實驗四 小鼠精子畸形試驗

1、院 系：生化環(huán)院 任課老師：吳雨龍 任課班級：09食品、行09食品,食品專業(yè),食品毒理學(xué)實驗,精子畸形試驗是檢測受試化學(xué)毒物能否破壞哺乳動物精子正常形態(tài)的實驗方法。通過實驗，學(xué)習(xí)和掌握小鼠精子畸形試驗的原理和步驟。,實驗四 小鼠精子畸形試驗,實驗?zāi)康?1.,1.,精子畸形是指精子的形狀異常和異常精子數(shù)量的增多。生殖系統(tǒng)對化學(xué)毒物的作用十分敏感，在其他系統(tǒng)還未出現(xiàn)毒性反應(yīng)前，生殖系統(tǒng)可能已出現(xiàn)了損害作用。正常情況下，哺乳動物的精液中也存在少量的畸形精子，但在某些化學(xué)毒物的作用下，特別是在可引起生殖細胞遺傳性損傷的化學(xué)毒物作用下，哺乳動物睪丸產(chǎn)生的畸形精子數(shù)量可大量增加。因此，可以用,檢查雄性動物

2、接觸化學(xué)毒物后精子畸形率的高低，來反映該化學(xué)毒物的生殖毒性和對生殖細胞潛在的致突變性。 化學(xué)毒物引起精子畸形的機制尚未完全清楚。正常情況下，精子的成熟和正常形態(tài)發(fā)生過程受多種基因調(diào)控，一旦這些基因中的一個或多個在化學(xué)毒物的作用下發(fā)生突變，就會導(dǎo)致畸形精子數(shù)量的大量增加。一般認為，常染色體上的基因控制,精子畸形，Y-性連鎖基因控制畸形精子的表現(xiàn)。某些特異的染色體重排，如性、常染色體易位，是化學(xué)毒物誘發(fā)哺乳動物畸形率增高的主要機制。 由于精子畸形有可能影響生殖。因此，當受檢物引起精子畸形率增高，即使不一定是化合物誘發(fā)生殖細胞突變的結(jié)果，但也表明受試物直接或間接損害精子，從而可能影響生殖。,實驗動物

3、：,實驗材料,3.,體重18-22g小鼠。,實驗器材：,灌胃針、注射器5套、眼科剪、眼科鑷、顯微鏡、飼養(yǎng)籠等。,實驗試劑：,磷酸鹽緩沖液、生理鹽水、無水乙醇、2%伊紅水溶液、甲基磺酸甲酯或甲基磺酸乙酸或環(huán)磷酰胺。,1.動物選擇成熟的大鼠、小鼠均可使用。由于小鼠較為經(jīng)濟，且有大量實驗證實小鼠在該試驗系統(tǒng)中對化學(xué)毒物最為敏感，故一般采用雄性小鼠，年齡宜在68周。,2.劑量與分組試驗至少應(yīng)設(shè)3個以上劑量組，并同時設(shè)立陽性對照組和陰性對照組。接觸化學(xué)毒物后每組至少應(yīng)存活5只動物。最高劑量組5d總劑量應(yīng)能使部分動物死亡。 一般可采用LD50的24倍劑量，或預(yù)先給予化學(xué)毒物的LD50，以求得最高總劑量，然

4、后以它的1/2（或1/5、1/10）作為下一劑量組的接觸劑量，依此類推。,陽性對照可用環(huán)磷酰胺20mg/kg或甲基磺酸甲酯75mg/kg或甲基磺酸乙酯60mg/kg，進行腹腔注射，每天一次，連續(xù)5d。陰性對照選用給予相同體積的溶劑。,3.染毒與采樣可采用一次或每天一次連續(xù)5d的方法進行染毒。染毒途徑多用腹腔注射，也可采用與人體實際接觸化學(xué)毒物相同的途徑，如經(jīng)口、吸入和皮膚接觸等。 一般認為精原細胞后期或初級精母細胞早期對化學(xué)誘變劑較為敏感，在接觸化學(xué)毒物后45周精子畸形率最高，故選擇在第一次染毒后第35d進行采樣。也可在染毒后第1、第4和第10周,分三次采樣，或者在染毒后每周采樣一次，連續(xù)進行

5、動態(tài)觀察，直至精子形態(tài)恢復(fù)正常。,4.制片用頸椎脫臼法處死小鼠，剪開腹腔，分離并摘取雙側(cè)附睪，將附睪放入盛有約3ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的小平皿中，以眼科剪將附睪尾剪成小塊，用吸管將懸浮液輕輕吹打56次，靜置35min，用四層擦鏡紙濾除組織碎片，吸取此精子懸液滴于清潔載玻片上，均勻推片，待玻片晾干后用甲醇固定5min，干燥后即可鏡檢觀察精子形態(tài)。也可用2%的伊紅水溶液染色12h后再作鏡檢。,5.閱片在高倍鏡下檢查精子形態(tài)，可加上藍色或綠色濾光片。每只小鼠檢查完整的精子200500個，每個劑量組至少檢查1000個精子。精子畸形主要表現(xiàn)在精子的頭部，可分為：無鉤、香蕉形、無定形、雙頭、雙尾、尾折

6、疊及胖頭等形態(tài)。 頭部重疊或全部重疊的精子、無尾精子不進行計數(shù)。,分別計算各劑量組的精子畸形發(fā)生率。各劑量組的精子畸形率與陰性對照組之間的差異分析采用秩和檢驗。 由于不同品系小鼠的精子畸形率本底值差異較大，且影響的因素也較多，故在結(jié)果分析時，應(yīng)首先觀察陽性和陰性對照組的試驗結(jié)果。陽性對照組精子畸形率的增高應(yīng)在本實驗室的歷史記錄范圍之內(nèi)，并與陰性對照組有顯著性差異（P0.01），陰性對照組的畸形精子率也應(yīng)與自己實驗室的歷史記錄接近，否則所得結(jié)果不可靠，試驗應(yīng)重做。,出現(xiàn)可重復(fù)的劑量反應(yīng)關(guān)系時，可判斷試驗結(jié)果為陽性。但要判定某一化學(xué)毒物為精子畸形誘變劑，至少應(yīng)該有兩個相鄰劑量組的精子畸形率比陰性對照組顯著增高（P0.01）；或達到陰性對照組的2倍或2倍以上，并且試驗結(jié)果能夠重復(fù)。如果試驗組的染毒劑量已使動物發(fā)生死亡，而精子畸形仍未見增加，則可判定試驗結(jié)果為陰性。在受試化學(xué)毒物的毒性作用較低而不至于引起動物死亡時，應(yīng)當記錄最大的染毒劑量。,精子畸形試驗還可進行畸變類型分析，不同部位的畸形對精子的活動能力和使卵子受孕的能力有不同的影響?？梢越Y(jié)合精子計數(shù)、精子運動能力試驗等對化學(xué)毒物對雄性生殖系統(tǒng)的毒性作用做進一步的檢測。,1在該試驗過程中，雖然將精子懸液采用離心等方法除去組織殘渣后再制片效果會更佳，但這使制片過程變得復(fù)雜化且更易造成人為誤差。 2在鏡檢時要注意鑒別制片過程中人為造成的精子