第一章 蛋白質(zhì)化學(xué)

1、第一章 蛋白質(zhì),Protein,生命活動(dòng)的體現(xiàn)者蛋白質(zhì)（Protein）,蛋白質(zhì)存在于所有生物細(xì)胞中，是構(gòu)成生 物體最基本的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和功能物質(zhì) 蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，參與了幾 乎所有的生命活動(dòng)過程,蛋白質(zhì)在機(jī)體中的重要作用,催化功能:高效專一地催化機(jī)體內(nèi)幾乎所有的 反應(yīng) 如：酶 結(jié)構(gòu)功能:作為構(gòu)建機(jī)體某部分的材料 如微管蛋白、膜蛋白 調(diào)節(jié)功能:調(diào)節(jié)機(jī)體代謝活動(dòng) 如胰島素 防御功能:防御異體侵入機(jī)體 如免疫球蛋白,蛋白質(zhì)在機(jī)體中的重要作用,運(yùn)輸功能:專一運(yùn)輸各種小分子和離子 如血紅蛋白 儲(chǔ)藏功能:作為氨基酸的貯庫，用于生長(zhǎng)發(fā)育所需或某些物質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合而被貯存如卵清蛋白、鐵蛋白 運(yùn)動(dòng)功能:

2、負(fù)責(zé)機(jī)體的運(yùn)動(dòng)如肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白,蛋白質(zhì)的化學(xué)元素組成,C、 H、 O、 N 、S、P 微量元素 Fe、I、Cu、Mo、Zn等 凱氏定氮法：根據(jù)N的含量在各種蛋白質(zhì)中都比較接近，平均為16% 的規(guī)律，測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法 蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含N量6.25,主要內(nèi)容,第一節(jié) 氨基酸 第二節(jié) 肽 第三節(jié) 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 第四節(jié) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 第五節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) 第六節(jié) 蛋白質(zhì)的分離純化,第一節(jié) 氨基酸 （amino acid，AA或aa）,一、蛋白質(zhì)水解,蛋白質(zhì)多肽肽AA 1*104 1000 200 100 蛋白質(zhì)和多肽的肽鍵可被催化水解 酸/堿能將蛋白完全水解 得到各種aa的混合

3、物 酶水解一般是部分水解 得到多肽片段和aa的混合物 氨基酸是蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單元,各種蛋白質(zhì)水解法比較,二、氨基酸的分類 地球上天然形成的AA有300種以上， 構(gòu)成蛋白質(zhì)的AA只有20余種，且都是-氨基酸(除pro外),1.分為兩大類 蛋白質(zhì)氨基酸： Pr的基本結(jié)構(gòu)單位 常見aa.（基本aa. 20種） 不常見aa.（稀有aa./修飾aa.） 非蛋白質(zhì)氨基酸：不參與蛋白質(zhì)的組成,2. 常見蛋白質(zhì)氨基酸的結(jié)構(gòu)通式 組成蛋白質(zhì)的氨基酸都為a-氨基酸（除Pro外）,不同的 aa 在于 R基團(tuán) 的不同,什么是-氨基酸？,-C-C-C-C-COOH -C-C-C-C(NH2)-COOH -氨基酸 -C

4、-C-C(NH2)-C-COOH -氨基酸 -C-C(NH2)-C-C-COOH -氨基酸 即與羧基相鄰的-碳原子上都有一個(gè)氨基，因此稱為-氨基酸,大多數(shù)AA在中性pH時(shí)呈兼性離子狀態(tài): COO- NH 3+ 除甘氨酸外，19種AA都具有旋光性 除胱氨酸和酪氨酸外，其余AA都能溶于水,手性C原子（asymmetric carbon atom) 也叫不對(duì)稱碳原子，指與四個(gè)不同的原子或原子基團(tuán)共價(jià)連接并因而失去對(duì)稱性的四面體碳,旋光性（optical activity）,平面偏振光：光波通過尼克爾棱鏡時(shí)，由于棱鏡的結(jié)構(gòu)只允許沿某一平面振動(dòng)的光波通過，其他光波都被阻斷，這種光稱平面偏振光 旋光性：旋

5、光物質(zhì)使平面偏振光的偏振面發(fā)生旋轉(zhuǎn)的能力,3. 常見的蛋白質(zhì)氨基酸的結(jié)構(gòu)和分類,（1） 由R基團(tuán)的極性,I 非極性氨基酸,I 非極性氨基酸,I 非極性氨基酸,這組aa在水中的溶解度比極性R基aa小,II 不帶電荷的極性氨基酸,II 不帶電荷的極性氨基酸,這組氨基酸比非極性R基氨基酸易溶于水，它們的側(cè)鏈中含有不解離的極性基，能與水形成氫鍵 半胱氨酸和酪氨酸的R基極性最強(qiáng),III 帶負(fù)電荷的氨基酸,Asp和Glu都含有兩個(gè)羧基，且第二個(gè)羧基在pH 7左右完全解離，因而帶負(fù)電荷,IV 帶正電荷的氨基酸,（2） 由R基團(tuán)的化學(xué)結(jié)構(gòu),Gly、Ala、Val、Leu、Ile、 Ser、Thr、Cys、Me

6、t、 Asp、Glu、Asn、Gln、 Lys、Arg,Phe、Tyr、 Trp,Pro、His,（3）由氨基酸的營養(yǎng)需求,人類自身能合成,Gly Ala Ser Tyr Cys Pro Asn Asp Glu Gln,人類自身不能合成或不能足量合成，必須依賴食物供給,Met Trp Lys Val Ile Leu Phe Thr （假 設(shè) 來 寫 一 兩 本 書 ） His Arg（嬰兒）,4. 不常見的蛋白質(zhì)氨基酸,由常見aa經(jīng)修飾而來 4-羥脯氨酸存在于結(jié)締組織的膠原蛋白中,5. 非蛋白質(zhì)氨基酸,不存在于蛋白質(zhì)中，以游離或結(jié)合狀態(tài)存在于生物體內(nèi) 多是蛋白質(zhì)中L型-AA衍生物 有一些是-，

7、-，-AA 有些是D-型AA,鳥氨酸 瓜氨酸,瓜氨酸、鳥氨酸是尿素循環(huán)的中間物 細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖中發(fā)現(xiàn)有D-谷氨酸和D-丙氨酸,三、氨基酸的主要理化性質(zhì),（一）兩性解離及等電點(diǎn) 1. 氨基酸是兩性電解質(zhì),氨基酸既含有堿性的氨基，又含有酸性的羧基, 所以是兩性電解質(zhì),氨基酸在晶體或水中以兼性離子（偶極離子）形式存在 氨基酸晶體是由離子晶格組成的 熔點(diǎn)很高，一般在200度以上 氨基酸可使水的介電常數(shù)增高,2. aa的等電點(diǎn)（isoelectric point，pI）,當(dāng)溶液處于某一特定pH時(shí)，氨基酸所帶 正電荷和負(fù)電荷相等，即凈電荷為零，這時(shí) 溶液的pH值稱為氨基酸的等電點(diǎn)（pI） pI 是氨基

8、酸的特征常數(shù)，可由其分子上可解離基團(tuán)的解離常數(shù)來確定,氨基酸的解離基團(tuán)的解離常數(shù)可用酸堿滴定方法測(cè)定,Pk2是AA的NH3+ 被滴定一半時(shí)的pH （ NH3+釋放H+）,Pk1是AA的coo- 被滴定一半時(shí)的pH （coo-結(jié)合H+）,已知解離常數(shù)，計(jì)算氨基酸的等電點(diǎn),例1 Ala 的pI 計(jì)算,例2 Asp的pI 計(jì)算,例3 Lys 的pI 計(jì)算,pI值與離子濃度基本無關(guān)，只決定于等 電兼性離子兩側(cè)的可解離基團(tuán)的pk值 氨基酸的兩性解離是其非常重要的性質(zhì)， 各解離基團(tuán)的pk值也十分重要 氨基酸的等電點(diǎn)相當(dāng)于該氨基酸的兩 性離子狀態(tài)兩側(cè)的基團(tuán)Pk值之和的一半,氨基酸在電場(chǎng)中的移動(dòng),pH pI

9、帶負(fù)電，移向正極,pH pI 帶正電，移向負(fù)極,pH = pI 不帶電，不移動(dòng),同一pH時(shí)，不同氨基酸的帶電情況不同,等電點(diǎn)時(shí)，由于靜電作用，氨基酸的溶解度最小。,（二）氨基酸的光學(xué)性質(zhì),1. 旋光性 必須有手性碳原子 除Gly之外，其余蛋白質(zhì)氨基酸都有手性碳原子，都具有旋光性 Thr、Ile有兩個(gè)手性碳原子,2. 構(gòu)型 由于基團(tuán)或原子在空間排列的不對(duì)稱性而引起光學(xué)活性的立體結(jié)構(gòu) D型氨基酸：書寫時(shí)氨基在右邊 L型氨基酸：書寫時(shí)氨基在左邊 D型與L型互為鏡像不能重疊 天然蛋白質(zhì)中存在的氨基酸都是L型的 旋光異構(gòu)體： 左旋（）；右旋（+）,(三)氨基酸的紫外吸收性質(zhì) 可見光：無吸收 遠(yuǎn)紫外區(qū)：有

10、吸收 近紫外區(qū)：Trp、Tyr、Phe 含芳香環(huán)共軛雙鍵系統(tǒng)，在此處有光吸收，最大吸收峰分別在 280nm（279）、275nm（278）、257（259）nm，蛋白質(zhì)因含有這些氨基酸，因此其最大光吸收為280nm,（四）氨基酸的化學(xué)反應(yīng),茚三酮反應(yīng) 桑格反應(yīng) 艾德曼反應(yīng) 丹磺酰氯反應(yīng),1、與茚三酮反應(yīng),2. 桑格反應(yīng),3. 艾德曼反應(yīng),4. 丹磺酰氯反應(yīng),DNS-cl+aa. = DNS-aa(強(qiáng)熒光) DNS-cl+多肽 =DNS-aa+游離的氨基酸,三、氨基酸的分離分析和鑒定,包括測(cè)定蛋白質(zhì)中氨基酸組成、含量或從蛋白質(zhì)水解液中制備氨基酸 層析法/色譜法 分配層析 （紙層析、薄層層析） 離

11、子交換層析 氣相色譜 高效液相色譜,關(guān)于分配層析的幾個(gè)基本概念,利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離的方法 分配系數(shù)（Kd）：指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達(dá)到平衡時(shí)，該溶質(zhì)在兩相溶劑中的濃度的比值。 Kd=CA/CB 有效分配系數(shù)Keff 固定相： 流動(dòng)相：,一、紙層析,紙層析屬于典型的分配層析，且系統(tǒng)簡(jiǎn)單，使用方便，在生物化學(xué)的發(fā)展中發(fā)揮過極其重要的作用 (一) 原理 1. 支持物：濾紙 2. 固定相：濾紙纖維的結(jié)合水 流動(dòng)相：與水不相混溶或部分混溶的有機(jī)溶劑 展開時(shí)，有機(jī)溶劑在濾紙上流動(dòng)，樣品中各物質(zhì)在兩相之間不斷地進(jìn)行分配。由于各物質(zhì)有不同的分配系數(shù)，移動(dòng)速度因此不同

12、，從而達(dá)到分離,3. Rf值：用來表示溶質(zhì)在濾紙上移動(dòng)的速率 Rf= a/ b 式中 a：溶質(zhì)斑點(diǎn)中心的移動(dòng)距離 b：溶劑前沿移動(dòng)的距離 Rf值的大小取決于： 被分離物質(zhì)在兩相間的分配系數(shù)以及兩相間的體積比。 由于在同一實(shí)驗(yàn)條件下，兩相體積比是一常數(shù)，所以Rf值決定于分配系數(shù)。不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同，Rf值也不相同，由此可以根據(jù)Rf值的大小對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析,紙層析法點(diǎn)樣及展開過程,第二節(jié) 肽 （peptide）,AA-COOH 與另一AA-NH2間失水形成的酰胺鍵稱肽鍵(peptide bone)，所形成的化合物稱肽(peptide)或肽鏈(peptide chain因肽是氨基酸的線性聚合物

13、),由兩個(gè)AA組成的肽稱為二肽 由多個(gè)AA組成的肽稱為多肽 組成多肽的AA單元，因參加肽鍵的形成，已經(jīng)不是原來完整的分子，稱為氨基酸殘基,多肽鏈中AA殘基按一定順序排列：氨基酸順序 含游離-氨基的一端：氨基端或N-端 含游離-羧基的一端：羧基端或C-端 肽鏈具有極性，其AA順序是從N-端開始以C-端氨基酸殘基為終點(diǎn) 如上述五肽：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,1、中文表示法： 肽的命名是根據(jù)參與其組成的氨基酸殘基來確定的，規(guī)定從肽鏈的N端開始，對(duì)氨基酸殘基逐一命名，稱為某氨基酰某氨基酰某氨酸,肽的表示法,2、三字母表示法： Ala- Gly - Ser - Leu - Phe,3、單字

14、母表示法： AGSLF ,（一）肽和肽鍵的結(jié)構(gòu),1. 肽的結(jié)構(gòu),（1）無分枝的長(zhǎng)鏈,（3）由“-N-C-C-”序列重復(fù)排列形成多肽鏈主鏈； 氨基酸殘基的R基團(tuán)連接在主鏈的C上，形成多肽鏈的側(cè)鏈 各種肽的主鏈結(jié)構(gòu)都是一樣的，但是側(cè)鏈R基的序列不同,（2）具有方向性 兩個(gè)末端分別為N端(氨基端)和C端(羧基端),肽的結(jié)構(gòu),2.肽鍵的結(jié)構(gòu) 肽鍵中C-N鍵有部分雙鍵性質(zhì)（40） 鍵長(zhǎng)(0.133nm)介于C-N單鍵和C=N雙鍵之間，不能自由旋轉(zhuǎn) 組成肽鍵的4個(gè)原子和2個(gè)相鄰的a碳原子）處于同一平面（肽平面、肽單位） 鍵長(zhǎng)及鍵角一定 肽鏈中的肽鍵都是反式構(gòu)型。肽平面內(nèi)，兩個(gè)a碳原子可以處于順式構(gòu)型或反式

15、構(gòu)型，一般情況下反式構(gòu)型較穩(wěn)定,共價(jià)主鏈,（二）肽的物理化學(xué)性質(zhì),肽晶體熔點(diǎn)高，水溶液中以兼性離子形式存在 肽的酸堿性質(zhì)主要決定于肽鏈中的游離末端-氨基、 -羧基、側(cè)鏈R基上的可解離功能團(tuán) 等電點(diǎn)（兩性）：其等電點(diǎn)是在所有可解離的基團(tuán)的凈電荷為0時(shí)的溶液pH值,具有雙縮脲反應(yīng)Pr、肽特有的反應(yīng) 含有2個(gè)或2個(gè)以上的肽鍵的化合物與硫酸銅堿性溶液反應(yīng)生成紫紅色或藍(lán)紫色復(fù)合物 具有與氨基酸中相應(yīng)基團(tuán)類似的反應(yīng) 茚三酮反應(yīng)、Sanger反應(yīng)、Edman反應(yīng)等,（三）天然存在的重要多肽,環(huán)狀八肽，可與真核生物RNA聚合酶牢固結(jié)合而抑制酶的活性，因而使RNA的合成不能進(jìn)行,廣泛存在于生物體內(nèi)，是某些氧化還原酶的輔酶，對(duì)巰基酶的-SH基有保護(hù)作用，且有防止過氧化物累積的功能,第三節(jié) 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的不同層次,蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次,一級(jí)結(jié)構(gòu),二級(jí)結(jié)構(gòu) 超二級(jí)結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)域 三級(jí)結(jié)構(gòu) 四級(jí)結(jié)構(gòu),高級(jí)結(jié)構(gòu) 空間結(jié)構(gòu),初級(jí)結(jié)構(gòu),（一）一級(jí)結(jié)構(gòu)的概念 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)（primary structure）是指蛋白質(zhì)肽鏈中氨基酸的排列順序。主要由肽鍵和二硫鍵形成。也稱蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu),一、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)的氨基酸序列測(cè)定基本程序,二硫鍵的斷裂,鹽酸胍/尿素解離多肽鏈間的非共價(jià)力 應(yīng)用過甲酸氧