分子遺傳學-6

1、6 重組與轉(zhuǎn)座,生物進化的基礎是可遺傳的變異，而變異的主要來源是基因突變（gene mutation）和遺傳重組（genetic recombination）。就每個生物體而言，基因突變發(fā)生頻率畢竟很低，如果沒有遺傳重組，染色體之間不發(fā)生物質(zhì)交換，每個染色體中的等位基因?qū)⒂肋h固定在其特定位置，那么即使基因發(fā)生突變，有利或不利變異無法分開，這樣靶基因中有害突變長度會不斷延伸，從一個基因擴展到整個染色體，最終一條染色體上有害突變不斷積累導致其功能的喪失而消除，并因此也將導致有利變異一同被淘汰。通過遺傳重組或基因重排可使有利突變和有害突變分開，并作為一個新的組合單元接受自然的或人工的選擇考驗。這不僅

2、有助于有利等位基因的保存與擴散，而且又不影響其他連鎖基因消除有害基因，這就是自然選擇的基礎。,重組既可在完全對應的同源序列之間發(fā)生，這稱為同源重組（homologous recombination）；也可發(fā)生在局部的同源序列之間的特定位點，這稱為位點專一性重組（site-specific recombination）；以及發(fā)生在彼此同源性很小或沒有同源性的DNA序列之間的異常重組（illegitimate recombination）。 此外還有一種完全不依賴于同源序列的DNA片斷的轉(zhuǎn)移，這些DNA序列可以從染色體的某個位點轉(zhuǎn)移到其它位點，這稱為轉(zhuǎn)座（transposition）。由于它同樣涉

3、及DNA鏈的斷裂和重接，所以與重組過程相關，而且它廣泛地存在各類生物的基因組中，如人類基因組中最多的組分是由轉(zhuǎn)座子組成。,這里所討論的“遺傳重組”與“重組DNA技術”不是一回事，前者指發(fā)生在生物體內(nèi)的基因交流，是生物體自身所具有的生命現(xiàn)象。分子遺傳學正是要在分子水平上研究并揭示其發(fā)生機制；而后者是指在體外人為地將不同來源的DNA組合在一起，有目的有計劃地改造生物體的一項技術和手段，兩者的原理和機制相差甚遠。,此外，遺傳重組也不同于二倍體生物在有性繁殖的減數(shù)分裂過程中同源染色體分離，非同源染色體自由組合到不同配子中去，盡管雌雄配子結(jié)合也產(chǎn)生基因型各不相同的后代，但在該過程中顯然不涉及DNA分子之

4、間遺傳物質(zhì)的交換。而遺傳重組，不論是同源重組，位點專一性重組和異常重組以及轉(zhuǎn)座等，其共同特征是涉及DNA分子內(nèi)斷裂與重接（breakage and reunion）的基因重組過程。這類遺傳重組有時也稱遺傳交換（crossing over）。實際上，所有的DNA都是重組DNA，只要有DNA就會有遺傳重組。,在真核生物中，雙鏈DNA分子間的基因重組是完成減數(shù)分裂所必須的，而且基因重組發(fā)生在減數(shù)分裂前期的同源染色體形成聯(lián)會復合體的過程中。染色體變得可見就標志著減數(shù)分裂開始，每個染色體都是由已經(jīng)復制的，兩條姐妹染色單體組成，每個染色單體都含有一條雙鏈DNA分子。同源染色體相互接近，在一個或多個區(qū)域配對

5、形成二價體（bivalent）。配對一直進行到整個染色體的同源部位并排在一起，該過程稱為聯(lián)會（synapsis）或染色體配對（chromosome pairing）。聯(lián)會結(jié)束時同源染色體以聯(lián)會復合體（synaptinemal complex）形式并排在一起。盡管不同生物中聯(lián)會復合體在細節(jié)上有很大差異，但同一物種內(nèi)它們都有共同的特征性結(jié)構(gòu)，如交叉點（chiasma）結(jié)構(gòu)的形成,這些過程發(fā)生的分子基礎是每一條姐妹染色單體含有一條DNA雙鏈分子，所以每個二價體含有4條雙鏈DNA分子。在重組過程中，來自姐妹染色單體的雙鏈DNA分子與另一同源姐妹染色單體之間相互作用。這種反應可能在兩個分子中任何配對的相

6、應序列之間發(fā)生。反應的發(fā)生可使遺傳物質(zhì)在單個堿基對水平精確地發(fā)生交換。,單鏈之間的互補性是核苷酸相互識別的基礎。提供單鏈的第一步是在每條DNA雙鏈上產(chǎn)生一個切口，然后雙鏈的一條單鏈或是兩條單鏈同時被釋放出來。如果一條鏈與相應的另一雙鏈DNA分子中的單鏈發(fā)生交換，這兩條雙鏈DNA分子就會在這些特定的相對應序列處連接；如果單鏈的交換進一步延伸，則雙鏈DNA分子之間的連接會更多，然后通過鏈的交換和隨后的切割，可能通過與斷裂和重組相關的交換事件使來自父母雙方的雙鏈DNA分子連接起來。,6.1.2遺傳重組的類型 （1）同源重組 （homologous recombination）又稱普遍性重組（gene

7、ralized recombination），它的發(fā)生是依賴大范圍的DNA同源序列的聯(lián)會（synapsis）。在真核生物中，重組發(fā)生在減數(shù)分裂時期的同源染色體的非姐妹染色單體的DNA分子之間相互交換對等的部分。細菌中的轉(zhuǎn)化，接合和轉(zhuǎn)導中所產(chǎn)生的重組均屬于同源重組，但所產(chǎn)生的重組子是單向重組，即僅使受體發(fā)生重組，供體并未發(fā)生改變。同時細菌中的同源重組需要RecA蛋白的參與，因此又稱為依賴RecA的重組（dependent recombination RecA）。,同源重組中負責DNA配對和重組的蛋白質(zhì)因子無堿基序列的特異性，只要兩條DNA序列相同或接近，重組就可以在此序列中任何一點發(fā)生，但存在重

8、組熱點，即某類序列發(fā)生重組的概率高于其他序列。此外，真核生物的染色質(zhì)狀態(tài)影響重組，如異染色質(zhì)及其附近區(qū)域很少發(fā)生重組。而且兩個DNA分子序列同源區(qū)越長越有利于重組。,（2）位點專一性重組 這種重組發(fā)生在特定的含有短的同源序列的位點之間，因此稱為位點專一性重組（site-specific recombination），通常在原核生物中發(fā)生。重組依賴于小范圍同源序列的聯(lián)會，其重組事件只涉及這一小范圍特定的位置或特定堿基序列之間。重組時發(fā)生精確的切割與連接反應，DNA既不丟失也不增加堿基。兩個DNA分子并不交換對等的序列，有時是一個DNA分子整合到另一個DNA分子中，因此將這種形式的重組又稱為整合式

9、重組（integrative recombination）。,（3）轉(zhuǎn)座重組 有些可移動的遺傳成分可在不同基因或不同染色體之間轉(zhuǎn)移遺傳信息，這稱為轉(zhuǎn)座（transposition）。轉(zhuǎn)座機制不依賴于DNA序列之間的同源性，但涉及DNA斷裂與重接，所以也是一種重組類型。轉(zhuǎn)座分為復制型，非復制型和保守型三種類型，并需要轉(zhuǎn)座酶、解離酶和DNA聚合酶的參與，同時轉(zhuǎn)座因子之間的重組會引起缺失和到位。,（4）異常重組 異常重組(illegitimate recombination)按其機制分為兩類：末端連接（end-joining）和鏈滑動（strand-slippage），后者又稱拷貝選擇（copy c

10、hoice）重組。末端連接是指斷裂DNA末端彼此連接；鏈滑動是指DNA復制時，由一個模板跳躍到另一個模板所引起的重組。這種重組發(fā)生在彼此同源性很小或沒有同源性的DNA序列之間，可以在DNA不同位點發(fā)生，它們可能是最原始的重組類型，不需要對特異性序列進行識別的復雜系統(tǒng)或?qū)NA同源序列進行識別的機制。,異常重組的結(jié)果可能會產(chǎn)生移碼，缺失、倒位、融合和DNA擴增等，因而與腫瘤及遺傳疾病的發(fā)生有關，直接影響著基因組的完整性，但也是基因組進化的重要途徑。 根據(jù)發(fā)生的機制不同將遺傳重組分為了以上幾種類型，實際上許多重組反應常同時利用幾種機制進行，如：Tn10的轉(zhuǎn)座涉及到轉(zhuǎn)座和同源性重組； 免疫球蛋白VD

11、J連接涉及到位點特異性識別和一種類似異常重組的末端連接過程； 酵母接合型的轉(zhuǎn)換既具有同源重組和位點特異性重組的特征，也具有復制轉(zhuǎn)座的特征等等。,6.2真核生物同源重組的分子機制 6.2.1同源重組的Holliday模型 6.2.2雙鏈斷裂起始重組模型 6.2.3重組與聯(lián)會復合體 6.2.4 基因轉(zhuǎn)換導致等位基因間的重組 6.3 細菌同源重組的分子基礎 6.3.1 RecBCD識別Chi序列引發(fā)重組 6.3.2 RecA催化單鏈同化 6.3.3 Ruv系統(tǒng)解離Holliday連接點 6.4 位點專一性重組的分子機制 6.4.1 噬菌體的整合與切離 6.4.2 位點專一性重組的機理 6.4.3 噬

12、菌體重組發(fā)生在整合體中,6.5 轉(zhuǎn)座因子及其分類 6.5.1. 轉(zhuǎn)座因子的發(fā)現(xiàn) 早在20世紀初，Emerson于1914年在研究玉米果皮色素遺傳的過程中，發(fā)現(xiàn)一種花斑果皮的突變類型。這種突變可發(fā)生多次回復突變，從而產(chǎn)生寬窄不同、紅白相間的花斑。在玉米籽粒、金魚草葉片和花瓣上都可見花斑表型（圖6-18a）。他意識到這種花斑的產(chǎn)生是由于突變基因的不穩(wěn)定性，但如何不穩(wěn)定不得其解。,到1938年M.Rhoades在研究玉米籽粒糊粉層色素遺傳時，發(fā)現(xiàn)籽粒有色純種自花授粉的后代中，表現(xiàn)出一種意外的雙因子雜種修飾性的孟德爾分離比：有色斑點白色=1231，顯然這兩個基因是不連鎖的。他認為控制色素基因A1突變?yōu)?/p>

13、等位基因a1時表現(xiàn)為無色；另一座位基因是Dt（斑點）表型為有色斑點。這樣原來的品系基因型為A1A1dtdt，突變后產(chǎn)生了A1a1Dtdt的植株，這種雙突變植株自交就產(chǎn)生了上述比例介于零突變與野生型之間。功能缺失突變一般是隱性突變。,但是什么因素導致或產(chǎn)生花斑呢？一種可能是在體細胞中產(chǎn)生了回復突變a1A1，但大量的斑點需要很高頻率的回復突變。a1成為首次發(fā)現(xiàn)的不穩(wěn)定突變等位基因（unstable mutant allele）的例子，即一種回復突變率很高的等位基因。然而這種等位基因的不穩(wěn)定性取決于不連鎖的Dt基因的存在。一旦回復突變發(fā)生，他們就變得穩(wěn)定了；即Dt基因能離開A1基因，這時A1表型不再

14、改變。a1表型是由一個缺陷型轉(zhuǎn)座因子的插入而產(chǎn)生的，而缺陷的轉(zhuǎn)座因子自己不能移動。因而Dt的缺乏使得表型保持穩(wěn)定。顯然Rhoades這時已發(fā)現(xiàn)了某些基因的不穩(wěn)定性，而且這種不穩(wěn)定性是由另一個獨立因子所控制。但仍未揭示這種不穩(wěn)定性遺傳的機制，也缺乏實驗證據(jù)。,McClintock于1940年至1950年在美國康奈爾大學和冷泉港實驗室工作期間，研究玉米花斑糊粉層和植株色素產(chǎn)生的遺傳基礎中，也發(fā)現(xiàn)玉米籽粒上有色素斑點的變化。當時已知許多基因共同控制紅色花青素的合成使玉米胚乳成紫色。這些基因中任何一對基因發(fā)生突變都會影響色素的合成，并使胚乳呈白色。如人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)控制玉米糊粉層顏色至少有5對相關基因：A

15、代表花色素（anthocyan），如A變?yōu)閍，無論什么顏色都不會發(fā)生；C代表顏色（corlor），決定紅色和紫色的發(fā)生；R代表紅色（red），其作用是以A、C兩基因的存在為先決條件；Pr代表紫色（purple），它是在紅色基礎上輔助成紫色的，沒有A、C、R基因，即使它是顯性也不能使玉米籽粒產(chǎn)生任何顏色； I稱為抑制基因（inhibitor,I），它抑制C基因的作用，C基因如被抑制，則紅色與紫色都不會發(fā)生。,McClintock研究了玉米胚乳的紫色、白色以及白色背景上帶有紫色斑點這些表型之間的相互關系。她發(fā)現(xiàn)花斑表型是不穩(wěn)定的，并根據(jù)自己的遺傳學和細胞學研究結(jié)果推斷“花斑”這種表型并不是一般的基

16、因突變產(chǎn)生的，而是由于一種控制因子的存在導致的。她認為若玉米帶有野生型C基因，則胚乳呈紫色，C基因的突變阻斷了紫色素的合成，那么胚乳呈白色。在胚乳發(fā)育的過程中，突變發(fā)生回復導致斑點的產(chǎn)生。而回復突變的遺傳學性質(zhì)受到這樣一種事實的支持，即細胞的后代經(jīng)過回復突變也能產(chǎn)生色素?；貜屯蛔儼l(fā)生在早期發(fā)育階段，紫斑就比較大。McClintock認為原來的C突變（無色素）是由一個“可移動的控制因子”，當時稱為抑制基因即I基因，現(xiàn)在稱為Ds，即解離因子（dissociator）。它可以插入到C基因中。另一個可移動的控制因子是Ac，稱激活因子（activator），它的存在激活Ds轉(zhuǎn)座進入C基因或其他基因中，也

17、能使Ds從基因中轉(zhuǎn)出，使突變基因回復，這就是著名的Ac-Ds系統(tǒng)。,抑制突變發(fā)生在與原來突變不同的基因內(nèi)，則為基因間抑制突變（intergenic suppression）。第二個突變的基因?qū)τ诘谝粋€突變的基因來講為抑制子（suppressor），兩個基因之間可能在基因組上的位置相距甚遠，甚至在不同的染色體上。一般來講抑制子的抑制作用是高度專一的，有的抑制作用發(fā)生在同一個作用途徑中，只對一個或少數(shù)幾個基因起作用。例如在一個代謝反應過程中由于一個重要的基因造成的中間產(chǎn)物的積累導致的表型變化可以被位于同一代謝途徑中前面的基因的突變所抑制。常用的研究抑制子的技術是對原來的突變體進行第二次誘變，通過分

18、子遺傳學原理與方法克隆這個抑制子基因（suppressor gene），這對于研究兩個基因產(chǎn)物的相互作用和代謝途徑具有非常重要的意義。McClintock還發(fā)現(xiàn)Ds可導致所在位置的染色體斷裂，這種斷裂可以通過細胞學的方法和遺傳學的方法加以檢測。發(fā)現(xiàn)Ds位于玉米的9號染色體的一條臂上，該染色體一端帶有結(jié)節(jié)（knob），在Ds位點易發(fā)生斷裂。,McClintock根據(jù)大量遺傳學和細胞學研究結(jié)果，于1952年提出了生物基因組中存在可移動的控制因子學說。這些控制因子可以沿染色體移動，也可以在不同染色體之間跳躍。因此又稱為跳躍基因（jumping gene）。這是遺傳學發(fā)展史中劃時代的重大發(fā)現(xiàn)，把基因概

19、念向前推進了一大步。可是由于當時人們受基因固定排列于染色體上的傳統(tǒng)觀念束縛，加之分析技術的限制，因而這項超時代的成果并未受到同行所重視。,直到20世紀60年代P.A.Jacob和L.Monod的乳糖操縱子模型和調(diào)控基因理論發(fā)表后，特別是J.Shapiro在細菌中也發(fā)現(xiàn)了可轉(zhuǎn)座的遺傳因子后，這一成果才被接受，他在大腸桿菌半乳糖操縱子中發(fā)現(xiàn)了半乳糖基因的突變體稱為gal，由于噬菌體的整合位置在gal基因的旁邊，易于得到帶有gal基因的轉(zhuǎn)導噬菌體dgal。實踐證明，這種突變不能被堿基置換所回復，說明它不是一般的點突變。又由于這種突變可回復，因此也不是缺失突變。最終通過密度梯度離心實驗證明dgal的比

20、重大于 dgal的比重。,進一步將兩者DNA變性并相互復性，在電境下可觀察到一部分雜合雙鏈上出現(xiàn)一個多余的DNA環(huán)，從而證明這種突變體是由于DNA片段插入而產(chǎn)生的，這一插入序列（insertional sequence,IS）是最先發(fā)現(xiàn)的最小的一種轉(zhuǎn)座因子，稱為IS1。IS序列就是在細菌中首次發(fā)現(xiàn)的移動基因，并在分子水平上得到證實。至此，移動基因的概念才被大家所公認。接著在利用細菌的抗藥性質(zhì)粒（R質(zhì)粒）構(gòu)建載有卡拉霉素（kanamycin）抗性基因的噬菌體的過程中，發(fā)現(xiàn)抗藥性基因的傳播非?？?，它可以從一種R質(zhì)粒跳躍到另一質(zhì)粒上，也可以跳躍到另一些DNA序列，如噬菌體或細菌染色體上。根據(jù)DNA分

21、子雜交知道，與卡拉霉素抗性有關的DNA序列長5.2kb，兩端接有長1.5kb的顛倒重復序列。當抗藥性基因跳躍時，顛倒重復序列也隨之轉(zhuǎn)移。具有這種結(jié)構(gòu)和特性的DNA序列就叫做轉(zhuǎn)座子（transposon，Tn）或Tn因子，如Tn3和Tn5等。至此，幾乎在各類生物基因組中都發(fā)現(xiàn)有不同類型的可遺傳的轉(zhuǎn)座因子。因此McClintock于1983年獲得諾貝爾獎。,6.5.2 DNA轉(zhuǎn)座 可移動位置的遺傳因子包括兩種類型：一種類型是直接以DNA序列某些區(qū)段作為轉(zhuǎn)座成分的, 如McClintock 在玉米中發(fā)現(xiàn)的控制因子和Shapiro在大腸桿菌半乳糖操縱子中發(fā)現(xiàn)的IS都是涉及DNA直接轉(zhuǎn)座，因而稱為DNA

22、轉(zhuǎn)座。另一種類型是以RNA為中介進行轉(zhuǎn)座，稱為反轉(zhuǎn)座子（retroposon）或反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（retrotransposon）。這里先討論DNA轉(zhuǎn)座，根據(jù)轉(zhuǎn)座子移動機制，DNA轉(zhuǎn)座可分為三種類型：,復制型轉(zhuǎn)座（replicative transposition） 在轉(zhuǎn)座反應過程中，轉(zhuǎn)座子被復制，轉(zhuǎn)座的序列實際上是原轉(zhuǎn)座子的一個拷貝（圖6-22a）。轉(zhuǎn)座子中移動的部分被拷貝，一個拷貝保留在原位點，而另一個拷貝則插入到新的位點，因此其轉(zhuǎn)座過程是伴隨著轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的增加。復制型轉(zhuǎn)座涉及兩種類型的酶：一是轉(zhuǎn)座酶（transposase），他作用在原轉(zhuǎn)座子的末端；另一種為解離酶（resolvase）或稱

23、拆分酶，它作用于復制的轉(zhuǎn)座子拷貝。例如與TnA有關的一組轉(zhuǎn)座子只通過復制型轉(zhuǎn)座機制移動。,（2）非復制型轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座因子作為一個物理性實體，直接從一個位點移動到另一個位點，并且保守性很強。這可以通過兩種機制實現(xiàn)：一種是利用供體與靶DNA的連接，并且有些步驟與復制型轉(zhuǎn)座相同。插入序列和復合轉(zhuǎn)座子Tn10和Tn5即利用這種轉(zhuǎn)座機制。另一種是轉(zhuǎn)座過程中轉(zhuǎn)座子必須從供體DNA上釋放，這種機制只需要轉(zhuǎn)座酶。非復制型轉(zhuǎn)座的兩種機制皆導致轉(zhuǎn)座子離開供體位點并插入到靶位點。在發(fā)生非復制型轉(zhuǎn)座之后，供體分子是如何變化呢？其存活可能需要宿主修復系統(tǒng)識別雙鏈缺口，并對其進行修復。,（3）保守型轉(zhuǎn)座。這種轉(zhuǎn)座實質(zhì)是另一種

24、非復制型轉(zhuǎn)座過程。在此過程中，轉(zhuǎn)座元件從供體位點上切除并通過一系列過程插入到靶位點上，其所有堿基均被保留。保守型轉(zhuǎn)座與噬菌體整合機制非常相似，并且其轉(zhuǎn)座酶與整合酶相關。應用保守型轉(zhuǎn)座機制的轉(zhuǎn)座子較大，并且除了介導轉(zhuǎn)座子本身轉(zhuǎn)移外，還能將供體細菌的DNA轉(zhuǎn)移到另一種細菌。雖然這種元件最初被歸類為轉(zhuǎn)座子，但稱為附加體更加確切。,6.5.3反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 該類轉(zhuǎn)座因子的轉(zhuǎn)座過程均以RNA為中介，通過反轉(zhuǎn)錄酶將轉(zhuǎn)座子RNA拷貝為cDNA后再整合到寄主基因組中（圖6-23），因此稱為反轉(zhuǎn)座因子。包含反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)錄病毒（retroviruses）。,反轉(zhuǎn)座因子只在真核生物基因組中發(fā)現(xiàn)，迄今尚未在原核生

25、物中找到。一些反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與細胞中游離的反轉(zhuǎn)錄病毒基因組之間有許多相似性。 反轉(zhuǎn)錄病毒的基因組為RNA分子，可感染許多脊椎動物，該病毒感染細胞后，由病毒基因組編碼的反轉(zhuǎn)錄酶將其RNA拷貝為cDNA，然后整合到寄主基因組中。新的病毒產(chǎn)生必須由整合的DNA轉(zhuǎn)錄為RNA，合成由病毒基因組編碼的蛋白質(zhì)外殼，然后再進行包裝（圖6-24a）。已經(jīng)整合到脊椎動物染色體中的反轉(zhuǎn)錄病毒基因組稱為內(nèi)源反轉(zhuǎn)錄病毒（endogenous retroviruses ERVs）。這些ERV中有些仍有活性，在活細胞的一定生活時期可指導內(nèi)源病毒的合成，但大多數(shù)ERV已無功能。這些無功能的病毒基因組拷貝雖然分散在基因組中，但不

26、能擴增，人類基因組中約有10 000個殘缺的病毒拷貝。還有一類稱為類反轉(zhuǎn)錄因子（retrovirus like elements, RTVLS），人類基因組中有近20 000拷貝。,反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子具有類似ERV的順序，只是沒有編碼外殼蛋白的基因（env）,故不能包裝形成具有蛋白質(zhì)外殼的顆粒。這類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子分布在非脊椎動物基因組中，如植物、真菌和無脊椎動物中，脊椎動物中少見。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在某些生物基因組中有很高的拷貝，有許多不同的類型，玉米基因組中大多數(shù)分散重復順序都是反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，它與反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)類似，而且都含有負責轉(zhuǎn)座的長末端重復（long terminal repeats,LTR）順序，

27、因此又稱LTR因子。,長分散核因子（long interspersed nuclear element,LINE）含有同反轉(zhuǎn)座有關的類反轉(zhuǎn)座基因。人類基因組中的LINE 1是典型的長分散核因子，長6.1Kb,含3 500個全長的拷貝，另外有數(shù)萬個殘缺的拷貝。 短分散核因子（short interspersed nuclear element,SINE）本身無反轉(zhuǎn)座酶基因，但可借用寄主中的反轉(zhuǎn)座酶實現(xiàn)轉(zhuǎn)座（圖6-24d）。人類基因組中最普遍的SINE為Alu，它有上百萬拷貝。最初的Alu可能是7SL RNA偶爾的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，并整合到基因組中。因Alu拷貝含有內(nèi)啟動子，具有轉(zhuǎn)錄活性，細胞可轉(zhuǎn)錄大量

28、的Alu RNA，從而提供了該成分大量擴增的機會,此外，還有只分布在哺乳動物中的分散重復順序是起源于tRNA，在靈長類基因組中的拷貝數(shù)估計為120 000300 000。由于tRNA基因含有內(nèi)部啟動子，如同Alu重復因子一樣，MIR也可經(jīng)反轉(zhuǎn)錄大量拷貝整合到基因組中。 反轉(zhuǎn)錄病毒只在脊椎動物中發(fā)現(xiàn)，他們可能起源于吉普賽Gypsy反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座因子，獲得編碼衣殼蛋白基因（env）后成為可感染動物細胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒。植物中含有除反轉(zhuǎn)錄病毒之外的所有反轉(zhuǎn)座因子。,6.6原核生物中的轉(zhuǎn)座因子 6.6.1插入序列 根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和遺傳性質(zhì)可將原核生物中的轉(zhuǎn)座因子分為插入序列（IS）、轉(zhuǎn)座子（Tn）、轉(zhuǎn)座噬菌體（

29、mutator phage，Mu）。轉(zhuǎn)座因子是存在于染色體DNA上可自主復制和轉(zhuǎn)位的基本單位，其中最簡單的轉(zhuǎn)座子不含任何宿主基因的可轉(zhuǎn)位的DNA序列就稱為IS。它們是細菌染色體或質(zhì)粒DNA的正常組成部分。如大腸桿菌基因組中約有20種不同的DNA轉(zhuǎn)座因子，都含有編碼轉(zhuǎn)座酶的基因。一個細菌細胞常帶有多個IS序列。它們都是可以獨立存在并轉(zhuǎn)座的單元，因為帶有介導自身轉(zhuǎn)座的轉(zhuǎn)座酶。大多IS序列已被鑒定，如IS1的全長為768bp，它的兩端有18/23bp的反向重復序列。IS本身沒有任何表型效應，只攜帶和它轉(zhuǎn)座作用有關的基因，稱為轉(zhuǎn)座酶基因。它們是一類較小的轉(zhuǎn)座因子，可以從染色體的一個位置轉(zhuǎn)移到另一個位置

30、，或從質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到染色體上，它們改變位置的行為稱為轉(zhuǎn)座（transposition）。,如F因子和大腸桿菌的染色體上有一些相同的插入序列，即IS2、IS3等等。通過這些同源序列之間的重組，F(xiàn)因子便插入染色體中成為Hfr菌株。目前已知的IS至少有10余種，如IS1、IS2、IS3、等等，雖然它們的大小不同，但有某些共同的結(jié)構(gòu)特征。如每種IS兩端的核酸順序完全相同或相近，但方向相反，所以稱為反向重復序列（inverted repeat sequence,IR ）。已知各種IS的長度在7685 700bp之間，它們的兩端有幾個到幾十個的反復重復序列。如IS1的兩端IR長23核苷酸對，其中18bp在兩端

31、是相同的。而IS2的兩端是41核苷酸對的IR。,含有IS的質(zhì)粒經(jīng)變性后，分別以單鏈復性，于是在電鏡下出現(xiàn)頸環(huán)結(jié)構(gòu)，頸的部分是IS的IR序列，大環(huán)是質(zhì)粒DNA，小環(huán)是IS的中間序列（圖6-26）。而且當一個IS插入“靶”DNA后，在插入片段的兩端出現(xiàn)一小段正向重復的靶DNA序列，每種IS插入形成這種正向重復序列的長度是不同的，一般為511核苷酸對。,6-25 IS結(jié)構(gòu)模式圖(引自Lewin , 2006),6.6.2 轉(zhuǎn)座子 轉(zhuǎn)座子（transposon, Tn）是一類較大的轉(zhuǎn)座因子，除了含有與它轉(zhuǎn)座作用有關基因外，還帶有抗藥基因以及其他基因，如乳糖發(fā)酵基因。因此Tn的轉(zhuǎn)座能使宿主菌獲得有關基因

32、的特性，已發(fā)現(xiàn)有多種Tn，如Tn1、Tn2、Tn3等。Tn分子大小一般在2 00025 000bp，兩端有相同序列，如IR序列。某些Tn的IR便是已知的IS，帶有IS的Tn也稱為復合轉(zhuǎn)座子（composite transposon）。Tn5、Tn10 和Tn903都屬于一類復合轉(zhuǎn)座子，結(jié)構(gòu)比較特殊，其主序列長2.7kb左右，位于中央，兩個IS序列以相反的極性位于主序列兩側(cè)（圖6-27a）。不含IS 的Tn稱為簡單轉(zhuǎn)座子（simple transposon），如TnA家族等（圖6-27b）。,圖6-27 復合轉(zhuǎn)座子和簡單轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)(引自Griffiths,2005),Tn5主序列含有幾個抗生素

33、抗性基因，包括卡拉霉素（kanamycin）、鏈霉素（streptomycin）和博萊霉素（bleomycin）一類的抗生素基因。Tn5主序列兩側(cè)的IS因子既是Tn5的重要組成部分，同時也是一種自主性的轉(zhuǎn)座子。位于Tn5右側(cè)的IS50R編碼兩種與轉(zhuǎn)座有關的酶，其中一種（蛋白1）為轉(zhuǎn)座酶，另一種（蛋白2）為轉(zhuǎn)座抑制蛋白，這兩種蛋白質(zhì)都由同一段DNA序列編碼。Tn5左側(cè)的IS50L與IS50R只是一對堿基的差別，但這一微小差別會產(chǎn)生兩種重要影響， 在轉(zhuǎn)座酶編碼區(qū)內(nèi)，IS50R原為CAA(谷氨酰胺)變?yōu)閁AA終止密碼子造成琥珀突變（ochre mutation），產(chǎn)生翻譯的終止信號，所以這種突變蛋白

34、不具有轉(zhuǎn)座功能。Tn10兩邊的IS因子也是IS10R含轉(zhuǎn)座酶基因，而IS10L則不含轉(zhuǎn)座酶基因。形成一個Tn5主區(qū)中卡拉霉素抗性基因的啟動子（P2），所以IS50L對主序列Tn因子的轉(zhuǎn)錄具有重要影響（圖6-28）,Tn5的這種結(jié)構(gòu)特征表明，兩個IS夾住一個Tn5主序列并促使其轉(zhuǎn)座到新的位點上。Tn5轉(zhuǎn)座時，首先從染色體上切割下來，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，然后再插入到新的座位上。因此，Tn5是非復制型轉(zhuǎn)座，只是從一個位點轉(zhuǎn)移到另一個位點，在原位并不留下一個拷貝。Tn5轉(zhuǎn)座到新的位點上后，兩端都形成一段順式重復序列。 轉(zhuǎn)座子賦予宿主細菌一定的表型，如帶有抗藥性基因的轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒便是抗藥性質(zhì)粒，根據(jù)這一特性采用

35、相應的方法來檢測某質(zhì)粒上是否存在轉(zhuǎn)座子。如該質(zhì)粒是一個非轉(zhuǎn)座性的，上面有一個ARTn，將另一個帶有抗性基因BR的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒引進同一細菌，然后把敏感細胞和帶有這兩個質(zhì)粒的細菌進行接觸轉(zhuǎn)移試驗，在特定的培養(yǎng)條件下使后者不能生長。如果一部分敏感細胞中出現(xiàn)ARBR表型，這就說明AR屬于某一轉(zhuǎn)座子。如某一質(zhì)粒上帶有一個Tn，經(jīng)變性并復性后，在電鏡下可見到一部分雜合DNA雙鏈上出現(xiàn)頸環(huán)結(jié)構(gòu)。,6.6.3轉(zhuǎn)座噬菌體 Taylor于1963年發(fā)現(xiàn)了一種特殊的噬菌體，稱為Mu(mutator phage)，即突變者的意思。它是大腸桿菌的一種溫和噬菌體，按理每一種溫和噬菌體應整合到宿主染色體的一定位置上，如像噬菌體

36、整合的位置就是一定的。可是Mu幾乎可插入宿主染色體任一位置上。而且游離Mu和已經(jīng)插入的Mu基因次序是相同的。另外它的兩端沒有粘性末端，插入某基因中就引起該基因突變。這些都說明它的整合方式不同于噬菌體，而類似于轉(zhuǎn)座因子的作用。 Mu是一種DNA噬菌體，它是含有38 000 bp的線狀DNA，兩端各帶一小段大腸桿菌的DNA，這與該噬菌體插入大腸桿菌染色體上有關。距末端不遠處也有類似于IS的序列，靠近一端處存在與轉(zhuǎn)座有關的整合與復制A、B基因。它們分別編碼70 000與33 000兩種蛋白，位于MuDNA一端。在A、B與末端之間有一C區(qū)，對A、B有負調(diào)節(jié)作用。Mu的轉(zhuǎn)座頻率比一般的轉(zhuǎn)座子要高。Mu的

37、復制能力和它的轉(zhuǎn)座能力是密切相關的，Mu的生存依靠轉(zhuǎn)座，復制轉(zhuǎn)座是其正常生活史中的一部分。在轉(zhuǎn)座過程中，它擺脫兩端原有的細菌DNA而轉(zhuǎn)座到新的某個位點上。,6.7 真核生物中的轉(zhuǎn)座子 6.7.1 酵母菌的轉(zhuǎn)座子 酵母菌是低等的真核生物，它的基因組雖然在許多方面不同于原核生物，可是它的轉(zhuǎn)座子卻在許多方面和細菌的轉(zhuǎn)座子相似。目前在酵母中研究得較清楚的轉(zhuǎn)座子是Ty系列(transposon yeast, Ty)。它們的一般長度約為5 900 bp，兩端含有兩個稱為的正向長末端重復序列（LTR），正向重復序列的長度約340 bp。因子大約由70%的AT組成，每一個因子都含有一個啟動子和一段被轉(zhuǎn)錄酶識別

38、的序列。,Ty插入酵母菌染色體后，受體上就會出現(xiàn)5 bp的正向重復序列，這和細菌中轉(zhuǎn)座子作用相似。另外由于Ty插入后，為正向重復序列，所以也有可能發(fā)生類似于細菌中復制重組過程形成的小環(huán)，丟失一個，而留在酵母中的稱為Solo，這時酵母細胞表型則回復正常，而人們可以通過對Solo的分析來判斷此處曾插入過Ty(圖6-31b)。據(jù)研究，每一個酵母細胞中有數(shù)百個因子。這些不能轉(zhuǎn)座，但由于其含有轉(zhuǎn)錄啟動信號，它們可能會影響其附近基因的表達。另外由于每一個細胞中有多個拷貝的Ty因子，所以基因組中不同位置的Ty因子也可能發(fā)生重組，從而導致染色體的易位、缺失和倒位等結(jié)構(gòu)變異。,Ty因子只編碼一條長5 700nt

39、的mRNA，轉(zhuǎn)錄的啟動子位于Ty因子左端的LTR之中。轉(zhuǎn)錄子含有兩個可讀框，所以這條mRNA可能編碼兩種蛋白質(zhì)。在某些酵母品系中，Ty因子可多達35個拷貝，但拷貝數(shù)因品系不同而有差別。 Ty因子轉(zhuǎn)座是通過一種RNA中間產(chǎn)物進行的，其過程類似反轉(zhuǎn)錄病毒的復制與整合，所以Ty因子也叫做反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。一般認為Ty因子轉(zhuǎn)座時，首先以其DNA為模板合成一個拷貝的RNA，然后再通過反轉(zhuǎn)錄，合成一條新的Ty因子，最后這條新的Ty轉(zhuǎn)座子再插入到新的染色體位點上(圖6-32)。,6.7.2 果蠅的轉(zhuǎn)座子 P因子的全長是2 907 bp，兩端有31 bp的反向重復序列。 P因子有4個編碼區(qū)(0、1、2、3)、3個

40、內(nèi)含子(1、2、3) 。 P因子插入后在靶DNA序列形成8 bp的正向重復序列。如缺失了中間序列而保留兩端的31 bp反向重復序列的P因子，只要有相應的外顯子提供轉(zhuǎn)座酶，那么這些缺失的P因子仍然可以轉(zhuǎn)座。P因子可以從原來的位置上消失，這一過程稱為切離(excision)。準確的切離可以使得由于P因子的插入而引起的突變型發(fā)生回復突變，同時P因子也全部從插入位置上消失。不準確的切離可以帶來染色體畸變，P因子或是全部消失或是有一部分殘留在染色體上。,果蠅中的轉(zhuǎn)座子除了P因子外還有Copia、412、279、Tip、FB等。它們的結(jié)構(gòu)雖有所不同，但兩端都有反向重復序列(圖6-35)。Copia在果蠅中

41、廣泛地存在，已發(fā)現(xiàn)大約有2030族，其成員的長度從5 000bp到9 000bp不等，各個成員的兩端都接有長200500bp的順向重復序列（LTP），這一特征與酵母的Ty轉(zhuǎn)座子相同。每一成員兩端順向重復序列并非高度同源，其中存在一部分堿基不能互補的區(qū)域。在果蠅基因組中，Copia約有30個拷貝，分布在幾條不同染色體上，各個成員之間存在高度結(jié)構(gòu)保守性。當Copia插入到某個基因座位上以后，也在其兩側(cè)形成5bp的染色體順向重復DNA。在成長的果蠅細胞中以及在胚胎細胞中還存在多個拷貝的、呈小環(huán)狀的、游離于染色體外的Copia轉(zhuǎn)座子。同酵母的Ty轉(zhuǎn)座子相似，Copia也是通過一種RNA中間產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)座

42、。,6.7.3 玉米的轉(zhuǎn)座子 在著名的Ac-Ds體系中，自主轉(zhuǎn)座的Ac因子為一種結(jié)構(gòu)和功能都比較完整的轉(zhuǎn)座子，除了含有自動轉(zhuǎn)座的信息，還具有一些與切割和轉(zhuǎn)座有關的基因或DNA序列，所以Ac因子的結(jié)構(gòu)比較復雜，分子量也比較大。根據(jù)對玉米非蠟質(zhì)基因（Wx）座位中Ac因子的序列分析，Ac因子長4 563bp，轉(zhuǎn)錄生成單一RNA。成熟mRNA長3 500nt，并含一個長807個密碼子的開放可讀框。在可讀框前有TATA盒，其后接有多聚A加尾信號序列，并被4個內(nèi)含子分隔成5個外顯子，可能編碼與轉(zhuǎn)座有關的轉(zhuǎn)座酶。Ac轉(zhuǎn)座子兩端具有長11bp的顛倒重復序列，在Ac因子插入位點上，兩段顛倒重復序列之外各接有一段

43、8bp的染色體DNA順式重復序列,Ds為一種結(jié)構(gòu)和功能都不完整的轉(zhuǎn)座子，只具有與切割有關的識別序列，缺乏與轉(zhuǎn)座有關的功能，所以不能自動轉(zhuǎn)座，容易在基因組中固定下來。根據(jù)各種Ds與Ac因子的序列同源程度差異，可以把Ds分成三種不同類型，第一類為Ac因子的缺失體，如圖6-41中的Ds-a。第二類Ds只在總長不足1kb的末端區(qū)同Ac因子存在同源性，而中部序列則與Ac因子無關，如圖6-41中的Ds-b。第三類Ds只是在末端顛倒重復序列以及3端約20bp的序列同Ac因子存在同源性，如圖6-40中的Ds-c。同Ac因子一樣，Ds也具有11bp的顛倒重復序列和8bp的染色體DNA順式重復序列。AcDs的轉(zhuǎn)座

44、屬非復制型機制，直接從原來位置切離后插入到新的靶位點。,在玉米或其他植物中另一類控制因子為抑制子突變子(suppressor-mutator)系統(tǒng)，簡稱SpmdSpm系統(tǒng)。這類控制因子也由兩個成員組成，即一個長8.3kb的Spm因子和一個較小的、叫做dSpm的成員。dSpm為Spm因子內(nèi)部發(fā)生缺失后形成的轉(zhuǎn)座子，但能夠獨立地轉(zhuǎn)座。所謂抑制子(suppressor)即Spm插入到某個基因座位中后，往往抑制該基因表達。而突變子(mutator)則是指Spm轉(zhuǎn)座所需的功能，它可能是指轉(zhuǎn)座酶。Spm因子具有上述兩種功能，而dSpm則不具有抑制基因表達的功能，只有植物基因組中存在Spm因子時，dSpm才

45、能抑制插入位點基因的表達，即Spm以反式互補的方式為dSpm提供抑制功能。,各種 Spm和dSpm因子的末端都具有13bp的顛倒重復序列，轉(zhuǎn)座以后，都能在插入位點上產(chǎn)生3bp的染色體順式重復。同其他植物轉(zhuǎn)座子一樣，spm 轉(zhuǎn)座以后不能使插入位點的基因完全恢復到原來狀態(tài)，而是在該位點造成一小段重復序列。Spm的主要轉(zhuǎn)錄子只有2.5kb長，編碼一種反作用抑制子 (trans-acting suppressor)蛋白，這種蛋白質(zhì)也可能行使與Spm轉(zhuǎn)錄有關的一種正調(diào)節(jié)子的功能。Spm也編碼一些小轉(zhuǎn)錄子，這些小轉(zhuǎn)錄子含有主轉(zhuǎn)錄子的第一個內(nèi)含子中的兩個可讀框，即ORFl和ORF2(圖6-37)。所有這些轉(zhuǎn)

46、錄子都可能是前體mRNA通過不同加工途徑形成的。當這兩個可讀框中發(fā)生缺失突變或移碼突變之后，Spm往往失去轉(zhuǎn)座功能，而只具有抑制功能，因此，可能二者的編碼產(chǎn)物都是轉(zhuǎn)座酶的組成部分。,6.7.4人類基因組中的轉(zhuǎn)座子 我們已知，重復序列占了人類基因組的50%以上（圖6-38a），其中轉(zhuǎn)座子占了重復序列的45%，所有的轉(zhuǎn)座子都是多拷貝的，人類基因組中的轉(zhuǎn)座子分為四種類型， 最常見的LINEs 組成了長的散布序列，如L1長為6.1b, 含兩個讀框，分別稱為ORF1和ORF2。L1是唯一在人類和小鼠中都具有活性的一類成員，并且在小鼠中活性很高，在人類中則相對比較低。SINEs組成了短的散布序列，如Alu

47、元件，長度在100300bp之間，是非自主轉(zhuǎn)座子，其3端與L1有同源性，因此能靠L1進行轉(zhuǎn)座(6-38b)。,人類基因組中存在大量的長約300bp的中度重復序列，廣泛地分布在非重復DNA序列之間。在這些300bp的序列中有一個限制性內(nèi)切酶AluI的特異性識別位點AGCT，由此將300bp的序列切割為兩個片段，一個片段為170bp，另一片段為130bp，說明這是一類長度和性質(zhì)相似的重復序列，因而稱之為Alu家族（Alu family）。Alu家族有多個成員，總拷貝數(shù)約上百萬個，大約平均每6KbDNA序列中就有一個，占人體基因組的36。隨機取人的DNA并獲得100個克隆，每個克隆中的DNA長度為1

48、.51042104bp，用Alu家族成員作為探針去檢測，結(jié)果是95的克隆都與該探針雜交呈陽性，由此可見Alu分布之廣。在小鼠中與Alu序列相關序列稱為家族，長為130bp，在中國倉鼠中則被稱為Alu相當序列家族（Alu-equivalent family）。該家族也存在于其他哺乳動物中。,Alu家族的各個成員之間序列相似，但并不完全一致，單個成員與共有序列的平均同源性為87，小鼠B家族與Alu家族有7080的同源性。Alu序列與7SLRNA有關，7SLRNA5端的90個堿基和Alu的左側(cè)序列是同源的，而3端的40個堿基和Alu的左側(cè)序列同源，因此推測Alu的祖先是編碼一種結(jié)構(gòu)RNA，即7SLR

49、NA的基因，7SLRNA存在于所有真核細胞中，它的功能是引導蛋白質(zhì)到達它們在細胞中的正確位置。編碼7SLRNA的基因由聚合酶轉(zhuǎn)錄。所以某些Alu家族成員可能攜帶內(nèi)源性活性啟動子，能被轉(zhuǎn)錄為單獨的，也可能存在于其他結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)部。這也許正是Alu家族在哺乳動物基因組中含量如此豐富，分布如此廣泛的原因。,6.8.1 DNA轉(zhuǎn)座機制 （1）復制型轉(zhuǎn)座 復制型轉(zhuǎn)座機制的模型至少要說明下列現(xiàn)象： 轉(zhuǎn)座以后原來位置上的轉(zhuǎn)座子保持不變； 在新的位置上的轉(zhuǎn)座子的兩側(cè)出現(xiàn)正向重復序列（direct repeats, DR）； 轉(zhuǎn)座過程出現(xiàn)共聯(lián)體。研究的比較清楚的還是細菌中的轉(zhuǎn)座子，這里以細菌的轉(zhuǎn)座子為例

50、說明轉(zhuǎn)座的一般過程。 1979年J. A. Shapio提出了一個Tn3轉(zhuǎn)座模型，大體分4步： 切開(cutting)：含有Tn3轉(zhuǎn)座子的供體質(zhì)粒，其Tn3中轉(zhuǎn)座酶有兩種功能，第一可以識別受體質(zhì)粒上的靶(target)序列，并在該序列兩側(cè)各一條單鏈上造成一個切口，切口之間的距離決定了轉(zhuǎn)座后兩側(cè)正向重復序列的長度。第二可以識別自身兩邊的反向重復序列，并在3端切開。,連接(rejoining)：供體和受體結(jié)合成為共聯(lián)體(cointegrate)，所謂共聯(lián)體，就是兩個或兩個以上的復制子(replicon)通過共價連接起來的一個復制子。其過程是使供體切下IS或Tn3反向重復序列末端和受體粘性末端以共價

51、鏈齊頭相連，形成兩個“缺口”。 復制：由DNA多聚酶進行修補復制補上缺口，由連接酶連接。于是在IS兩端形成了兩個正向重復序列DR，一般為59 bp，最長的12 bp。 重組：在特定位點進行重組，結(jié)果共聯(lián)體分離形成兩部分，一個是原來含有轉(zhuǎn)座子的序列，另一個是通過轉(zhuǎn)座插入了轉(zhuǎn)座子的序列(圖6-39)。由此可見，轉(zhuǎn)座子是以它的一個復制品轉(zhuǎn)移到另一位置的，而在原來位置上仍然保留著原有的轉(zhuǎn)座子。Shapiro所提出的轉(zhuǎn)座模型不僅可以說明上述3方面的現(xiàn)象，而且說明轉(zhuǎn)座過程是遺傳重組過程。這種重組發(fā)生在特定的位點，從這一層意義上說，轉(zhuǎn)座過程是一種位點專一性重組；但是這種重組伴隨著DNA的合成，所以是復制式的

52、位點專一性重組。,植物轉(zhuǎn)座子或T-DNA插入也具有熱點插入特征，例如Miyao等在分析了水稻逆轉(zhuǎn)座子Tos17的插入熱點位于富含基因的區(qū)域，而不是著絲點附近，并而且傾向于插入激酶和抗病一類基因。在分析的上萬個插入位點中發(fā)現(xiàn)Tos17本身插入了35次，RNA聚合酶大亞基插入了104次，蔗糖合成酶插入了23次，Xa21插入18次。這些插入熱點與核苷酸序列以及轉(zhuǎn)錄活性沒有明顯的相關性。 基因組中某些基因的突變可能使整個基因組突變的頻率明顯上升，這類基因被稱為增變基因（mutator gene）。目前已經(jīng)知道的這類基因主要有兩類：一是編碼DNA聚合酶的各個基因，這類基因如果突變就會導致35校正功能的降

53、低或喪失，使DNA復制中發(fā)生錯誤的幾率升高，使其他基因突變率上升。另一類是dam基因，如果dam基因突變，則DNA復制過程中的錯配修復功能的喪失，突變頻率將大大增加。,圖6-39 Tn3復制型轉(zhuǎn)座機制(引自Sunstad etal.， 2003),（2）非復制型轉(zhuǎn)座 交換復合體也可用于非復制型轉(zhuǎn)座，非復制型轉(zhuǎn)座的原理是斷裂和重接反應使靶重構(gòu)，只有靶位點發(fā)生重連（reunion）而供體鏈仍保持裂缺，不形成共聯(lián)體。非復制轉(zhuǎn)座酶也可在靶DNA上產(chǎn)生剪切。轉(zhuǎn)座子兩側(cè)產(chǎn)生雙鏈斷裂，完整的轉(zhuǎn)座子從供體中釋放出來。 Tn10的兩條鏈的剪切發(fā)生在與靶序列連接之前。在反應的第一步是轉(zhuǎn)座酶對轉(zhuǎn)座子末端的識別，在轉(zhuǎn)

54、座子的兩端的單鏈按一定順序被剪切，首先是與靶位點連接的轉(zhuǎn)移鏈被切，然后另一條鏈被切，在此位點釋放被切的供體DNA。同時受體也被交錯切割，轉(zhuǎn)座子與靶位點的切割端連接，保持在由轉(zhuǎn)座酶的產(chǎn)生的復合體中（圖6-40）。在轉(zhuǎn)座子兩端的雙鏈剪切排除任何復制型轉(zhuǎn)座，結(jié)果產(chǎn)生非復制型轉(zhuǎn)座。Tn10轉(zhuǎn)座酶是一個二聚體，每一個單體都有活性位點，不僅能催化轉(zhuǎn)座子兩條鏈的斷裂，并能交錯地切割靶位點。Ac-Ds的轉(zhuǎn)座也屬于非復制型轉(zhuǎn)座，其轉(zhuǎn)座機制與Tn10相似,圖6-40 Tn10非復制型的轉(zhuǎn)座（引自Lewin，2006）,圖6-41 玉米中Ac-Ds非復制型轉(zhuǎn)座機制(引自Griffiths，2005).,6.8.2

55、反轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機制 （1）反轉(zhuǎn)錄病毒繁殖周期 由RNA介導的轉(zhuǎn)座僅發(fā)生在真核生物中，它們是由反轉(zhuǎn)錄病毒以其RNA基因組的DNA拷貝插入到寄主細胞的染色體中而產(chǎn)生的。有些生物的轉(zhuǎn)座子和它們組織中的反轉(zhuǎn)錄病毒的原病毒（provirus）有關，而且它們的轉(zhuǎn)座也是通過RNA介導的。還有一些反轉(zhuǎn)錄成分，如Ty1/copia和Ty3/gypsy家族，它們雖然不是病毒，但轉(zhuǎn)座機制類似于反轉(zhuǎn)錄病毒。反轉(zhuǎn)錄子和反轉(zhuǎn)錄病毒都與其它類型的轉(zhuǎn)座子相似，具有轉(zhuǎn)座子的一些重要特征：如病毒DNA的兩端的LTRs，在插入位點的靶DNA上產(chǎn)生正向重復序列（圖6-42）。,圖6-42 反轉(zhuǎn)錄病毒基因組(引自Lewin， 2004

56、)。,反轉(zhuǎn)錄病毒整合在細胞的基因組中，作為一種內(nèi)生病毒（endogenous provirus），像似一個溶源性噬菌體，其行為表現(xiàn)為遺傳物質(zhì)的一部分。反轉(zhuǎn)錄病毒的繁殖周期中，關鍵的步驟是借助反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）將病毒的RNA反轉(zhuǎn)錄成DNA，并整合到宿主基因組中。然后該DNA又轉(zhuǎn)錄成病毒的RNAs，此RNAs有兩個用途：作為翻譯模板的mRNA;作為病毒的基因組，典型的反轉(zhuǎn)錄病毒含24個基因。其mRNA具有常規(guī)的結(jié)構(gòu)：在5端有帽結(jié)構(gòu)，在3端有多聚腺苷的尾。它存在兩種mRNA：長的mRNA翻譯Gag和pol多蛋白，從起始密碼子到第一個終止密碼的閱讀框翻譯成Gag產(chǎn)物。

57、pol表達一定要越過第一個終止密碼。不同的病毒翻譯時采用不同的機制來越過第一個終止密碼子，它取決于gag和pol兩個閱讀框之間的關系。當gag和pol需要連讀的時候，通過可識別此終止密碼子的Glu-tRNA來抑制終止，產(chǎn)生單個的蛋白。當gag和pol在不同閱讀框中，核糖體發(fā)生移框來產(chǎn)生各個不同的蛋白。通常連讀率約在5，因此Gag蛋白在數(shù)量上勝過Gag-pol蛋白約20倍。,Env多蛋白通過另一種機制進行表達，它是將mRNA重新拼接成一個短的亞基因組的(subgenomic)信使，翻譯成Env產(chǎn)物。Gag或Gag-pol和Env產(chǎn)生的是多蛋白質(zhì)(polyprotein)，它能被蛋白水解酶切成多種

58、單個的蛋白，存在于成熟的病毒中，這種蛋白酶的活性是由病毒編碼的。它可能是gag或pol的一部分，有時又可以一個獨立的附加讀框存在（,反轉(zhuǎn)錄顆粒的產(chǎn)物涉及到將RNA包裝進核心蛋白中，外周包以衣殼蛋白和從宿主細胞膜上取下的片段，最后病毒顆粒從細胞中釋放(圖6-44)。感染正是這一過程的逆向反應。病毒是通過和一個新的宿主細胞質(zhì)膜的融合來感染的，然后將病毒粒子的內(nèi)含物釋放到宿主細胞中 （2）反轉(zhuǎn)錄病毒基因組RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成LTR末端的程序: 反轉(zhuǎn)錄病毒RNA可作為模板由依賴RNA的DNA多聚酶合成互補的DNA，這一步反應由轉(zhuǎn)座因子中pol 基因編碼的反轉(zhuǎn)錄酶負責。因為DNA的合成需要引物，正常細胞的

59、DNA合成中引物是重新合成的，由RNA多聚酶完成。但在反轉(zhuǎn)錄因子RNA的cDNA合成中，并無合成RNA引物的RNA多聚酶，因此該DNA的合成引物來源不同。這類DNA合成中采用的引物是細胞中的tRNA分子，何類tRNA分子用于引物依反轉(zhuǎn)座因子的類型而異，如Tyl/copia家族總采用tRNAMet作為引物。,tRNA引物與反轉(zhuǎn)錄病毒RNA5端一段順序互補(圖6-45)。引物的結(jié)合位置初看有點反常，因為它的合成方向不是指向分子內(nèi)部而是朝向只有很短一段順序的5-LTR末端。當cDNA拷貝延伸到LTR的5端時，作為模板的這段RNA開始部分降解，從而向外延伸出1段cDNA單鏈。因為3-LTR和5-LTR為重復順序，合成的cDNA單鏈3端可與反轉(zhuǎn)錄病毒RNA分子的3-LTR復性。隨后cDNA合成繼續(xù)沿轉(zhuǎn)錄物延伸，直到取代tRNA引物。由此產(chǎn)生的cDNA拷貝是完整的，包括引物順序。事實上這里有一次模板轉(zhuǎn)換，即從5-LTR轉(zhuǎn)到3-LTR的過程，這一策略可解決線性DNA分子拷貝時末端縮短的問題。,圖6-45 反轉(zhuǎn)錄病毒基因組中LTR末端的形成(引自Lewin, 2006) (a) 負鏈合成需要轉(zhuǎn)移作用 (b)正鏈DNA合成需要跳躍,（3）反轉(zhuǎn)錄DNA分子的整合機制 當完整的DNA分子合成后，下一步就是將新的反轉(zhuǎn)座成分整合到基因組中。整合酶在DNA