第八章高效液相色譜的色譜柱和流動(dòng)相.ppt

1、，色譜分析，應(yīng)用化學(xué)系，高效液相色譜柱和流動(dòng)相，柱，HPLC柱填充1，全孔球形硅膠填充劑最常用的硅膠矩陣為微孔(小于2nm)，介孔(2-50nm)，大孔(大于50nm)可以進(jìn)行化學(xué)鍵和修飾。硅膠柱填料的殘留硅羥基效應(yīng)堿性分析物被嚴(yán)重牽引，分離度低。抑制堿性流動(dòng)相添加劑，逆色柱填料保存性能隨溫度變化，lnk和1/T在一定溫度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，硅膠基質(zhì)逆色頻譜填充物的顏色頻譜性能凈化硅膠，高純度(99.999%)利用硅膠色譜填料的硅膠完全密封(尾部)，在利用空間位阻的殘留硅羥基結(jié)合相分子中內(nèi)置極性極性很強(qiáng)的水溶性樣品在反相色譜中很弱，很難有效分離，可以用正色波(氨基柱、乙醇柱)有機(jī)溶劑-水流分離。

2、弱酸，弱堿樣品抑制電離，抑制反相分離。離子分析，離子色譜優(yōu)選。生物分子分離模式是反相、離子交換、體積排除、疏水作用、親和顏色頻譜模式。顏色頻譜條件的影響，顏色頻譜柱影響分離度，分離度越長(zhǎng)，內(nèi)徑越小，分離度越高。柱填充物影響分離度，粒子越小，柱效果越高，分離度越大，但柱壓力越高(5m 3m柱效果提高30%，但柱壓力增加1倍)。流化床影響保存，溶出能力越強(qiáng)，分析時(shí)間越短。例如，在反色流動(dòng)上，有機(jī)組分的增加保持減弱。流速越高，保存時(shí)間越短，但柱壓力值越高。柱溫度越高，保持時(shí)間越短，分離度越低。等度洗滌在短的分析時(shí)間和難以獲得滿(mǎn)意的顏色保桿型時(shí)可以進(jìn)行漸變洗滌。40度169bar，90度94bar，s

3、b-c8 4.6x75mm 3.5um 866953-906零售池： 10mm，2.5ul 2060% b (10min)。)2ml/min 8uL 2060%B (30min)。)1mL/min。5um柱尺寸： 4.6 x 50mm，3.5um柱尺寸3360 4.6 x 50mm，-cn，-苯基，C8；硅-氧-碳鍵固定相硅-氮-碳鍵固定相硅-氧-硅-碳鍵固定相硅-碳鍵固定相，1，硅-氧-碳鍵固定相制備方法之一的制備方法2:亞硫氯處理硅膠表面氯化硅膠，以及過(guò)量醇和醇解反應(yīng)缺點(diǎn)：容易水解，2，硅-氮-碳結(jié)合型固定相制備方法：將硅膠表面氯化，然后將伯胺加入氯化硅膠反應(yīng)中。有機(jī)溶劑和pH=3-8的水

4、性介質(zhì)穩(wěn)定。3，硅-氧-硅-碳鍵固定相的制備方法：硅膠表面的硅羥基和有機(jī)氯硅烷或硅氧烷硅烷反應(yīng)。有機(jī)溶劑和pH=2-8.5的水介質(zhì)穩(wěn)定。4，硅碳鍵固定相制備方法：氯化硅膠和有機(jī)鋰或格氏試劑反應(yīng)。穩(wěn)定性?xún)?yōu)于硅-氧-碳耦合固定相，但結(jié)果產(chǎn)物的應(yīng)用范圍較低。粘接固定相的性質(zhì)，1，表面覆蓋完全水解的硅膠表面上8umol/m2硅羥基，由于位阻存在，只能反應(yīng)約一半硅羥基。好的填充物要掩蔽剩余的硅羥基，利用掩蔽試劑和參與硅羥基反應(yīng)消除其不良影響。表面覆蓋度越高，色譜保留度越強(qiáng)。2，粘接鏈長(zhǎng)度的影響，反相色譜固定相粘接鏈長(zhǎng)度越長(zhǎng)，對(duì)正常色譜固定相鏈長(zhǎng)度的影響越小。3.影響粘結(jié)固定相基質(zhì)性質(zhì)的基質(zhì)種類(lèi)、表面積、

5、化學(xué)性質(zhì)影響本丁量、覆蓋度等都在一定程度上影響本丁。高效液相色譜柱和流動(dòng)相、色譜柱、HPLC柱填充1、全多孔球形硅膠填充劑最常用的硅膠矩陣包括微孔(小于2nm)、介孔(2-50nm)、大孔(大于50nm)硅膠、多用途介孔和大孔硅膠填充劑可以進(jìn)行化學(xué)鍵和修飾。硅膠柱填料的殘留硅羥基效應(yīng)堿性分析物被嚴(yán)重牽引，分離度低。抑制堿性流動(dòng)相添加劑，逆色柱填料保存性能隨溫度變化，lnk和1/T在一定溫度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，硅膠基質(zhì)逆色頻譜填充物的顏色頻譜性能凈化硅膠，高純度(99.999%)利用硅膠色譜填料的硅膠完全密封(尾部)，采用空間位阻的殘留硅羥基結(jié)合相分子內(nèi)建的極性極性很強(qiáng)的水溶性樣品在反相色譜中很弱

6、，很難有效分離，可以用正色波(氨基柱、乙醇柱)有機(jī)溶劑-水流分離。弱酸，弱堿樣品抑制電離，抑制反相分離。離子分析，離子色譜優(yōu)選。生物分子分離模式是反相、離子交換、體積排除、疏水作用、親和顏色頻譜模式。顏色頻譜條件的影響，顏色頻譜柱影響分離度，分離度越長(zhǎng)，內(nèi)徑越小，分離度越高。柱填充物影響分離度，粒子越小，柱效果越高，分離度越大，但柱壓力越高(5m 3m柱效果提高30%，但柱壓力增加1倍)。流化床影響保存，溶出能力越強(qiáng)，分析時(shí)間越短。例如，在反色流動(dòng)上，有機(jī)組分的增加保持減弱。流速越高，保存時(shí)間越短，但柱壓力值越高。柱溫度越高，保持時(shí)間越短，分離度越低。等度洗滌在短的分析時(shí)間和難以獲得滿(mǎn)意的顏色

7、保桿型時(shí)可以進(jìn)行漸變洗滌。40度169bar，90度94bar，溫度影響，SB-C8 4.6X75mm 3.5um配電池： 10mm，2.5ul 2060% b (10min) 2ml/min。S. 8uL 2060%B (30min)。)1mL/min，填充物粒子的影響，5um頻譜柱尺寸： 4.6 x 50mm，3.5um頻譜柱尺寸3360 4.6 x 50mm，填充物粒子的影響，-CN支柱流化床必須用0.45m的微孔膜過(guò)濾，微孔膜，濾膜種類(lèi)是流動(dòng)用水性上濾膜過(guò)濾水或鹽溶液。將鹽溶液用作流動(dòng)相時(shí)，首先要溶解鹽，然后過(guò)濾，首先過(guò)濾水，然后溶解鹽，防止鹽中的固體不溶物堵塞歐元，渡邊杏。注：用于過(guò)

8、濾無(wú)機(jī)流化床的濾膜可溶于有機(jī)溶劑。，樣品要用0.22米的微孔膜過(guò)濾，樣品要用0.22米的微孔膜過(guò)濾，侵蝕樣品過(guò)濾器，流動(dòng)上的固體顆粒和密封渣堵塞過(guò)濾百度，泵壓過(guò)高，要及時(shí)更換。anderen液相色譜儀更換過(guò)濾器禿頭，環(huán)老化，鋼板，泄漏，檢測(cè)器維護(hù)氘燈(壽命約2000h，價(jià)錢(qián)5000-6000韓元)頻繁開(kāi)關(guān)開(kāi)關(guān)開(kāi)關(guān)=僅在需要4小時(shí)時(shí)才打開(kāi)，不使用時(shí)關(guān)閉沖床(平衡或清洗)很久沒(méi)有使用的時(shí)候，探測(cè)器內(nèi)可能會(huì)有氣泡，牙齒現(xiàn)象是檢測(cè)檢測(cè)信號(hào)參差不齊，波動(dòng)很大。解決方法是快速堵塞并釋放探測(cè)器的出口，如果堵塞，內(nèi)部壓力瞬間變大，泡沫就會(huì)冒出來(lái)。檢測(cè)器(出入液2管連接)堵塞，首先流入管堵塞(大多數(shù)情況下堵塞)

9、，用小流量倒沖，用流出管連接泵。顏色頻譜柱的維護(hù)顏色頻譜柱的保存，請(qǐng)參閱顏色頻譜柱的說(shuō)明書(shū)，普通反相頻譜柱(C18、C8等)裝滿(mǎn)顏色頻譜純甲醇或乙炔后，用蓋子密封兩個(gè)冰箱保存。色譜在開(kāi)始使用(或使用結(jié)束)時(shí)，用洗脫能力強(qiáng)的流沖洗，清除上次使用(或這次使用)固定床上殘留的樣品污染物等。在彩補(bǔ)酒清洗過(guò)程中，最好不要接受檢測(cè)儀。防止探測(cè)器受到污染。多次使用彩色頻譜柱(柱壓力高，柱效果低)后，參考手冊(cè)清洗再生。頻譜柱的正確連接，間隙最小化，減少死亡體積，減少頻譜桿的寬度，常見(jiàn)商品反色波耦合固定相，結(jié)合相穩(wěn)定性取決于粘接技術(shù)。流動(dòng)相有機(jī)分含量高時(shí)流動(dòng)相有機(jī)分含量低時(shí)，傳統(tǒng)粘接和封端(封尾)、固定相二甲基

10、硅烷、封端三甲、側(cè)鏈電阻基團(tuán)大的結(jié)合相分子在酸性條件下可以提高穩(wěn)定性。未密封端、雙峰端、三端、雙齒雙峰端、如何閱覽熱補(bǔ)說(shuō)明書(shū)，主要是顏色補(bǔ)熱和填充物參數(shù)、顏色補(bǔ)熱參數(shù)、基質(zhì)型直徑大小直徑大小碳含量高低焊條類(lèi)型柱內(nèi)徑頻譜長(zhǎng)度、超高效液相色譜法顏色頻譜(儀器方面為2004年Waters Aquity超高)頻譜柱方面在市場(chǎng)上展示了規(guī)格和品牌不同的亞2米(1.7米)頻譜柱，性能和工作范圍不同的超高效液相色譜法產(chǎn)品。Agilent 1200系列聚合物也使用快速液相色譜(RRLC)系統(tǒng)進(jìn)行快速分析，UPLC，超高效液相色譜(HPLC)UPLC超高效液相色譜法是世界上第一款商品化UPLC產(chǎn)品，Waters

11、ACQUITY UPLCTM超高效液相色譜質(zhì)譜儀在1996年上市后，安德倫、島津等公司也開(kāi)始陸續(xù)生產(chǎn)超高效色譜儀。目前，超高效液相色譜法系統(tǒng)已經(jīng)開(kāi)始逐漸投入液相實(shí)驗(yàn)。Agilent 1290液相色譜系統(tǒng)、UPLC的原理與HPLC相同，主要有所變化，例如小粒子、高性能微粒固定床的出現(xiàn)。HPLC柱，例如典型的十八烷基硅膠粘接柱，粒子大小為5um，UPLC柱可達(dá)到3.5um，甚至1.7um，具有較高的柱效率，更有利于物質(zhì)分離。超高壓輸液泵的使用。由于使用的顏色頻譜柱自然大小減少，使用時(shí)產(chǎn)生的壓力也增加了一倍。因此，液相色譜法的液化泵也相應(yīng)地改為超高壓液化泵。高速采樣率的敏感探測(cè)器。與傳統(tǒng)的HPLC相

12、比，UPLC的速度、敏感度和分離度分別是HPLC的9倍、3倍和1.7倍，通過(guò)縮短分析時(shí)間和減少溶劑使用量降低了分析成本。UPLC優(yōu)于HPLC，主要是更高效的分離效率，即分析時(shí)間短，分離度高。準(zhǔn)備顏色頻譜、準(zhǔn)備顏色光譜是獲得一定量(從幾毫克到千克，甚至噸級(jí))純品的顏色頻譜分離方法。制備光譜已成為醫(yī)藥工業(yè)(如外消化體藥物分子的分離)、生化技術(shù)(生物產(chǎn)品的純化和植物化學(xué)組分的純化)和精細(xì)化學(xué)物質(zhì)生產(chǎn)方面越來(lái)越重要的制備分離手段。很多高純度的標(biāo)本只能通過(guò)準(zhǔn)備色譜獲得。為了滿(mǎn)足生物中藥等復(fù)雜體系的分離純化任務(wù)，色寶燕越來(lái)越起著作用。準(zhǔn)備型液晶顯示術(shù)可以簡(jiǎn)單地看作是分析型液晶顯示術(shù)的擴(kuò)大。一是輸液泵有高流

13、量，二是大直徑和支柱填充物有大顆粒，第三是大流入量，第四是可以獲得純品。分析型光譜關(guān)注分離度和分離速度，為獲得正品而準(zhǔn)備光譜是唯一的目的，在犧牲分離度和分析速度的前提下獲得純品。準(zhǔn)備型和分析型液晶顏色光譜的異同、分析色頻譜目的分析樣品、獲得純品的準(zhǔn)備色光譜，如果分析型顏色頻譜注入量少，可以充分檢查，準(zhǔn)備色頻譜注入量盡可能大。分析頻譜柱內(nèi)徑1-5mm，準(zhǔn)備頻譜柱1-10cm或更大的分析柱填充7m。分析色譜速度10mL/min分析色譜檢測(cè)器可以破壞電化學(xué)檢測(cè)器等樣品，制備色譜檢測(cè)器不能破壞樣品。色譜流動(dòng)相分析不需要揮發(fā)性，必須具有揮發(fā)性，準(zhǔn)備色譜流動(dòng)相以方便蒸發(fā)，從而獲得樣品成分的純品。表14-2，準(zhǔn)備譜根據(jù)準(zhǔn)備量的高低分為半成品、燕子、工業(yè)燕子三個(gè)茄子類(lèi)別，使用的彩頭規(guī)格也越來(lái)越大，彩頭價(jià)錢(qián)的準(zhǔn)備也很貴，達(dá)數(shù)千數(shù)萬(wàn)，甚至數(shù)十萬(wàn)個(gè)。經(jīng)典的制備光譜以硅膠大小大的填充玻璃柱為準(zhǔn)備顏色頻譜柱，以正己烷-二氯甲烷等正色頻譜流相為乳液，準(zhǔn)備分離純化樣