第三章基因克隆與表達(dá)的載體

1、,第三章 基因克隆與表達(dá)的載體,vectors,基因克隆過程,？vectors 本質(zhì)？,在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞復(fù)制、整合或表達(dá)的工具稱為載體。,1. 載體 (Vectors),載體的本質(zhì)是DNA。經(jīng)過人工構(gòu)建的載體，不但能與外源基因相連，導(dǎo)入受體細(xì)胞，而且還能利用本身的調(diào)控系統(tǒng)使外源基因在新的細(xì)胞中復(fù)制。,1. 運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞 2. 為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力 3. 為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件 Within the host cell the vector multiplies, producing numerous identical

2、copies not only of itself but also of the gene that it carries.,載體的功能：,（2）在宿主細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)立復(fù)制。 replicate independently in host cell,（3）有一段多克隆位點(diǎn)。 Multiple cloning sites 外源DNA插入其中不影響載體的復(fù)制。,2. 基因工程對(duì)載體的要求,（4）有選擇性標(biāo)記。 selectable marker （5）分子量小，拷貝數(shù)多。 Low molecules and multiple copies （6）容易從宿主細(xì)胞中分離純化。 Easy isolatio

3、n and purification from host cells.,（1）具有對(duì)受體的可轉(zhuǎn)移性。transferable,復(fù)制位點(diǎn) 選擇性標(biāo)記 克隆位點(diǎn),克隆載體,表達(dá)載體,表達(dá)調(diào)控元件,必須的,3.基因工程對(duì)載體的要求組成部分,基因工程中常用的載體有4類：,3. 載體的種類,質(zhì)粒（plasmid） 單鏈DNA噬菌體M13 噬菌體的衍生物 柯斯質(zhì)粒（cosmid） 動(dòng)物病毒（virus）,第一節(jié) 克隆載體,一、質(zhì)粒（plasmid）,存在于多種宿主細(xì)胞中、獨(dú)立于染色體以外的可自主復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子。,存在于細(xì)菌、霉菌、藍(lán)藻、酵母等細(xì)胞中。,大腸桿菌的質(zhì)粒,質(zhì)粒的命名規(guī)則, 天然存

4、在的質(zhì)粒：其符號(hào)的第一個(gè)字母要大寫，并不用斜體字，書寫時(shí)要用括號(hào)括起來，如（ColE1）。 重組質(zhì)粒：通常是用小寫p后加兩個(gè)大寫字母表示.,（一）質(zhì)粒（ Plasmid ）的命名,構(gòu)建質(zhì)粒的研究人員或完成此項(xiàng)工作的研究機(jī)構(gòu),例如：pSC101,pSC101,plasmid 質(zhì)粒,質(zhì)粒試驗(yàn) 研究類號(hào),Stanley Cohen,（一）質(zhì)粒（ Plasmid ）的命名,（1）分子?。?（二） 質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性,1-200 kb,質(zhì)粒DNA僅占細(xì)胞染色體組一小部分，一般約1-3左右。 不同質(zhì)粒DNA的分子量差異相當(dāng)顯著，質(zhì)粒DNA分子小的不足2 kb，大的可達(dá)100 kb以上，多數(shù)在10 kb左

5、右。最小的僅能編碼23種中等大小的蛋白質(zhì)，兩者之間相差競(jìng)達(dá)上百倍。,（二） 質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性,（2）編碼基因少：,2-3個(gè)中等大小的蛋白質(zhì)。,（3）環(huán)狀：,雙鏈環(huán)狀DNA。,如抗生素抗性等，賦予細(xì)菌一些額外的特性。,（非必須）,（4）質(zhì)粒的空間構(gòu)型：, 共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA),呈超螺旋（SC）（super coil）,Covalent close circular DNA, 線形DNA （ linear ，lDNA）,一條鏈上有一至數(shù)個(gè)缺口。, 開環(huán)DNA（ open circular， ocDNA）,（5）質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率,同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不

6、同：,scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。,SC,OC,l DNA,（三）質(zhì)粒的基本性質(zhì),（1） 嚴(yán)緊型質(zhì)粒（stringent plasmid）,拷貝數(shù)少，只有1-3個(gè)拷貝。,（2） 松弛型質(zhì)粒（relaxed plasmid）,拷貝數(shù)多，一般10個(gè)以上。,（非接合型質(zhì)粒分子量小，一般屬松弛型）。,1. 復(fù)制,p39,質(zhì)粒的拷貝數(shù) ：指在正常生長條件下，每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞或每條染色體所對(duì)應(yīng)的平均質(zhì)粒數(shù)。,（接合型質(zhì)粒分子量大，一般屬嚴(yán)緊型）,2. 不相容性（incompatibility）,在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。在細(xì)胞

7、的增殖過程中，其中必有一種會(huì)被逐漸地排斥(稀釋)掉。這樣的兩種質(zhì)粒稱為不相容質(zhì)粒。 前提條件：只有在確實(shí)證明第二種質(zhì)粒B已經(jīng)進(jìn)入含有第一種質(zhì)粒A的寄主細(xì)胞，而它的DNA并不受寄主細(xì)胞限制體系的降解作用，但這兩種質(zhì)粒卻不能長期穩(wěn)定共存，在這種情況下，我們才能夠說A和B是不親和的質(zhì)粒。,在大腸桿菌中的質(zhì)粒，可以分為：,3. 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性,（1） 接合型質(zhì)粒,（2） 非接合型質(zhì)粒,能自我轉(zhuǎn)移,不能自我轉(zhuǎn)移,如：F質(zhì)粒（性質(zhì)粒、或F因子）：,甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的受體菌中。,通過接合作用轉(zhuǎn)移到新宿主內(nèi)，又叫自我轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒。,（1） 接合型質(zhì)粒（conjugative

8、 plasmid）,分子量大，拷貝數(shù)少，宿主廣，不符合基因工程的安全要求,除了帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息外 還帶有一套控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因,大腸桿菌接合（conjunction）,Plasmid transfer by conjugation between bacterial cells.,（ 2）非接合型質(zhì)粒（non-conjugative plasmid ）, R質(zhì)粒（抗性質(zhì)粒）,帶有一種或數(shù)種抗生素抗性基因，使寄主獲得同樣的抗生素抗性性狀（resistance）。,分子量小，拷貝數(shù)多，符合基因工程的安全要求,雖然帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息，但失去了控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合

9、轉(zhuǎn)移的基因，因此不能從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。,帶有控制大腸桿菌素（colicin）合成的基因, Col質(zhì)粒,大腸桿菌素對(duì)不帶Col質(zhì)粒的大腸桿菌有毒。,但如果在其寄主細(xì)胞中存在著一種接合型的質(zhì)粒，非接合型質(zhì)粒也可以被轉(zhuǎn)移。這種由共存的接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過程，叫做質(zhì)粒的遷移作用。,（1）如：分子量大，拷貝數(shù)低,（四）質(zhì)粒載體的構(gòu)建,1、天然質(zhì)粒的局限性,第一個(gè)用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101，分子長 9.1 kb。,有一個(gè)EcoR I酶切位點(diǎn)充當(dāng)克隆位點(diǎn)，Tetr 作為篩選標(biāo)志。,ColE1質(zhì)粒的篩選標(biāo)志是大腸桿菌素E1（colicin E1）,（2）篩選標(biāo)志不理想,可以通

10、過插入失活篩選。但細(xì)菌群體容易自發(fā)突變出抗colicin E1的細(xì)胞.,colicin E1能殺死不含ColE1 質(zhì)粒的菌。,2、質(zhì)粒載體的構(gòu)建：,（1） 具有復(fù)制起始位點(diǎn)（ORI）,（2）具有合適的選擇標(biāo)記基因,（3）若干限制性內(nèi)切酶的單一位點(diǎn)（MCS）,是篩選的標(biāo)志。理想的載體應(yīng)該有兩種選擇標(biāo)記基因,用來插入外源DNA片斷，且插入后不影響復(fù)制功能,一般選擇組裝松弛型質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)。,（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù),縮短長度“輕裝上陣”，大于15 kb的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率明顯下降,氨芐青霉素抗性（Ampr） 卡那霉素抗性 （Kanr） 四環(huán)素抗性 （Tetr） 鏈霉素抗性 （Strr） 氯

11、霉素抗性 （Cmlr）,3、質(zhì)粒的選擇標(biāo)記及其工作原理,（1）選擇標(biāo)記,絕大多數(shù)質(zhì)粒載體都是用抗生素抗性標(biāo)記：, 抗生素抗性,常用抗生素的抗性原理,i）氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）,青霉素的衍生物。,通過干擾細(xì)菌細(xì)胞壁合成的末端反應(yīng)，殺死生長的細(xì)菌。,a）抑菌原理,b）細(xì)菌抗性原理,Ampr基因編碼-內(nèi)酰胺酶，特異地切割氨芐青霉素的-內(nèi)酰胺環(huán)。,ii）氯霉素（Chloramphenicol，Cml）,通過與50S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長的細(xì)菌。,b）細(xì)菌抗性原理,Cmlr 編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶，特異地使氯霉素乙?；Щ睢?a）抑菌原理,iv）鏈霉

12、素（Streptomycin，Str）,通過與30S核糖體亞基結(jié)合，導(dǎo)致mRNA錯(cuò)譯。,v）四環(huán)素（Tetracycline，Tet）,通過于30S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長的細(xì)菌。,iii）卡那霉素（kanamycin，Kan）,通過與70S核糖體結(jié)合，導(dǎo)致mRNA發(fā)生錯(cuò)讀。, 遺傳標(biāo)記,使受體菌發(fā)生遺傳性狀的改變的基因。,當(dāng)帶有抗生素抗性基因的載體進(jìn)入受體菌后，受體菌才能生長。,不帶有抗生素抗性基因的受體菌不能在含有抗生素的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）中生長。,（2）抗生素選擇原理,活,死,抗性基因,抗生素,4、人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體的類型,（1）高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體

13、,ColE1、pMB1派生質(zhì)粒具有高拷貝數(shù)的特點(diǎn)。,而且在沒有菌體蛋白質(zhì)合成的條件下（蛋白質(zhì)合成抑制劑，氯霉素等存在下）仍能復(fù)制，達(dá)到每個(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù)1000-3000個(gè)！質(zhì)粒DNA含量可達(dá)細(xì)胞DNA總量的40-50。,適合大量增殖克隆基因、或需要表達(dá)大量的基因產(chǎn)物。,Plasmid amplification,（2）低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體,但有特殊用途:,由pSC101派生來的載體，分子量小，拷貝數(shù)低。,當(dāng)有些被克隆的基因的表達(dá)產(chǎn)物過多時(shí)會(huì)嚴(yán)重地影響寄主菌的正常代謝活動(dòng)，導(dǎo)致寄主菌死亡時(shí)，就需要低拷貝的載體。,pLG338、pLG339、pHSG415等,不適合大量擴(kuò)增DNA用。,（3）失控的質(zhì)

14、粒載體,這是一類溫度敏感型復(fù)制控制質(zhì)粒。,溫度低（低于37 oC），拷貝數(shù)很少； 溫度增加（40 oC）時(shí)，拷貝數(shù)會(huì)很快增加到1000個(gè)以上。,如pBEU1、pBEU2。,runaway plasmid vectors,1979年B. E. Uhlin等構(gòu)建。,（4） 插入失活型質(zhì)粒載體,載體的克隆位點(diǎn)位于其某一個(gè)選擇性標(biāo)記基因內(nèi)部。,如pDF41、pDF42、pBR329。,抗生素抗性,外源DNA,無抗生素抗性,（5）正選擇的質(zhì)粒載體,如pUR2、pTR262等。,只有帶有選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞，才能在選擇培養(yǎng)基上生長。,直接選擇轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞。,目前通用的絕大部分質(zhì)粒載體都是正選擇載體。,

15、Direct selection vectors,（6） 表達(dá)型質(zhì)粒載體,主要用來使外源基因表達(dá)出蛋白質(zhì)產(chǎn)物。,如果在大腸桿菌里表達(dá)，必須把所克隆的基因置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄-翻譯信號(hào)控制之下。,注意啟動(dòng)子的性質(zhì)，終止子、起始密碼、終止密碼的閱讀正確。,復(fù)制起始點(diǎn)ORI 選擇標(biāo)記 多克隆位點(diǎn)MCS,2）大腸桿菌操縱子元件,阻遏基因 I 操縱基因O 啟動(dòng)基因P 核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（SD） 轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)區(qū)。,1）普通克隆載體元件,表達(dá)載體的結(jié)構(gòu),質(zhì)粒載體的選擇,理想質(zhì)粒載體應(yīng)具備的條件*,replicate independently single sites for a large number o

16、f restriction endonucleases selectable marker low molecular weight, multiple copies ; 缺少mob基因 插入外源基因的重組質(zhì)粒較易導(dǎo)入宿主細(xì)胞并復(fù)制和表達(dá)。,（五）經(jīng)典的大腸桿菌質(zhì)粒載體,1. pSC101,第一個(gè)成功地用于克隆實(shí)驗(yàn)的大腸桿菌質(zhì)粒載體。,（1）類型,天然質(zhì)粒，屬低拷貝型。,（2）長度,9.09 kb,（3）選擇標(biāo)記,四環(huán)素抗性Tetr,6個(gè)克隆位點(diǎn)： EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、BamH I、Sal I 主要使用EcoR I。,（4）克隆位點(diǎn),（其中Hind III、

17、BamH I、Sal I 3個(gè)位于、Tetr內(nèi)部）,2. ColE1,（1）類型,天然質(zhì)粒，屬高拷貝型。,（2）長度,6.3 kb。,（3）選擇標(biāo)記,特點(diǎn)是在培養(yǎng)基中加入氯霉素抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成后，質(zhì)粒仍然能復(fù)制達(dá)到每個(gè)細(xì)胞1000-3000拷貝之多！,大腸桿菌素（colicin）E1和對(duì)E1免疫的基因（immE1）, colicin E1基因的結(jié)構(gòu),cea,imm,kil,結(jié)構(gòu)基因,免疫基因,溶菌基因, 殺死不含有ColE1細(xì)菌的原因,cea + kil基因產(chǎn)物, 不被其他細(xì)菌的colicin E1所殺死的原因,imm基因,EcoR I位于E1內(nèi)部，插入外源DNA會(huì)導(dǎo)致E1失活，使受體菌不能

18、合成E1（ColE1-），但仍然表現(xiàn)出對(duì)E1免疫型（ImmE1+）。,EcoR I,（4）克隆位點(diǎn),Colicin E1,外源DNA,無Colicin,用對(duì)外源colicin E1的免疫性和自身不能合成colicin E1作選擇，操作非常繁雜。 對(duì)colicin E1敏感的細(xì)菌群體中自發(fā)突變產(chǎn)生抗colicin E1的頻率很高！,（5）ColE1的選擇缺陷,ColE1,抗 colicinE1,殺ColE1-,仍抗 colicinE1,不殺ColE1-,插入片斷,ColE1,復(fù)制位點(diǎn) 選擇性標(biāo)記 克隆位點(diǎn),克隆載體,表達(dá)載體,表達(dá)調(diào)控元件,必須的,基因工程載體的組成部分,上節(jié)內(nèi)容回顧,嚴(yán)緊型：

19、松弛型：,拷貝數(shù),是否轉(zhuǎn)移,質(zhì)粒的基本性質(zhì),上節(jié)內(nèi)容回顧,接合型： 非接合型：,1-3個(gè)拷貝 10個(gè)以上,F質(zhì)粒，不安全 R 質(zhì)粒，安全 Col質(zhì)粒,不相容性,在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。在細(xì)胞的增殖過程中，其中必有一種會(huì)被逐漸地排斥（稀釋）掉。這樣的兩種質(zhì)粒稱為不相容質(zhì)粒。,如果在其寄主細(xì)胞中存在著一種接合型的質(zhì)粒，非接合型質(zhì)粒也可以被轉(zhuǎn)移。這種由共存的接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過程，叫做質(zhì)粒的遷移作用。,質(zhì)粒的遷移作用,人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體的類型,（1）高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體： ColE1、pMB1,上節(jié)內(nèi)容回顧,（2）低拷貝

20、數(shù)的質(zhì)粒載體： pSC101派生的載體,（3）失控的質(zhì)粒載體：溫度敏感型復(fù)制控制質(zhì)粒,溫度低（低于37 oC），拷貝數(shù)很少； 溫度增加（40 oC）時(shí)，拷貝數(shù)會(huì)很快增加到1000個(gè)以上。,人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體的類型,（4） 插入失活型質(zhì)粒載體,上節(jié)內(nèi)容回顧,（5）正選擇的質(zhì)粒載體,（6） 表達(dá)型質(zhì)粒載體,抗生素抗性,外源DNA,無抗生素抗性,理想質(zhì)粒載體應(yīng)具備的條件,replicate independently single sites for a large number of restriction endonucleases selectable marker low molecular

21、 weight, multiple copies ; 缺少mob基因 插入外源基因的重組質(zhì)粒較易導(dǎo)入宿主細(xì)胞并復(fù)制和表達(dá)。,上節(jié)內(nèi)容回顧,經(jīng)典的大腸桿菌質(zhì)粒載體,1. pSC101,上節(jié)內(nèi)容回顧,經(jīng)典的大腸桿菌質(zhì)粒載體,2. ColE1,上節(jié)內(nèi)容回顧,（1）天然質(zhì)粒，高拷貝，可氯霉素?cái)U(kuò)增,（2）長度6.3 kb。,（3）選擇標(biāo)記：大腸桿菌素E1 對(duì)E1免疫的基因,pSP2124質(zhì)粒的Ampr基因,3. pBR322,（1）元件來源,分子克隆之父Boyer的兩個(gè)博士后Bolivar和Rodriguez構(gòu)建, 復(fù)制起點(diǎn) ori,來源于質(zhì)粒pMB1系列，高拷貝型復(fù)制起點(diǎn), Ampr基因, Tetr基

22、因,pSC101的Tetr 基因。,（2）長度,4363bp,（3）選擇標(biāo)記,氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。,（4）克隆位點(diǎn),其中9個(gè)會(huì)導(dǎo)致Tetr基因失活（如BamH I、Sal I）； 3個(gè)會(huì)導(dǎo)致Ampr基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。,24個(gè)克隆位點(diǎn)。,（5）pBR322的優(yōu)點(diǎn), 雙抗生素抗性選擇標(biāo)記,沒有獲得載體的寄主細(xì)胞 在Amp或Tet中都死亡。,獲得載體的寄主細(xì)胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。,插入失活，分兩次先后選擇：,外源基因BamH I,Amp中存活,但在Tet中死亡,外源基因Pst I,Tet中存活,但在Amp中死亡,氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個(gè)細(xì)胞可達(dá) 100030

23、00 copy，達(dá)細(xì)胞DNA總量的4050, 安全,失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因mob（mobilization）。不能通過接合轉(zhuǎn)移。, 高拷貝數(shù), 分子小，克隆能力大,4361bp，載體越小越好。 10kb的DNA在純化過程中容易斷裂。,（6）pBR322的缺點(diǎn),保留了轉(zhuǎn)移蛋白（bom）的作用位點(diǎn)。,部分質(zhì)粒雖不含tra基因，但含有bom位點(diǎn)（oriT），當(dāng)宿主細(xì)胞內(nèi)同時(shí)含有mob基因的輔助質(zhì)粒時(shí)， mob基因的產(chǎn)物可打開非接合質(zhì)粒的oriT位點(diǎn)，借助于接合質(zhì)粒tra基因的產(chǎn)物，使非接合質(zhì)粒被動(dòng)遷移到受體細(xì)胞中，發(fā)生遷移作用。,4. pUC系列,University of California的J.

24、Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基礎(chǔ)上改造而成。屬于正選擇載體。,pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19, 復(fù)制起點(diǎn),pBR322的 ori,但其上失去了克隆位點(diǎn)。, Ampr 基因,（1）元件來源, lacZ的啟動(dòng)子,大腸桿菌, lacZ基因,大腸桿菌lacZ的-肽鏈序列， 是lacZ 的5末端片斷，用于藍(lán)白斑篩選。,pBR322的Ampr基因,（2）長度,約2686bp,（3）克隆位點(diǎn),10個(gè)連續(xù)的單一限制酶切位點(diǎn)，位于lacZ基因的5端。,pUC18/19,Ampicillin 抗性和 lacZ的肽互補(bǔ)（藍(lán)白斑）相結(jié)合

25、。,（4）選擇標(biāo)記,藍(lán)白斑篩選原理：, X-gal,-半乳糖苷酶顯色底物,（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside）,（5-溴-4氯-3-吲哚葡萄糖苷）,-半乳糖苷酶能把無色的化合物X-gal分解成半乳糖和一個(gè)深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-氯靛藍(lán)。,X-gal,半乳糖,5-溴-4-氯靛藍(lán),-半乳糖苷酶, X-gal顯色反應(yīng), lacZ的肽互補(bǔ),1）-肽（ lacZ ）：,-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片斷（11-41氨基酸）。,lacZ只有在4聚體的狀態(tài)下才有功能.,C端大部分,N端的11-41aa,C端大部分,N端的11-41aa,C端大部分,N端的11-4

26、1aa,C端大部分,N端的11-41aa,4聚體,2）受體菌lacZ突變（lacZM15）,受體菌基因組的-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失肽），不能形成4聚體的活性酶，不能分解X-gal,受體菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a,pUC質(zhì)粒載體上的lacZ 編碼肽與受體菌缺失突變的-半乳糖苷酶“互補(bǔ)”，形成4聚體，從而能分解X-gal，產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。,C端大部分,N端的11-41aa,pUC lacZ,受體菌lacZ,3）載體lacZ與互補(bǔ),4）互補(bǔ)的插入失活,pUC載體上LacZ的5端有一段多克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)，

27、本身雖不干擾LacZ的合成，但插入外源基因就會(huì)阻止LacZ的合成。不能互補(bǔ)。,lacZ,5,3,肽移碼突變,lacZ,5,3,肽,不互補(bǔ),互補(bǔ),MCS,外源DNA, IPTG的誘導(dǎo)作用,IPTG是乳糖的類似物。能誘導(dǎo)lac操縱子的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，使受體菌基因組中的lacZ 的C端部分和載體的lacZ肽都表達(dá)。從而互補(bǔ)。,但載體MCS上插入外源DNA后，仍然不能產(chǎn)生肽！,IPTG,通過看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有DNA插入。,MCS無插入時(shí)，互補(bǔ)，藍(lán)菌斑。 MCS有插入時(shí)，不互補(bǔ)，白菌斑。,IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果：,（5）pUC系列載體的優(yōu)點(diǎn), 更小的分子量，更高的拷貝,pUC18為2686b

28、p，500700拷貝。, 選擇方便,X-gal顯色、抗生素雙重直接選擇。, 克隆便利,具有多克隆位點(diǎn)（MCS），使有兩個(gè)不同粘性末端的外源DNA方便地插入。, 測(cè)序方便,M13通用引物,Promega 公司的T載體系列,pGEM-T vector,5. PCR產(chǎn)物克隆載體T 載體,T vector的克隆過程簡便！,A,A,T,T,T vector,PCR product,T4 DNA ligase,A,A,（六）其它重要的質(zhì)粒載體,1. 喪失遷移功能的質(zhì)粒載體,pBR327,在pBR322的基礎(chǔ)上去掉了1089bp的片段,（2）比pBR322有更高的拷貝，平均每個(gè)細(xì)胞中含有30-45個(gè)拷貝。,

29、（1）刪除bom識(shí)別位點(diǎn)，即便在共存的F質(zhì)粒提供轉(zhuǎn)移裝置的條件下，也不可能發(fā)生遷移作用。保證了基因工程的安全性。,（六）其它質(zhì)粒載體,2. 能在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體,pGEM-3Z,由pUC派生而來，主要區(qū)別是在MCS的兩側(cè)分別加了一個(gè)噬菌體啟動(dòng)子T7和SP6。,T7啟動(dòng)子,SP6啟動(dòng)子,MCS,lacZ,Ampr,ori,可被T7和SP6的RNA聚合酶識(shí)別轉(zhuǎn)錄。, 如果加入純化的T7或SP6 RNA聚合酶，在試管里就可以體外轉(zhuǎn)錄mRNA, 外源基因正接反接都可以轉(zhuǎn)錄。,pGEM-4Z,與pGEM-3Z相同，只是T7啟動(dòng)子和SP6啟動(dòng)子的位置互換。,pGEM-3Z的特點(diǎn), MCS與pUC

30、18的完全一樣。,3. 穿梭質(zhì)粒載體,（1）穿梭質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu),人工構(gòu)建的、具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記、可以在兩種不同類群的寄主中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。,（shuttle plasmid vectors）,Yeast復(fù)制起點(diǎn),E.coli復(fù)制起點(diǎn),E.coli選擇標(biāo)記,Yeast選擇標(biāo)記,MCS,大腸桿菌 枯草桿菌穿梭載體 大腸桿菌 釀酒酵母穿梭載體 大腸桿菌 動(dòng)物細(xì)胞穿梭載體,（2）常用的穿梭質(zhì)粒載體,（3）穿梭載體的優(yōu)點(diǎn), 也能利用其它細(xì)胞系統(tǒng)（酵母、枯草桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等）進(jìn)行基因表達(dá)。, 可以自如地在兩種不同寄主細(xì)胞之間來回轉(zhuǎn)移基因。,構(gòu)建、克隆,表達(dá),E.coli,Animal

31、 cell, 利用大腸桿菌進(jìn)行基因克隆,（ 七）質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性,1. 質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳必須的兩個(gè)條件：,（1）每個(gè)世代、每個(gè)質(zhì)粒至少要復(fù)制一次,（2）在細(xì)胞分裂時(shí)，復(fù)制過的質(zhì)粒必須分配到兩個(gè)子細(xì)胞中。,有主動(dòng)分配和隨機(jī)分配兩種假說。,（1）主動(dòng)分配,天然質(zhì)粒。,2. 質(zhì)粒分配方式,具有一個(gè)控制質(zhì)?？截惙峙涞墓δ軈^(qū)（Par），能以主動(dòng)分配的方式確保質(zhì)粒能正確分配到兩個(gè)子細(xì)胞中。,人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體缺失了par區(qū)，只能以隨機(jī)分配方式分到子細(xì)胞中。,人工質(zhì)粒,（一般情況下也能保證質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳）,（2）隨機(jī)分配,但在一定條件下會(huì)出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的現(xiàn)象。,在寄主菌細(xì)胞分裂的過程中，有一個(gè)細(xì)胞沒有獲得質(zhì)粒拷

32、貝，并最終繁殖成無質(zhì)粒的優(yōu)勢(shì)群體。,3. 分離的不穩(wěn)定性,（segregation instability）,4. 結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性,（structural instability）,寄主基因組的插入序列插入質(zhì)粒、質(zhì)粒間的同源重組等都會(huì)使質(zhì)粒發(fā)生插入或缺失。,IS,dimer,重組,（1）新陳代謝負(fù)荷：,5. 影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素,使寄主細(xì)胞生長減緩：,質(zhì)粒載體使寄主的世代時(shí)間延長約15%。,減緩的程度與質(zhì)粒的分子量成正比。,復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯負(fù)荷,丟失質(zhì)粒的細(xì)胞反而會(huì)成為優(yōu)勢(shì)群體！,不同細(xì)胞個(gè)體之間的質(zhì)粒載體拷貝數(shù)的差異程度，稱差度。,（2）質(zhì)粒載體的拷貝數(shù),低拷貝數(shù)的質(zhì)粒的差度小，遺傳

33、穩(wěn)定。,差度（variance）：,是產(chǎn)生無質(zhì)粒細(xì)胞的重要原因。,高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體差度大，擁有少量拷貝數(shù)的菌體多，發(fā)生丟失的可能性大。,質(zhì)粒載體之間發(fā)生重組會(huì)形成二聚體、三聚體，甚至四聚體等所謂的質(zhì)粒寡聚體，其穩(wěn)定性比單體差。 含有大分子量插入片斷的質(zhì)粒載體普遍能形成質(zhì)粒寡聚體。,野生型E.coli中，質(zhì)粒在寄主的重組酶作用下會(huì)發(fā)生重組形成二聚體質(zhì)粒。,（3）寄主菌的重組體系對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng),二聚體災(zāi)難（dimer catastrophe）：,重組的質(zhì)粒二聚體一旦形成，便會(huì)以高出質(zhì)粒單體分子兩倍的速度進(jìn)行復(fù)制，從而導(dǎo)致出現(xiàn)質(zhì)粒寡聚體的克隆增殖,藍(lán)白斑篩選,上節(jié)內(nèi)容回顧,其它重要的質(zhì)粒載

34、體,（1）喪失遷移功能的質(zhì)粒載體： pBR327,上節(jié)內(nèi)容回顧,（2）能在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體： pGEM-3Z,（3）穿梭質(zhì)粒載體：pYES2,質(zhì)粒分配方式,（1）主動(dòng)分配： 天然質(zhì)粒,上節(jié)內(nèi)容回顧,（2）隨機(jī)分配：人工質(zhì)粒，在一定條件下會(huì)出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的現(xiàn)象。,分離的不穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性,影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素,（1）新陳代謝負(fù)荷,上節(jié)內(nèi)容回顧,（2）質(zhì)粒載體的拷貝數(shù),差度（variance）：,（3）寄主菌的重組體系,二聚體災(zāi)難（dimer catastrophe）：,低拷貝數(shù)的質(zhì)粒的差度小，遺傳穩(wěn)定。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體差度大，發(fā)生丟失的可能性大。,二、噬菌體載體,噬菌體的

35、一般特性,噬菌體或病毒是一類非細(xì)胞微生物，能高效率高特異性地侵染宿主細(xì)胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會(huì)相互轉(zhuǎn)化。,上述特性使得噬菌體或病毒的DNA能被開發(fā)成為基因工程的有用載體，因?yàn)椋?1.高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞 2.自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增,分為兩種：,1. 溶菌周期：,噬菌體的生活周期,感染細(xì)菌后，立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白質(zhì)外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞解體，釋放出大量子代噬菌體。,烈性噬菌體（virulent phage),2. 溶源周期：,感染細(xì)菌后，將自己的DNA整合到細(xì)菌

36、的染色體DNA中。形成這一過程稱為溶源化。,整合到細(xì)菌染色體的噬菌體DNA稱為原噬菌體，隨細(xì)菌的染色體復(fù)制而復(fù)制。,溫和噬菌體（temperate phage),原噬菌體（prophage)：,噬菌體載體,雙鏈?zhǔn)删w載體噬菌體 單鏈?zhǔn)删w載體M13 cosmid克隆載體,（一）雙鏈?zhǔn)删w載體載體,（1）長度為48 502 bp； （2）雙鏈線性DNA； （3）兩端5末端帶有cos位點(diǎn)，可以環(huán)化。,DNA兩端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱為cos位點(diǎn)。,1. DNA分子的特點(diǎn),cos位點(diǎn)（cohensive-end site）：,DNA進(jìn)入菌體后，形成雙鏈環(huán)狀DNA復(fù)制型（RF

37、 DNA）,DNA上有至少61個(gè)基因，有一半是必需的，與自身的活動(dòng)有關(guān)，功能相近的成簇排列。 噬菌體生長的非必需基因，約占1/3，位于尾部合成至阻遏之間的區(qū)段（J-N基因），為可替換區(qū)。,2. 噬菌體的基因組特點(diǎn), genome(48502bp),3. 噬菌體作為構(gòu)建載體材料的依據(jù),（1）噬菌體是一種溫和噬菌體。對(duì)大腸桿菌具有很高的感染能力，以原噬菌體的形式長期潛伏在溶原細(xì)胞中，容易保存。并且在一定條件下又可轉(zhuǎn)入溶菌生長途徑，進(jìn)行大量增殖。 （2）能承載比較大的外源DNA片斷。野生型噬菌體頭部容許包裝DNA分子大小75%105%的DNA片斷，約36.451kb.而且DNA上約有20kb的區(qū)域?qū)?/p>

38、噬菌體的生長不是絕對(duì)需要的，可以缺失或被外源DNA取代。 （3） DNA分子上有多種限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。,4. 噬菌體載體的構(gòu)建,（1）基因組太大（48 502bp）； （2）酶切點(diǎn)太多，它有5個(gè)BamH位點(diǎn)，6個(gè)Bg位點(diǎn)，5個(gè)EcoR位點(diǎn)。 （3）野生型只能接納一定長度的DNA。相當(dāng)于噬菌體的75-105%，那么能接納DNA最大為： 49kb5%=2.45kb,噬菌體的缺陷：, 去除非必需區(qū)，建立克隆或替換位點(diǎn) 非必需區(qū)內(nèi)插入選擇標(biāo)記基因 突變某些基因，使它成為安全載體 刪除DNA必須區(qū)段上常用的限制酶切點(diǎn) 本身有5個(gè) EcoR I 和7 個(gè)Hind III切點(diǎn)！,4. 噬菌體載體的構(gòu)建,（1

39、）構(gòu)建過程,噬菌體載體的類型,置換型:,兩種類型：,插入型:,噬菌體非必需區(qū)兩側(cè)有一對(duì)限制性酶切位點(diǎn)，可被外源DNA置換的載體，稱為置換型載體。,只含一個(gè)限制性位點(diǎn)可供插入外源DNA的載體，這類噬菌體載體稱插入型載體。,（2）人工構(gòu)建的噬菌體載體有兩種類型：, 插入型載體（insertion vectors),只具有一個(gè)可供外源DNA插入的克隆位點(diǎn)，也有一些有兩個(gè)位點(diǎn)，但彼此靠近。廣泛用于cDNA及小片段DNA的克隆。,1）免疫功能失活型：,插入位點(diǎn)位于合成活性阻遏物區(qū)域（cI基因）內(nèi) cI基因表達(dá)，使噬菌體進(jìn)入溶源狀態(tài)。,EcoR I,gt10（43 340 bp）,插入導(dǎo)致cI基因失活，載

40、體DNA不能進(jìn)入溶源期，受體菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。 沒有外源DNA插入的載體感染受體菌形成混濁噬菌斑。,選擇標(biāo)記,如NM1149載體的兩個(gè)克隆位點(diǎn)（EcoR I 和Hind III）都是位于cI基因內(nèi)部。,2）-半乳糖苷酶失活型載體：,gt10基因組中引入了LacZ序列。,感染LacZ突變的大腸桿菌，經(jīng)IPTG的誘導(dǎo)，利用X-gal的顯色反應(yīng)作選擇標(biāo)記。,EcoR I,Charon16A,選擇標(biāo)記:, 替換型載體（substitution vectors) p45,可克隆較大的DNA片段（923kb），構(gòu)建基因組文庫,兩個(gè)MCS，反向重復(fù)位于非必需區(qū)兩端,用酶切后，可以將中間的區(qū)段切下

41、來，與用同樣酶切成的外源DNA片斷置換。,選擇標(biāo)記：可取代片斷中如果包含LacZ，可用Xgal顯色作篩選標(biāo)記。,1） EMBL4, EMBL4的可置換片斷內(nèi)部還有Sal I酶切位點(diǎn)。,以便于進(jìn)一步消化中間片斷，防止自我連接。,左臂,可置換區(qū),右臂,EcoR I BamH I Sal I,Sal I BamH I EcoR I,Sal I Sal I,EMBL4,2）Charon40,Charon40的可置換片斷是由DNA短片重復(fù)構(gòu)成，片斷之間有Hae I 切點(diǎn)。,在克隆的時(shí)候，可以用Hae I 酶進(jìn)一步將可置換片斷切成小片斷，以防止重新與載體連接。,載體克隆策略,置換型載體, DNA象質(zhì)粒載體

42、那樣直接轉(zhuǎn)化細(xì)菌時(shí)效率遠(yuǎn)比質(zhì)粒低。,5. 載體的體外包裝,必須利用噬菌體外殼的作用 轉(zhuǎn)導(dǎo),（2）體外包裝的容量限制：,必須在正常野生型容量的75% 105% （36 - 51kb）之間。,既不能超過正常野生型容量的105%； 又不能低于正常野生型容量的75%,野生型DNA的必需區(qū)是28kb，所以載體的最大克隆容量是 。,23kb,（實(shí)際上為15kb）。,比一般的質(zhì)粒載體的容量大的多。,6. DNA載體的優(yōu)點(diǎn),用在真核生物基因組文庫的建立。,Sau3A,BamHI,上節(jié)內(nèi)容回顧,雙鏈?zhǔn)删w載體載體,cos位點(diǎn),上節(jié)內(nèi)容回顧,雙鏈?zhǔn)删w載體載體, 插入型載體（insertion vectors),

43、1）免疫功能失活型：,EcoR I,gt10（43 340 bp）,上節(jié)內(nèi)容回顧,2）-半乳糖苷酶失活型載體：,EcoR I,Charon16A, 替換型載體（substitution vectors) p45,可克隆較大的DNA片段（923kb），構(gòu)建基因組文庫,上節(jié)內(nèi)容回顧,（2）體外包裝的容量限制：,必須在正常野生型容量的75% 105% （36 - 51kb）之間。,野生型DNA的必需區(qū)是28kb，所以載體的最大克隆容量是23kb。,上節(jié)內(nèi)容回顧,（二）單鏈?zhǔn)删w載體,M13、f1、fd 噬菌體,單鏈環(huán)狀DNA的絲狀大腸桿菌噬菌體：,M13 噬菌體,（3）RF DNA和ssDNA都能轉(zhuǎn)

44、染感受態(tài)大腸桿菌。,（4）不存在包裝限制 （噬菌體顆粒大小，是受DNA多寡制約）,（5）可產(chǎn)生大量的含有外源DNA插入片斷的 單鏈分子，便于作探針或測(cè)序。,（2）復(fù)制型（RF）是雙鏈環(huán)狀DNA。,（1）+DNA。（ssDNA）,1. 單鏈DNA噬菌體的特點(diǎn),2. M13 噬菌體,M13噬菌體只感染雄性大腸桿菌。 但M13 DNA可以轉(zhuǎn)染雌性大腸桿菌。,（1）寄主,2. M13 噬菌體,RF dsDNA在寄主細(xì)胞內(nèi)以高拷貝形式存在。,成熟的噬菌體里只包裝有 + DNA，也容易提取。,M13噬菌體只感染雄性大腸桿菌。 但M13 DNA可以轉(zhuǎn)染雌性大腸桿菌。,6407 bp。,（2）DNA長度,（3

45、）DNA提純,（1）寄主,M13通過雄性細(xì)菌的F性菌毛注入其+DNA,近200個(gè) RF DNA,每細(xì)胞每世代放出約1000個(gè)子代噬菌體顆粒！不導(dǎo)致溶菌！,（4）M13的生活周期,M13的包裝過程：,RF dsDNA指導(dǎo)合成的+DNA,M13基因V編碼單鏈DNA結(jié)合蛋白,DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物,轉(zhuǎn)移到寄主的細(xì)胞膜,M13外殼蛋白,基因V蛋白脫落,+DNA,溢出細(xì)胞膜,包裝,（5）沒有包裝限制,絲桿噬菌體（如M13或fd）不殺死細(xì)胞，子代毒粒以分泌方式 不斷從受染細(xì)胞中釋放，并同時(shí)完成毒粒的組裝。,雖然不導(dǎo)致溶菌，但使菌斑混濁（細(xì)菌生長變慢，約為正常的1/23/4）,3. M13載體的構(gòu)建：,M13

46、基因組中只有基因II與基因IV之間存在一段507bp的基因間隔區(qū)。,（1）克隆區(qū)域的選定, 基因間隔區(qū)（intergenic region, IG區(qū)）,M13,J. Messing證明，IG區(qū)存在M13的復(fù)制起點(diǎn)，但可以插入外源DNA而不影響M13噬菌體的活力。,3. M13載體的構(gòu)建：,（1）克隆區(qū)域的選定,IG區(qū)內(nèi)只有一個(gè) BsuI 切點(diǎn)。,其余9個(gè)BsuI限制性位點(diǎn)分布在其它部位。, 酶切位點(diǎn),M13基因組中只有基因II與基因IV之間存在一段507bp的基因間隔區(qū)。, 基因間隔區(qū)（intergenic region, IG區(qū)）,在IG區(qū)內(nèi)插入一個(gè)大腸桿菌的LacZ（-肽序列)。 利用-肽

47、序列中的三個(gè)單一酶切位點(diǎn)（Bgl II、Ava II 和 Pvu I）。,（2）加入選擇標(biāo)記及克隆位點(diǎn), 在IG區(qū)內(nèi)加入-肽序列及克隆位點(diǎn),第一個(gè)M13載體：M13mp1：,M13 RF,BsuI不完全消化,各種長度的線性片斷,（其中應(yīng)有只在IG上切開的線性全長M13）,E.coli lac基因的HindII片斷（lacI、lacP、lacO、lacZ）,連接,M13mp1,JM101宿主,只有在IG區(qū)插入lacZ才能存活并在X-gal上出現(xiàn)互補(bǔ)的藍(lán)噬菌斑,與pUC18相同,M13mp18的多克隆位點(diǎn),M13mpn n代表系列數(shù)字,4. M13系列載體的優(yōu)點(diǎn),（1）有MCS，便于克隆不同的酶切

48、片段,（2） X-gal顯色反應(yīng)，可供直接選擇,（3）無包裝限制，克隆能力大,（4）可以克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈,子代M13噬菌體中包含的是單鏈+DNA。 構(gòu)建成對(duì)的M13載體，多克隆位點(diǎn)排列相反,M13 RF,+,-,+,-,+,-,外源DNA,轉(zhuǎn)染E. coli,成熟的子代M13中,+,+, 插入外源DNA后，遺傳穩(wěn)定性顯著下降, 實(shí)際克隆能力小于1500bp。,雖無包裝限制， 并非無限包裝！,5. M13載體的缺點(diǎn),主要應(yīng)用于克隆和分離單鏈外源DNA片斷。,6. M13載體的應(yīng)用,（一）黏粒載體（柯斯載體, cosmid）,三、 噬菌體質(zhì)粒雜合載體,1978年J. Collins和

49、B. Hohn等人發(fā)展出cosmid vector（cos site-carrying plasmid）, DNA：,5 - 7kb,（1）大小,（2）組成,復(fù)制起點(diǎn) 抗性標(biāo)記基因 多克隆位點(diǎn),cos序列和包裝相關(guān)序列,pBR322：,pHC79由pBR322質(zhì)粒DNA與噬菌體DNA的cos位點(diǎn)及其控制包裝作用的序列構(gòu)成。, 具有噬菌體的特性：,（3）cosmid vector的特點(diǎn),提供了體外包裝必須的cos位點(diǎn)。所以克隆外源DNA后可以體外包裝成噬菌體顆粒。但是由于cosmid vector不含有 噬菌體溶菌、溶源生長途徑和DNA復(fù)制系統(tǒng)，所以不會(huì)產(chǎn)生子代噬菌體。, 具有質(zhì)粒載體的特性：,

50、大多帶有pMB1或ColE1的復(fù)制子，能象質(zhì)粒一樣復(fù)制。,有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位點(diǎn)。, 方便的選擇：, 高容量的克隆能力，選擇性強(qiáng)：,45kb （最少不能低于30kb）。 不帶外源DNA片段的載體不能被包裝,51kb-5kb45kb,（3）cosmid vector的特點(diǎn),柯斯載體：5 - 7kb,（4）部分cosmid vector,應(yīng)用cosmid載體在大腸桿菌中克隆大片段的真核基因組DNA技術(shù)。,（5）柯斯克?。╟osmid cloning）, 用特定的核酸內(nèi)切酶消化真核生物DNA。, 用同樣的內(nèi)切酶消化cosmid載體。,產(chǎn)物中將有一定比例的分子是兩端各有一個(gè)cos位點(diǎn)、

51、長度40kb左右的真核DNA與載體的連接物。, 連接,兩個(gè)cos位點(diǎn)之間，必須保持38 - 45kb的DNA，Ter體系才能識(shí)別。 識(shí)別cos位點(diǎn)，切割合適長度的雜種DNA連接物，并包裝入噬菌體頭部。,注入到細(xì)菌體內(nèi)的雜種DNA分子環(huán)化，并按質(zhì)粒的方式復(fù)制。, 感染大腸桿菌, Ter體系識(shí)別并切割,感染大腸桿菌產(chǎn)生噬菌斑 OR 抗性菌落？, 載體片斷自我連接。, 外源DNA片斷自我連接。, 多個(gè)本來不在一起的外源DNA片斷連接起來同時(shí)插入載體。,（6）cosmid載體克隆的缺點(diǎn),用堿性磷酸酶除去線性質(zhì)粒片斷5端的磷酸，可防止載體自體連接。,克服載體自體連接的改良方案：,（二） 噬菌粒載體（ph

52、agemid）,由質(zhì)粒載體與單鏈?zhǔn)删w載體結(jié)合而成的新型載體系列。,M13：DNA間隔區(qū),（1）大小,（2）組成,質(zhì)粒,復(fù)制起點(diǎn) 抗性標(biāo)記基因 多克隆位點(diǎn),約3000bp（比M13?。? 克隆能力大,能插入10kb的外源DNA。, 兩種復(fù)制形式,（3）噬菌粒載體的特點(diǎn),既能在大腸桿菌中以質(zhì)粒的形式雙鏈復(fù)制,又能像M13載體一樣進(jìn)行單鏈復(fù)制，并在包裝成噬菌體顆粒之后被擠壓出寄主細(xì)胞。,（4）常見的噬菌粒載體,輔助噬菌體用來復(fù)制和包裝噬菌粒載體。,1）pUC118/pUC119, 構(gòu)成,. M13的基因間隔區(qū)（IG）,. pUC18/pUC19質(zhì)粒載體：,帶有M13復(fù)制起點(diǎn)。,質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn) Amp

53、r lacZ MCS, pUC118/119的復(fù)制模式,兩種不同的復(fù)制模式,. 雙鏈質(zhì)粒復(fù)制模式,受pUC本身的復(fù)制起點(diǎn)（來源于ColE1）的控制。,每個(gè)細(xì)胞能達(dá)到500個(gè)拷貝,來源于M13的復(fù)制起點(diǎn)被輔助噬菌體的基因II產(chǎn)物控制。,. 單鏈滾環(huán)噬菌體復(fù)制模式,外殼蛋白,復(fù)制蛋白,輔助M13,包裝,當(dāng)寄主細(xì)胞被輔助噬菌體M13感染后。, 噬菌粒載體的包裝,. 輔助噬菌體：,自身的復(fù)制起點(diǎn)發(fā)生了突變，復(fù)制效率低下，但感染細(xì)菌后能表達(dá)出外殼蛋白和復(fù)制蛋白，幫助噬菌粒載體復(fù)制。,如M13K07等。,. 包裝：,輔助噬菌體,外殼蛋白和 復(fù)制蛋白,噬菌粒載體,ssDNA,噬菌體,2）pBluescrip

54、t 噬菌粒載體（pBS）,Stratagene公司發(fā)展的一類噬菌粒載體,由pUC質(zhì)粒、f1噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)和T3、T7的啟動(dòng)子組成。, 特點(diǎn), 組成,MCS兩側(cè)分別加上T3和T7啟動(dòng)子。加入適當(dāng)?shù)氖删wRNA聚合酶，就可定向體外轉(zhuǎn)錄。,. 定向體外轉(zhuǎn)錄,. 兩種復(fù)制模式,既能以質(zhì)粒的形式復(fù)制，又能以噬菌體的形式復(fù)制包裝。,. 選擇方便,有Ampr和lacZ選擇標(biāo)記,. 插入方便,18個(gè)單一酶切位點(diǎn)的MCS,SK：表示lacZ的轉(zhuǎn)錄方向是沿MCS上的 SacI KpnI,+（f1+）：單鏈復(fù)制起始方向背離lacZ,pBluescript SK（+/-）/pBluescript KS（+/-）,K

55、S：反向（ KpnI SacI ，MCS相反）,-（f1-）：相反,pBluescript SK/KS（+/-）區(qū)分：, 常用的 pBluescript 載體,pBS SK+,pBS KS-,利用染色體的復(fù)制元件來驅(qū)動(dòng)外源DNA片段復(fù)制的載體稱為人工染色體。 ”穿梭”克隆載體 含有質(zhì)?？寺≥d體必備的第一受體(大腸桿菌)源質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)(ori)； 含有第二受體(酵母)染色體DNA著絲點(diǎn)、端粒和復(fù)制起始位點(diǎn)的序列，以及合適的選擇標(biāo)記基因。,四、人工染色體,在第一受體細(xì)胞內(nèi)可以按質(zhì)粒形式進(jìn)行高拷貝復(fù)制；一般采用抗菌素抗性選擇標(biāo)記； 在體外，載體與目的片斷重組，轉(zhuǎn)化第二受體細(xì)胞；常與受體互補(bǔ)的營養(yǎng)

56、缺陷 在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞內(nèi)按染色體DNA復(fù)制的形式進(jìn)行復(fù)制和傳遞。,目前常用的人造染色體載體包括：,細(xì)菌人造染色體（BAC）,酵母人造染色體（YAC）,四、人工染色體,DNA自主復(fù)制序列（ARS） autonomously replication sequences,著絲粒（centromere，cen）,兩個(gè)端粒（telomeres，tel）,TEL,TEL,CEN,ARS,1. 染色體復(fù)制和遺傳的三個(gè)基本組件,A.W.Murray 1983年形成基礎(chǔ)理論, D.T.Burke等1987年變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。,（一）酵母人造染色體（YAC）,位于 SUP4 基因內(nèi)部。,（1）克隆位點(diǎn),插入失活選擇：,SUP

57、4（酪氨酸+RNA赭石突變抑制基因），SUP4失活的酵母菌落呈紅色； 不失活的菌落是白色。,2. YAC的其它組成結(jié)構(gòu),11 500bp,TRP1、URA3尿嘧啶（分別位于兩臂）。,細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn) ori 抗生素標(biāo)記Ampr,（2）在酵母中的標(biāo)記基因,（3）在細(xì)菌中操作,11 500bp,（1）宿主酵母菌：,只有同時(shí)得到Y(jié)AC的兩個(gè)臂，才能在基本培養(yǎng)基（不加TRP和URA）上生長。,（2）選擇方式,trp- 和 ura-尿嘧啶,cen,ura3,trp1,3. YAC載體轉(zhuǎn)化過程,構(gòu)建基因文庫，特別是高等真核生物基因組文庫,（1）宿主酵母菌：,（2）選擇方式,trp- 和 ura-尿嘧啶,ce

58、n,ura3,trp1,3. YAC載體轉(zhuǎn)化過程,構(gòu)建基因文庫，特別是高等真核生物基因組文庫,（3）克隆片段大小,一般可達(dá) 200-500kb，有的可達(dá) 1Mb 以上，甚至 2Mb,4. YAC的缺點(diǎn),（1）存在插入子的穩(wěn)定性問題。 （2）同一酵母細(xì)胞內(nèi)多個(gè)YAC引起交換。 （3）轉(zhuǎn)化效率低。 （4）難以制備純的YAC-DNA,在大腸桿菌F因子基礎(chǔ)上構(gòu)建的，高通量低拷貝的質(zhì)粒載體,（2）克隆容量可達(dá)300kb。,1. F質(zhì)粒的特點(diǎn)：,每細(xì)胞只有12個(gè)拷貝，不會(huì)重組。,（4）便于提純,像提取質(zhì)粒一樣直接提純。,（1）單拷貝復(fù)制。,（3）比較穩(wěn)定。,（二）細(xì)菌人工染色體（BAC）,2. BAC的組成結(jié)構(gòu),（1）OriS：嚴(yán)謹(jǐn)型復(fù)制子； （2）repE：解旋酶，促進(jìn)和控制質(zhì)粒的復(fù)制； （3）parA、parB和parC，確保低拷貝質(zhì)粒精確分配到子細(xì)胞。,2. BAC的組成結(jié)構(gòu),（4）CosN是噬菌體末端酶專一性切割位點(diǎn)。 （5）loxP是P1 Cre蛋白作用位點(diǎn)。 （6）HindIII和BamHI是插入位點(diǎn)。 （7