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1、細(xì)菌鑒定技術(shù),常用細(xì)菌生化反應(yīng),糖發(fā)酵試驗(yàn) 吲哚試驗(yàn)(靛基質(zhì)試驗(yàn)) 甲基紅試驗(yàn) V-P(Voges-Proskauer)試驗(yàn) 枸櫞酸鹽(或檸檬酸鹽)利用試驗(yàn) 克氏雙糖鐵(KIA)復(fù)合試驗(yàn) 動(dòng)力、吲哚及脲酶(MIU)復(fù)合試驗(yàn),1.糖發(fā)酵試驗(yàn),【原理】: 各種細(xì)菌含有不同的分解糖(苷、醇)的酶,對(duì)糖(苷、醇)分解能力也各不相同,有的不分解,有的分解后僅產(chǎn)酸,有的分解后產(chǎn)酸產(chǎn)氣,故可用來鑒別細(xì)菌。 【方法】: 將大腸埃希菌和傷寒沙門菌分別接種葡萄糖、乳糖發(fā)酵管,35C培養(yǎng)18-24h 觀察結(jié)果。,1.糖發(fā)酵試驗(yàn),【結(jié)果】: 首先確定細(xì)菌是否生長(zhǎng),細(xì)菌生長(zhǎng)者培養(yǎng)基呈混濁狀: 1)不分解糖,培養(yǎng)基顔色與

2、接種前無變化,以“-”表示; 2)分解糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣,培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色,以“+”表示; 3)分解糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,除培養(yǎng)基顔色變化外,倒管中還有氣泡,以“”表示。大腸埃希菌分解葡萄糖和乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,傷寒沙門菌分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣,不分解乳糖。,2.吲哚試驗(yàn)(靛基質(zhì)試驗(yàn)),【原理】:有些細(xì)菌具有色氨酸酶,能分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚,與吲哚試劑形成紅色化合物。 【方法】:大腸埃希菌和傷寒沙門菌分別接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中,35C18-24h后,加入吲哚試劑數(shù)滴,靜置分層,觀察結(jié)果。 【結(jié)果】:在培養(yǎng)物液面上層呈玫瑰紅色為陽(yáng)性,不變色者為陰性。大腸埃希菌為陽(yáng)性,傷寒沙門菌為陰性。,3.甲基紅試驗(yàn),【原

3、理】:某些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,丙酮酸可進(jìn)一步分解為甲酸、乙酸等酸性物質(zhì),故培養(yǎng)基pH 在4.5以下,加入甲基紅指示劑后呈紅色(陽(yáng)性);有些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生的酸進(jìn)一步化為醇、酮等非酸性物質(zhì),使培養(yǎng)基pH在6.2以上,加入甲基紅指示劑后呈黃色(陰性)。 【方法】:大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌分別接種葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中,35C18-24h,加入甲基紅指示劑2-3滴觀察結(jié)果。 【結(jié)果】:紅色為陽(yáng)性,黃色為陰性。大腸埃希菌為陽(yáng)性,產(chǎn)氣腸桿菌為陰性。, +,4.V-P(Voges-Proskauer)試驗(yàn),【原理】:某些細(xì)菌分解葡萄糖生成丙酮酸,進(jìn)一步脫羧生成乙酰甲基甲醇,在堿性環(huán)境下被氧化成二乙酰

4、,后者與蛋白胨中的精氨酸所含的胍基起作用,生成紅色胍縮二乙酰,為VP試驗(yàn)陽(yáng)性。若培養(yǎng)基中胍基含量少,加入少量含胍基的化合物如肌酐,以加速其反應(yīng)。 【方法】:大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌分別接種于葡萄糖蛋白胨水中,35C,24-48h,加入VP試劑甲液和乙液各1滴,充分搖動(dòng),觀察。 【結(jié)果】:紅色為陽(yáng)性,若為陰性應(yīng)再培養(yǎng)4h觀察,仍無紅色者為陰性。大腸埃希菌陰性,產(chǎn)氣腸桿菌陽(yáng)性。, +,5.枸櫞酸鹽(或檸檬酸鹽)利用試驗(yàn),【原理】:當(dāng)細(xì)菌可以利用銨鹽作為唯一氮源,同時(shí)檸檬酸鹽為惟一碳源時(shí),可在檸檬酸鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng),分解檸檬酸鹽為碳酸鹽,使培養(yǎng)基變堿,指示劑溴麝香草酚藍(lán)由綠色變?yōu)樯钏{(lán)色為陽(yáng)性,培養(yǎng)基不變

5、色(綠色)為陰性。 【方法】:大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌分別接種于檸檬酸鹽培養(yǎng)基中,35C,24-48h,觀察。 【結(jié)果】:菌苔出現(xiàn),培養(yǎng)基變?yōu)樯钏{(lán)色為陽(yáng)性。細(xì)菌不能生長(zhǎng),培養(yǎng)基不變色(綠色)為陰性。產(chǎn)氣腸肝菌為陽(yáng)性,大腸埃希菌為陰性。,6.克氏雙糖鐵(KIA)復(fù)合試驗(yàn),【原理】:該培養(yǎng)基用酚紅指示劑,在酸性時(shí)呈黃色,堿性時(shí)呈紅色。細(xì)菌如能發(fā)酵乳糖和葡萄糖而產(chǎn)酸產(chǎn)氣,則斜面與底層均呈黃色,且有氣泡。如只發(fā)酵葡萄糖不發(fā)酵乳糖,因葡萄糖含量少,斜面所生的少量酸可因接觸空氣而氧化揮發(fā),從而使斜面部分保持原來的紅色;底層由于是在相對(duì)缺氧狀態(tài)下,細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖所生成的酸類物質(zhì)不被氧化揮發(fā)而保持黃色。如細(xì)菌分

6、解蛋白產(chǎn)生硫化氫,則與硫化亞鐵作用生成黑色的硫化鐵,使培養(yǎng)基變黑。,6.克氏雙糖鐵(KIA)復(fù)合試驗(yàn),【方法】:將待檢菌接種于克氏雙糖鐵培養(yǎng)基(底層穿刺,上層斜面劃線),35C,24h,觀察。 【結(jié)果】:發(fā)酵乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,則上層和底層均呈黃色且有氣泡產(chǎn)生;只發(fā)酵葡萄糖而不發(fā)酵乳糖,則底層變黃,上層仍為紅色。如底層變黑,說明該菌產(chǎn)生硫化氫,生成黑色的硫化鐵沉淀。,雙糖鐵培養(yǎng)基,標(biāo)準(zhǔn)管,痢疾桿菌 KA 斜面:K 紅色 底層:A 黃色,傷寒桿菌 KA ,大腸桿菌 AA ,沒產(chǎn)氣,沒產(chǎn)H2S,產(chǎn)H2S,產(chǎn)氣,7.動(dòng)力、吲哚及脲酶(MIU)復(fù)合試驗(yàn),【原理】:培養(yǎng)基為含尿素、蛋白胨的半固體培養(yǎng)基

7、,指示劑為酚紅。具色氨酸酶的細(xì)菌能分解色氨酸產(chǎn)生吲哚,加入吲哚試劑后,培養(yǎng)基上層的吲哚會(huì)變紅;具脲酶的細(xì)菌能分解尿素產(chǎn)氨,使整個(gè)培養(yǎng)基變堿呈紅色;有動(dòng)力的細(xì)菌沿穿刺線擴(kuò)散生長(zhǎng)。 【方法】:將大腸埃希菌和普通變形桿菌穿刺線接種于MIU培養(yǎng)基,35C,18-24h,觀察動(dòng)力和脲酶反應(yīng)后,再滴加吲哚試劑。 【結(jié)果】:擴(kuò)散生長(zhǎng)為動(dòng)力陽(yáng)性;滴加吲哚試劑后呈玫瑰紅色為陽(yáng)性;培養(yǎng)基變紅脲酶陽(yáng)性。,大腸埃希菌MIU() 普通變形桿菌MIU(),M:動(dòng)力,I:吲哚,U:尿酶,請(qǐng)記?。?大腸埃希菌KIA(AA)MIU(),上層變黃,下層變黃,產(chǎn)氣,沒產(chǎn)H2S,大腸埃希菌IMViC試驗(yàn)()右側(cè)為對(duì)照(),I:吲哚,

8、M:甲基紅,Vi:VP,C:枸櫞酸鹽,傷寒沙門菌KIA(K A)MIU(),沙門菌IMViC試驗(yàn)(),志賀菌KIA(K A)MIU(),志賀菌IMViC試驗(yàn)(),肺炎克雷伯菌KIA(A A )、MIU(),肺炎克雷伯菌IMViC試驗(yàn)(),產(chǎn)氣腸桿菌IMViC試驗(yàn)(),變形桿菌KIA(K A+ + )MIU(+ +/- +),血漿凝固酶試驗(yàn): 1)原理:金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生結(jié)合型血漿凝固酶(凝聚因子),可使血漿中可溶性的纖維蛋白原變?yōu)椴蝗苄缘睦w維蛋白,附著于細(xì)菌表面,在玻片上形成凝塊;游離型的血漿凝固酶則可使試管中的血漿發(fā)生凝固。 金黃色葡萄球菌的凝固酶陽(yáng)性,表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌的凝固酶陰

9、性。,【原理】 氧化酶或稱細(xì)胞色素氧化酶,是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶。作氧化酶試驗(yàn)時(shí),此酶首先使細(xì)胞色素C氧化,然后氧化型細(xì)胞色素C再使對(duì)苯二胺氧化,產(chǎn)生顏色反應(yīng)。 【方法】取濾紙一角,沾取菌落少許,加試劑一滴,陽(yáng)性者立即粉紅色,并于5-10秒內(nèi)呈現(xiàn)深紫色。,氧化酶試驗(yàn),銅綠假單胞菌:陽(yáng)性 大腸埃希菌:陰性,【原理】過氧化氫酶可使過氧化氫分解為分子態(tài)氧。 【方法】 滴加3%過氧化氫溶液數(shù)滴于玻片上,挑取固體培養(yǎng)基上的菌落少許于過氧化氫溶液,觀察結(jié)果。 【 結(jié)果】 30s內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡者為陽(yáng)性。,過氧化氫酶(觸酶)試驗(yàn),葡萄球菌:陽(yáng)性 鏈球菌:陰性,【原理】某些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶分解尿素,產(chǎn)

10、氨使培養(yǎng)基變堿。 【方法】將被檢菌接種尿素培養(yǎng)基,35培養(yǎng)1824h觀察結(jié)果。陰性時(shí)應(yīng)繼續(xù)觀察4d。 【 結(jié)果】酚紅指示劑變紅為陽(yáng)性,不變?yōu)殛幮?。變形桿菌陽(yáng)性,大腸埃希菌陰性。,尿素酶試驗(yàn),【原理】當(dāng)細(xì)菌能利用枸櫞酸鹽作為唯一碳源時(shí),可在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)分解枸櫞酸鈉,使培養(yǎng)基變堿。 【方法】在枸櫞酸鹽瓊脂斜面上濃密劃線,接種被檢菌,于35培養(yǎng)14d,逐日觀察結(jié)果。 【 結(jié)果】枸櫞酸鹽培養(yǎng)基斜面上有細(xì)菌生長(zhǎng),培養(yǎng)基變藍(lán)為陽(yáng)性;無細(xì)菌生長(zhǎng)、顏色不變(綠色)為陰性。 大腸埃希菌:陰性 產(chǎn)氣腸桿菌:陽(yáng)性,枸櫞酸鹽利用試驗(yàn),涂片,干燥,固定,染色,水洗,鏡檢,簡(jiǎn)單染色方法,干燥,初染 將玻片置于玻

11、片擱架上,加草酸銨結(jié)晶紫染色液(加量以蓋滿菌膜為度),染色1min。傾去染色液,用自來水小心地沖洗。 媒染 滴加(Lugol)碘液,染1min,水洗。 脫色 滴加95%乙醇,脫色30s立即水洗,以終止脫色。 復(fù)染 滴加蕃紅,染色30s ,水洗。最后用吸水紙輕輕吸干。,革蘭氏染色,注意:水洗時(shí),不要直接沖洗涂面,而應(yīng)使水從載玻片的一端流下。水流不宜過急,過大,以免涂片薄膜脫落。,抗酸染色法,分枝桿菌屬的細(xì)菌(包括結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌等)為抗酸性細(xì)菌,一般染色法不易著色,須用抗酸染色法。 注意事項(xiàng) 涂片要略厚 加溫染色或延長(zhǎng)染色時(shí)間,加溫時(shí)隨時(shí)補(bǔ)加染色液 分枝桿菌呈紅色(+) 其他細(xì)菌和背景為藍(lán)色(-)。,操作過程,取痰液 涂片(略厚)干燥固定 石炭酸復(fù)紅加溫染色810分鐘后 用3%的鹽酸酒精脫色約12分鐘, 脫色

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