發(fā)生沉淀 。常用穩(wěn)定劑是5胎牛血清（BSA）和1聚乙二醇（分子量20KD）。,膠體金標(biāo)記蛋白的純化,（1）超速離心法：根據(jù)膠體金顆粒的大小，標(biāo)記蛋白的種類及穩(wěn)定劑的不同選用不同的離心速度和離心時(shí)間。 （2）凝膠過濾法：此法只適用于以BSA作穩(wěn)定劑的膠體金蛋白結(jié)合物的純化。,儲(chǔ)存,離心后，仔細(xì)吸出上清，沉淀物用含1BSA的PB液（含0.02NaN3），將沉淀重懸為原體積的110，4保存。 如在結(jié)合物內(nèi)加50甘油可貯存于-18保存一年以上。 貯存中可能會(huì)發(fā)生程度不同的凝聚，可離心除去

8、。,注意事項(xiàng),1.有些蛋白最佳pH范圍較窄，設(shè)置的梯度不能太大。 2.在實(shí)際的制備中，一般膠體金調(diào)整pH=PI+0.5，這樣蛋白帶正電，有利于結(jié)合更穩(wěn)定。 3. 使用不同直徑的膠體金與同一蛋白結(jié)合時(shí)，除了蛋白量完全不同外，往往最佳pH也有一定變化。 4. 不同直徑膠體金所需離心速度完全不同。,氯化金極易吸濕，故一般均以小劑量密封保存（0.5g或1g），因此在配制氯化金溶液時(shí)一次配完，暫時(shí)不用的可以用1.5 ml試管分裝為1 ml保存（-20）。注意各種玻璃器皿一定要洗凈并用雙蒸水多次沖洗，有條件時(shí)可硅化處理（1雙氯硅烷/氯仿浸泡1小時(shí)，烘干）。配制各種試劑時(shí)均使用雙蒸水，隨后再用0.22 mm

9、微孔濾膜過濾后使用。三角瓶可反復(fù)多次使用，不用時(shí)應(yīng)密封保存，以防污染。 制備好的膠體金保存壽命較長(zhǎng)，可4保存6個(gè)月以上或室溫下保存1-2個(gè)月。當(dāng)出現(xiàn)明顯懸浮物或沉淀后表示已不可再用。但無論無何，在保存較長(zhǎng)時(shí)間后應(yīng)進(jìn)行鏡檢，如出現(xiàn)大量膠體金粒子凝集，說明已經(jīng)過期。,由于使用試劑質(zhì)量及其它方面可能存在的誤差，以及制備過程中的其它問題（加熱時(shí)間，溫度；倒液速度），膠體金粒子的大小及一致性與理論值可能有偏差，因此，在制備完成后必須進(jìn)行鏡檢。如出現(xiàn)粒子體積偏差太大，粒子凝聚，粒子邊緣不清晰等問題，須重新制備。,試劑添加順序 即把檸檬酸鹽溶液加入氯金酸溶液還是把氯金酸加入檸檬酸溶液，這種添加次序?qū)δz體質(zhì)量有何影響，（試驗(yàn)）,不同直徑膠體金所需離心速度完全不同。以絕大部分探針形成松散沉淀為原則。離心力太大，會(huì)產(chǎn)生不可逆的探針凝聚；離心力太小，探針無法沉下。最好能夠直接用膠體金在不同轉(zhuǎn)速下離心以確定適當(dāng)?shù)碾x心力。 3).在冷離心機(jī)中可適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間，同時(shí)適當(dāng)減小離心力，探針活性較好。 4).IgG的最佳交聯(lián)pH有多種報(bào)導(dǎo)，從7.4-9.0。一般認(rèn)為，7.4時(shí)膠體金結(jié)合的蛋白最多，9.0時(shí)制備的探針最穩(wěn)定。,影響最終膠體金質(zhì)量的因素 多種物理因素都會(huì)影