分子生物學(xué)技術(shù)和食源性致病菌的快速檢測(cè).ppt

1、分子生物學(xué)技術(shù)和食源性 致病菌的快速檢測(cè),與細(xì)菌有關(guān)的一些分子生物學(xué)和 細(xì)胞生物學(xué)技術(shù); PCR技術(shù); 熒光PCR技術(shù); 相關(guān)的一些分子生物學(xué)技術(shù)在食源性致病菌 的快速檢測(cè)技術(shù)中的應(yīng)用; 5. 一實(shí)例分析個(gè)案,與細(xì)菌有關(guān)的一些分子生物學(xué)和 細(xì)胞生物學(xué)技術(shù),核酸的抽提與純化(DNA, RNA, 質(zhì)粒DNA等) 相關(guān)核酸的鑒定(PCR, 限制性內(nèi)切酶和酶切技術(shù)及 產(chǎn)物分析, 重組技術(shù), 探針, Southern blotting, Northern blotting, 芯片技術(shù), 序列分析等) 蛋白質(zhì)的提取與純化 相關(guān)蛋白質(zhì)的鑒定(Western blotting, 抗原抗體復(fù)合物, 標(biāo)記技術(shù),芯

2、片技術(shù), 序列分析等) 培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù)(用于細(xì)菌毒素測(cè)定的MTT方法),核酸的抽提與純化,DNA-微量法(平衡酚, 氯仿,乙醇);大量法(堿 列解); 離心法 RNA 質(zhì)粒DNA -堿變性法, Kit-Qiagen公司 PCR產(chǎn)物- Kit 細(xì)菌-直接裂解:釋放出DNA,PCR-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （Polymerase Chain Reaction, PCR）,在體外通過(guò)酶促反應(yīng)進(jìn)行一段特定DNA或RNA片段擴(kuò)增的 技術(shù)為獲取目的DNA片段的一項(xiàng)常規(guī)技術(shù)(診斷和檢測(cè)) 原理:,PCR一般過(guò)程： 1.變性（denaturation）： 加熱使DNA雙螺旋的氫 鍵斷裂,雙鏈解離形成單 鏈DNA。 2.

3、退火（annealling）： 溫度降低時(shí)使引物和其 互補(bǔ)的模板在局部形成 雜交鏈。 3.延伸（extension）： 在DNA聚合酶和4種脫 氧核糖核苷酸及Mg2存在 的條件下，催化DNA鏈延 伸反應(yīng)。,模板DNA 或RNA 一對(duì)寡核苷酸引物 4種脫氧核糖核苷酸(dNTPs) 熱穩(wěn)定的聚合酶(Taq)； Mg+緩沖液。,PCR-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系,凝膠電泳：經(jīng)溴化乙錠染色，在紫外照射下可見(jiàn)橙紅色的特異DNA擴(kuò)增帶并可以在圖象成像儀下成像。,PCR-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物的檢測(cè),M 1 2 3 4 5 6 7 8 N P,PCR-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的發(fā)展,不對(duì)稱PCR 反向PCR 多重PCR 差別

4、PCR 熒光PCR 錨式PCR 重組PCR PCR固相分析 免疫PCR 反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR) 原位PCR,熒光PCR技術(shù)(Real Time PCR),熒光是響應(yīng)于一個(gè)短波光的激發(fā)， 一個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)光被發(fā)射出來(lái) 每個(gè)熒光分子都有一個(gè)最有效的激發(fā)波長(zhǎng) -被激發(fā)的熒光分子越多，發(fā)射的熒光越強(qiáng),熒光PCR技術(shù)(Real Time PCR),PCR + 熒光標(biāo)記 + 監(jiān)測(cè)系統(tǒng),Non-specific DNA binding dyes SYBR Green I Ethidium Bromide Specific Hybridization Probes TaqManTM molecular bea

5、cons dual-oligo FRET pairs,熒光PCR技術(shù)(Real Time PCR),R,5 3,3,5,R,R,R,R,SYBR Green I 是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈DNA染料, 與雙鏈DNA結(jié)合后, 其熒光大大增強(qiáng).,R,R,R,497nm,520nm,熒光PCR技術(shù)(Real Time PCR),TaqMan: 雜交探針的互補(bǔ)區(qū)在引物間 5端連有一個(gè)熒光reporter, 通常是熒光素 3端連有一個(gè)Quencher,通常是TAMRA 熒光素被488 nm光激發(fā)，發(fā)射光為520 nm 520 nm 光能激發(fā)TAMRA，發(fā)射光為570 nm,R,Q,5 3,3,5,R=Re

6、porter Q=Quencher,probe,熒光PCR技術(shù)(Real Time PCR),分子 Beacons: 探針有核心的雜交區(qū) 探針有自互補(bǔ)末端 在未雜交時(shí)探針呈發(fā)夾狀 報(bào)道子, 熒光素在探針的 5 端 猝滅子在探針的3 端,FRET Probes,l,Detection,Extension Step,1. Strand Displacement System Silent,2. Polymerization Complete System Silent,1-5 bases,熒光PCR技術(shù)(Real Time PCR),閾值線,CT值,閾值線: 熒光閾值的缺省的設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的

7、熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)差的10倍. CT值: 各反應(yīng)管內(nèi)的信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù).,熒光PCR技術(shù)(Real Time PCR),閾值線 CT值,多重?zé)晒釶CR技術(shù),FAM VIC HEX TET Cy3 Texas Red ROX Cy5 LC640 Cy5.5 LC705,490nm,660nm,R,限制性內(nèi)切酶和酶切技術(shù)及重組,限制性內(nèi)切酶是一類能識(shí)別雙鏈DNA分子中特異 核苷酸序列的DNA水解酶. 例如: EcoRI 可以識(shí)別 5.G AATTC.3 3.CTTAA G.5 粘性末端 T4連接酶: 重組 酶切與多態(tài)性分析技術(shù),GFP-MIP重組結(jié)構(gòu),MIP,mip基因是軍團(tuán)菌的巨嗜細(xì)

8、胞感染增強(qiáng)子基因，具高度保守性和嗜肺軍團(tuán)菌種的特異性。表達(dá)的產(chǎn)物mip蛋白是迄今所公認(rèn)的嗜肺軍團(tuán)菌毒力因子之一，是嗜肺軍團(tuán)菌所特有，因此用來(lái)鑒定軍團(tuán)菌具有很強(qiáng)的特異性。,GFP-MIP重組結(jié)構(gòu),Southern blotting和Northern blotting技術(shù),R6 GFP-ras,-Gp +Gp -Gp +Gp -Gp +Gp -Gp +Gp,4 10 4 10 days,raf (2.5 kb) Actin,28S 18S,主要步驟: DNA(RNA)提取 和純化; 凝膠電泳; 印跡轉(zhuǎn)移; 探針和雜交 顯色,芯片技術(shù),主要步驟: 芯片的制備 DNA(RNA)提取 和純化; 探針的制

9、備 雜交 顯色 結(jié)果判讀,芯片技術(shù),-Gp +Gp,芯片技術(shù),T I II III IV C C,登革熱病毒檢測(cè)芯片: 通用探針的設(shè)計(jì), 合成和篩選, 修飾 分型探針的設(shè)計(jì), 合成和篩選, 修飾 預(yù)試驗(yàn), 樣品的處理; 雜交及洗滌, 條件優(yōu)化等 數(shù)據(jù)庫(kù)的建立 應(yīng)用評(píng)價(jià) 與多重PCR技術(shù)的比較,DNA序列分析,雙脫氧測(cè)序(Sanger法) 化學(xué)測(cè)序(Maxam-Gilbert法) 同位素標(biāo)記測(cè)序 市售商品或公司運(yùn)作,DNA序列分析,Start-ATTAGACGTCCG A” T G C A ATTAG ATTA ATTAGACG ATTAGA ATTAGACGTCCG AT ATTAGAC AT

10、T ATTAGACGTC ATTAGACGT ATTAGACGTCG A T G C - ATTAGACGTCCG - ATTAGACGTC - ATTAGACGT - ATTAGACG - ATTAGAC - ATTAGA - ATTAG - ATTA - ATT - AT - A,測(cè)序凝膠,DNA序列分析(I),DNA序列分析(II),DNA序列分析(III),Western blotting技術(shù),0 2 4 8 0 2 4 8 days,R6 GFP-ras,76 kD 44 kD 44 kD 42 kD,Anti-Raf-1,Anti-Erk,Anti-p-Erk,Anti-Actin

11、,Gp treatment,主要步驟: 蛋白質(zhì)的提取 和純化; SDS-聚丙酰胺 凝膠電泳; 印跡轉(zhuǎn)移; 抗體和雜交 顯色,膠體金檢驗(yàn)法,氯化金在還原劑作用下, 可聚合成一定大小的金顆粒, 形成帶負(fù)電的疏水膠體溶液(膠體金). 膠體金標(biāo)記就是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包埋過(guò)程. 由于金具有高電子密度的特性, 我們可以在顯微鏡下或是在有相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí), 肉眼可見(jiàn)紫色的標(biāo)記.,C T,C T,C T,C T,霍亂弧菌O1群(O139)快速檢測(cè)卡: T-霍亂弧菌O1群(O139)單克隆抗體 C-羊抗鼠抗體,細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),細(xì)胞培養(yǎng)的一般過(guò)程(細(xì)胞, 培養(yǎng)基, 實(shí)驗(yàn)室要求的條件等)

12、細(xì)胞的復(fù)蘇 細(xì)胞的傳代 細(xì)胞的收獲 細(xì)胞的凍存 細(xì)胞培養(yǎng)污染的防治 培養(yǎng)細(xì)胞的觀察等,MTT Assay,原理: 黃色的Tetrazolium Salt (MTT)在活細(xì)胞線粒體SDH酶的作用下, 生成藍(lán)色產(chǎn)物. 根據(jù)顏色的濃度來(lái)判定活細(xì)胞的數(shù)目, 從而推斷受試物的毒性大小.,MTT Assay,g,有關(guān)的一些分子生物學(xué)技術(shù)在食源性致病菌的快速檢測(cè)技術(shù)中的應(yīng)用,PCR技術(shù); 引物的設(shè)計(jì)(kit, 文獻(xiàn), 自行設(shè)計(jì), 原則, gene bank); PubMed: /entrez/query.fcgi 多重PCR; 熒光PCR; 分子分型及相關(guān)技術(shù)(結(jié)

13、合細(xì)菌特征基因PCR和限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析PCR-RFLP, 核糖體基因分型Ribotyping, 脈沖場(chǎng)電泳Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE), 同源性分析, 溯源和預(yù)警等,霍亂CtxA基因的PCR,霍亂CtxA基因的PCR,霍亂CtxA基因的PCR,1 gaattcccgg gttgtgggaa tgctccaaga tcatcgatga gtaatacttg cgatgaaaaa 61 acccaaagtc taggtgtaaa attccttgac gaataccaat ctaaagttaa aagacaatat 121 ttttcagg

14、ct atcaatctga tattgataca cataatagaa ttaaggatga attatgatta 181 aattaaaatt tggtgttttt tttacagttt tactatcttc agcatatgca catggaacac 241 ctcaaaatat tactgatttg tgtgcagaat accacaacac acaaatatat acgctaaatg 301 ataagatatt ttcgtataca gaatctctag ctggaaaaag agagatggct atcattactt 361 ttaagaatgg tgcaattttt caagta

15、gaag taccaggtag tcaacatata gattcacaaa 421 aaaaagcgat tgaaaggatg aaggataccc tgaggattgcatatcttact gaagctaaag 481 tcgaaaagtt atgtgtatgg aataataaaa cgcctcatgc gattgccgca attagtatgg 541 caaattaaga tataaaaaaa gcccacctca gtgggctttt ttgtggttcg atgatgagaa 601 gcaaccgttt tgcccaaaca tgtattactg caagtatgat gtttt

16、tattc cacatcctta 661 gtgcgtatta tgtatgttat gttaaattaa ggcataaaaa gaggtcgcaa accccaatct 721 gctccctatt cttaatccag cattaaacat aactgtattt accataaaat acctaataat 781 catatttatc atttgacaat gttaagtatg attattatgg acattggcac tgtacttacg 841 tcaattgtgt gcaccaaagt g,霍亂CtxA基因,PCR擴(kuò)增毒力基因所用引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物分子量,PCR擴(kuò)增霍亂毒力基因及

17、擴(kuò)增產(chǎn)物分子量,M 1 2 3 4,Zot ctxA tcpA ace,多重PCR,最早用于缺少基因片斷的檢測(cè); 用于多基因的同時(shí)檢測(cè)或進(jìn)行細(xì)菌的屬, 種,型以及特異 性基因段的同時(shí)檢測(cè); 對(duì)豬鏈球菌2型: 檢索Genbank中豬鏈球菌的屬、種及毒力基因的基因序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)hemolysin gene（溶血素基因）、epf基因、NAD（P）H-dependent glutamate dehydrogenase gene（NAD（P）H依賴性谷氨酸鹽脫氫酶基因）、rmlACBD基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì), 以后再按照國(guó)家CDC的有關(guān)指引補(bǔ)充了針對(duì)豬鏈球菌種特異性16S rRNA

18、片段和特異性莢膜多糖基因片段cps2J的特異引物.,多重PCR擴(kuò)增霍亂毒力基因,M 1 2 3 4 5,Zot ctxA tcpA ace,1000 200,M 1 2 3 4,多重?zé)晒釶CR技術(shù)及應(yīng)用,FAM VIC HEX TET Cy3 Texas Red ROX Cy5 LC640 Cy5.5 LC705,490nm,660nm,R,R,Q,5,3,probe,R,Q,5,3,R,Q,5,3,R,Q,5,3,多重?zé)晒釶CR技術(shù)及應(yīng)用,沙門氏, 志賀氏; 霍亂弧菌; 副溶血性弧菌, 病原性大腸埃希菌(出血性大腸桿菌O157：H7，致病性大腸桿菌、產(chǎn)毒性大腸桿菌、侵襲性大腸桿菌)，變形桿菌

19、、溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯菌、蠟樣芽孢桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌; 空腸彎曲菌; 厭氧菌(空彎, 產(chǎn)氣莢膜梭菌, 肉毒梭菌);,分子分型及相關(guān)技術(shù),意義: 1.歐洲和美國(guó) 等已成立了細(xì)菌分子分型國(guó)家電子網(wǎng)絡(luò)（PulseNet),包括沙門菌、志賀菌、彎曲菌、出血性大 腸桿菌O157：H7、李斯特菌、耶爾森菌和弧菌 ）; 2.國(guó)內(nèi)尚無(wú)細(xì)菌分子分型的數(shù)據(jù)庫(kù)和網(wǎng)絡(luò)運(yùn)作系統(tǒng) ; 3.沒(méi)有在溯源、食源性疾病(食物中毒)疫情判斷和確認(rèn) 及預(yù)警的實(shí)際工作中應(yīng)用,分子分型及相關(guān)技術(shù),近十年來(lái)發(fā)展并應(yīng)用了多種以直接分析基因多態(tài)性為依據(jù)的高分辨率的分子分型系統(tǒng)，包括： 用低頻率（30%）的內(nèi)切酶

20、裂解DNA，通過(guò)脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）將切成的大片段分開，根據(jù)條帶的大小及數(shù)量差異來(lái)分型的PFGE； 限制性酶切與Southern印跡雜交技術(shù)結(jié)合，采用rRNA或rDNA序列探針的核糖體基因分型（Ribotyping）； 以PCR為基礎(chǔ)的的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCR-RFLP），擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（AFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析（RAPD）以及多位點(diǎn)序列分型（MLST） DNA測(cè)序。,常用基因分型方法的特點(diǎn),RAPD分析霍亂弧菌的同源性,M 1 2 3 4 5 6 7,利用單一的任意序列的引物，隨機(jī)地?cái)U(kuò)增與靶序列完全或部分配對(duì)，以擴(kuò)增出特異的DNA產(chǎn)物，然后進(jìn)行瓊脂糖或聚丙

21、烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)電泳條帶的不同，即所謂的多態(tài)性就可進(jìn)行基因定位、連鎖圖建立、品系(種)鑒別等方面。由于該技術(shù)具有快速靈敏，程序簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn), 因此在短時(shí)間內(nèi)，已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究領(lǐng)域.,聚類分析,凝膠成像系統(tǒng)得到RAPD圖像后，直接在其軟件中根據(jù)Marker及隨機(jī)擴(kuò)增片段在凝膠中的位置計(jì)算不同擴(kuò)增片段的分子量大小，然后采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件或其它聚類分析軟件，根據(jù)片段的分子量數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。,同源性分析,M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18,M 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34,2500 2000 1000 750 500 2000 1000 750 500,例一,例二,利用SPSS軟件對(duì)前2圖進(jìn)行聚類分析，根據(jù)遺傳距離的差異，將34株霍亂弧菌分成了2個(gè) 聚類群，每個(gè)聚類群內(nèi)部菌株的遺傳距離基本相同，反映了這2組菌株的親緣關(guān)系較近。,同源性分析,腸桿菌科細(xì)菌rRNA 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹,16S,23S,核糖體基因分型R