代謝工程的基本概念.ppt

微生物代謝工程 基本概念,2019/7/1,2,1. 微生物細(xì)胞能為其自身提供代謝能 2. 細(xì)胞能量轉(zhuǎn)換機(jī)構(gòu)的組成 3. 微生物代謝中的電子流和電子回路 4. 生物氧化和輔酶的再生 5. 生化反應(yīng)途徑和代謝途徑 6. 生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)和代謝網(wǎng)絡(luò) 7. 代謝網(wǎng)絡(luò)的聯(lián)網(wǎng)問題 8. 代謝流和碳架物質(zhì)流 9. 代謝主流,26 個(gè)基本概念,2019/7/1,3,10. 載流途徑與載流路徑 11. 代謝主流的變動(dòng)性和選擇性 12. 理想載流途徑 13. 微生物生物工程的難題 14. 代謝網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)及其剛性 15. 工業(yè)發(fā)酵的五字策略 16. 代謝網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)及其剛性 17. 代謝網(wǎng)絡(luò)的剛性 18. 微生物活細(xì)胞和細(xì)胞的經(jīng)濟(jì)性,2019/7/1,4,19. 正常代謝和競(jìng)爭型細(xì)胞經(jīng)濟(jì) 20. 異常代謝和導(dǎo)向型細(xì)胞經(jīng)濟(jì) 21. 細(xì)胞經(jīng)濟(jì)受到嚴(yán)格的制約 22. 信息流指導(dǎo)下的工業(yè)發(fā)酵 23. 限制性遺傳信息之謎 24. 從發(fā)酵工程到微生物代謝工程 25. 微生物代謝工程 26. 代謝流及其控制的分析,2019/7/1,5,1. 微生物細(xì)胞能為其自身提供代謝能 微生物細(xì)胞的生存方式與動(dòng)物、植物等高等生物的細(xì)胞不同，微生物細(xì)胞能獨(dú)立存在、自主生活。因此每個(gè)微生物細(xì)胞都具有能量轉(zhuǎn)換機(jī)構(gòu)，這種機(jī)構(gòu)可把其它形式的能量轉(zhuǎn)換成能被其自身直接使用的能量(如 ATP、GTP 和儲(chǔ)存在膜上的質(zhì)子運(yùn)動(dòng)勢(shì) P )，暫且把它們稱為代謝能。在代謝能的直接支撐下，活細(xì)胞才能維持其高度有序的狀態(tài)。,2019/7/1,6,2.細(xì)胞能量轉(zhuǎn)換機(jī)構(gòu)的組成 微生物細(xì)胞的能量轉(zhuǎn)換機(jī)構(gòu)包括：需要代謝能來激活的代謝途徑的有關(guān)的酶和這些酶的輔酶、原核微生物的細(xì)胞質(zhì)膜和真核微生物線粒體的內(nèi)膜，以及這些膜上的電子傳遞鏈和ATP酶，還有在能量代謝和主動(dòng)輸送中起輔助作用的有關(guān)載體系統(tǒng)。,2019/7/1,7,3. 微生物細(xì)胞代謝的電子流和電子回路 工業(yè)發(fā)酵普遍使用的化能異養(yǎng)型微生物靠生物氧化把化學(xué)能轉(zhuǎn)化為可被微生物直接利用的代謝能。微生物細(xì)胞的生物氧化過程必須借助于輔酶，并且其生物氧化過程和跨膜的主動(dòng)輸送過程伴隨著電子(或質(zhì)子)的流動(dòng)，形成微生物代謝的跨膜的質(zhì)子回路。,2019/7/1,8,微生物代謝的跨膜質(zhì)子回路示意圖,電子回路示意圖,2019/7/1,9,4. 生物氧化和輔酶的再生 在微生物活細(xì)胞中，參與生物氧化反應(yīng)脫氫酶的輔酶本身不能跨過膜，被局限在其所在的細(xì)胞內(nèi)。它們必須被再生，才能回用，以維持能量代謝。脫氫酶的輔酶在細(xì)胞氧化還原反應(yīng)中接受電子而被還原成還原型輔酶，還原型輔酶將電子釋放給電子受體，從而實(shí)現(xiàn)脫氫酶的輔酶的再生。根據(jù)最終電子受體的類型，可把生物氧化分成有氧呼吸、無氧呼吸和發(fā)酵三種類型。,2019/7/1,10,5. 生化反應(yīng)途徑和代謝途徑 一系列按序進(jìn)行的生物化學(xué)反應(yīng)構(gòu)成生化反應(yīng)途徑；若這條途徑在活細(xì)胞里運(yùn)行，則為代謝途徑。,2019/7/1,11,6. 生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)和代謝網(wǎng)絡(luò) 生化反應(yīng)途徑按生物化學(xué)規(guī)律匯成生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)；代謝途徑與跨膜輸送系統(tǒng)按代謝規(guī)律匯成（物質(zhì)）代謝網(wǎng)絡(luò)。,2019/7/1,12,7. 代謝網(wǎng)絡(luò)的聯(lián)網(wǎng)問題 代謝中間物都在代謝網(wǎng)絡(luò)上，有些有機(jī)化合物雖然不在代謝網(wǎng)絡(luò)上但仍有可能與代謝網(wǎng)絡(luò)“聯(lián)網(wǎng)”。所謂“聯(lián)網(wǎng)”就是用化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)把指定的化合物連接到代謝網(wǎng)絡(luò)上去，從而使它與微生物的代謝建立聯(lián)系?！奥?lián)網(wǎng)”可以用化學(xué)或生物學(xué)方法(含DNA重組技術(shù))來實(shí)現(xiàn)。廣義的 “聯(lián)網(wǎng)” 包含代謝網(wǎng)絡(luò)細(xì)節(jié)不同的生命有機(jī)體之間接力賽式的代謝聯(lián)系。已在“網(wǎng)” 上或者可以“聯(lián)網(wǎng)” 的化合物都可能被開發(fā)為工業(yè)發(fā)酵的產(chǎn)物或原料。,2019/7/1,13,8. 代謝流和碳架物質(zhì)流 代謝物在代謝網(wǎng)絡(luò)中流動(dòng)形成代謝流。廣義的代謝流還包括能量流和信息流。在代謝分析和代謝工程中，代謝流往往首先是指有機(jī)物流(碳架物質(zhì)流)。,2019/7/1,14,9. 代謝主流 在一定的培養(yǎng)條件下，代謝物在代謝網(wǎng)絡(luò)中流動(dòng)，流量相對(duì)集中的代謝流叫做該培養(yǎng)條件下的代謝主流。代謝主流的流量測(cè)定是代謝工程的重要組成部分。,2019/7/1,15,10. 載流途徑與載流路徑 從字面上講，有代謝物流通過的代謝途徑即載流途徑。載流路徑是工業(yè)發(fā)酵領(lǐng)域的術(shù)語。在工業(yè)發(fā)酵的目的產(chǎn)物生產(chǎn)階段，碳架物質(zhì)從原料到目的產(chǎn)物流經(jīng)的各段代謝途徑(即載流途徑)，按流經(jīng)的先后次序首尾銜接，組合成載流路徑。代謝工程沒有必要研究所有的載流途徑，但必須研究載流路徑上的代謝流，也就是生產(chǎn)階段的代謝主流。,2019/7/1,16,11. 代謝主流的變動(dòng)性和選擇性 微生物的代謝主流的方向、流量甚至所流經(jīng)的途徑都可能發(fā)生變化。這就是微生物代謝主流的變動(dòng)性和代謝主流對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)中的途徑的選擇性。這種變動(dòng)和選擇的根據(jù)在微生物細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，選擇的原因是微生物所處的環(huán)境條件的變化。,2019/7/1,17,12. 理想載流路徑 為了提高產(chǎn)物對(duì)原料的轉(zhuǎn)化率， 就要求代謝主流(根據(jù)代謝分析的結(jié)果)經(jīng)設(shè)定的載流路徑流到目的產(chǎn)物。因?yàn)檫@樣的載流路徑是帶有主觀導(dǎo)向性的虛擬的載流途徑，所以把它們叫做理想載流路徑。,2019/7/1,18,13. 微生物代謝工程的難題 既然微生物的代謝主流對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的途徑有自主的選擇性，而工業(yè)發(fā)酵的目標(biāo)又是要微生物的代謝主流經(jīng)過理想載流途徑，流到目的產(chǎn)物，因此就有必要去解決理想載流途徑的設(shè)計(jì)問題和對(duì)代謝主流的合理導(dǎo)向問題。,2019/7/1,19,14. 代謝的“五段式” 在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中，培養(yǎng)器中的微生物細(xì)胞的代謝是分步進(jìn)行的。胞外營養(yǎng)物質(zhì)(一般要經(jīng)胞外酶降解后)從培養(yǎng)介質(zhì)跨膜進(jìn)入細(xì)胞，(一般要)經(jīng)過“向心途徑”、“中心途徑”和“離心途徑”等連續(xù)的代謝途徑的代謝，才能在胞內(nèi)生成目的產(chǎn)物，最后，目的產(chǎn)物跨過細(xì)胞質(zhì)膜排出細(xì)胞回到培養(yǎng)介質(zhì)中。,2019/7/1,20,工業(yè)發(fā)酵中細(xì)胞機(jī)器運(yùn)行階段 理想載流路徑的五段式,1、胞外酶對(duì)原料的降解及營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的過程 2、經(jīng)胞內(nèi)降解代謝途徑匯入中心代謝途徑 3、中心代謝途徑及其控制 4、合成代謝流及其控制 5、目的產(chǎn)物的跨膜及其控制,2019/7/1,21,因此，典型的理想載流途徑應(yīng)該由以上五段承擔(dān)不同代謝分工的依次銜接的代謝途徑組成。這就是載流途徑的“五段式”。在這條載流途徑上流動(dòng)的代謝主流對(duì)應(yīng)地也有五段，這就是代謝主流的“五段式”。,2019/7/1,22,15. 工業(yè)發(fā)酵的五字策略 在“ 載流路徑 ” 、“ 代謝主流 ” 和“ 五段式 ” 等概念的基礎(chǔ)上，從統(tǒng)籌的角度出發(fā)，提出作為一個(gè)整體用于設(shè)計(jì)育種以及發(fā)酵工藝控制的 的五字策略： “ 進(jìn)、通、節(jié)、堵、出 ”。,2019/7/1,23,進(jìn)，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)碳源營養(yǎng)物質(zhì)的吸收； 通，使來自上游和各個(gè)注入分支的碳架物質(zhì)能暢通地流向目的產(chǎn)物； 節(jié)，阻塞與目的產(chǎn)物的形成無關(guān)或關(guān)系不大的代謝支流，使碳架物質(zhì)相對(duì)集中地流向目的產(chǎn)物； 堵，消除或削弱目的產(chǎn)物進(jìn)一步代謝的途徑； 出，促進(jìn)目的產(chǎn)物向胞外空間分泌。,2019/7/1,24,16. 代謝網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)及其剛性 微生物代謝網(wǎng)絡(luò)中的途徑的交叉點(diǎn)(代謝流的集散處)叫做節(jié)點(diǎn)(node)，微生物自動(dòng)抵制節(jié)點(diǎn)處代謝物流量分配比率的改變的特性叫做節(jié)點(diǎn)的剛性。節(jié)點(diǎn)的剛性取決于微生物代謝的自動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)制。因此在應(yīng)用 “ 五字策略 ” 制訂育種方案時(shí)必須認(rèn)真考慮節(jié)點(diǎn)剛性問題，盡量采用解除反饋調(diào)節(jié)的育種手段。,2019/7/1,25,17. 代謝網(wǎng)絡(luò)的剛性 微生物自動(dòng)抵制代謝網(wǎng)絡(luò)中代謝物流量分布的改變的特性叫做代謝網(wǎng)絡(luò)的剛性。代謝網(wǎng)絡(luò)的剛性與主要?jiǎng)傂怨?jié)點(diǎn)的剛性大小、分布及數(shù)量密切相關(guān)。,2019/7/1,26,18. 微生物活細(xì)胞及其經(jīng)濟(jì)性 微生物活細(xì)胞是個(gè)遠(yuǎn)離平衡狀態(tài)的開放體系，是一種靠消耗能量而維持低熵的穩(wěn)定動(dòng)態(tài)的特殊結(jié)構(gòu)耗散結(jié)構(gòu)。,2019/7/1,27,從微生物細(xì)胞對(duì)能量和化學(xué)物質(zhì)的內(nèi)外交換、增收節(jié)支、協(xié)調(diào)自律等客觀規(guī)律出發(fā)，把微生物細(xì)胞作為按特殊的經(jīng)濟(jì)規(guī)律運(yùn)行的經(jīng)濟(jì)實(shí)體來看待，并且把這種按特殊的經(jīng)濟(jì)規(guī)律運(yùn)行的有利于生存競(jìng)爭(生存保障)的新陳代謝特性叫做細(xì)胞經(jīng)濟(jì)性。細(xì)胞的經(jīng)濟(jì)性可以以生成細(xì)胞的質(zhì)量與消耗底物的質(zhì)量之比值細(xì)胞經(jīng)濟(jì)系數(shù)來衡量。,2019/7/1,28,19. 正常代謝和競(jìng)爭型細(xì)胞經(jīng)濟(jì) 微生物在生存競(jìng)爭中進(jìn)化的方向是發(fā)展其自身的適應(yīng)能力和提高細(xì)胞運(yùn)行的經(jīng)濟(jì)系數(shù)。經(jīng)生存競(jìng)爭而幸存下來的野生型微生物在其所棲身的環(huán)境中是富有競(jìng)爭能力的，并且它們的代謝中間物在代謝網(wǎng)絡(luò)中的分布及細(xì)胞經(jīng)濟(jì)運(yùn)行狀況有利于細(xì)胞生長、繁殖和在競(jìng)爭中獲勝。在上述條件下，細(xì)胞處于正常代謝狀態(tài)，細(xì)胞經(jīng)濟(jì)體系呈現(xiàn)競(jìng)爭型細(xì)胞經(jīng)濟(jì)的特色。,2019/7/1,29,20. 異常代謝和導(dǎo)向型細(xì)胞經(jīng)濟(jì) 如果工業(yè)生產(chǎn)要求微生物在胞外累積某種代謝中間產(chǎn)物，則必須對(duì)微生物的代謝流進(jìn)行導(dǎo)向。根據(jù)已獲得的代謝分析的信息，應(yīng)用“五字策略”有可能設(shè)計(jì)理想載流途徑和配套的發(fā)酵培養(yǎng)工藝路線和工藝條件，進(jìn)而改造菌種和調(diào)整工藝，將代謝主流導(dǎo)向理想載流途徑。在導(dǎo)向成功的情況下，細(xì)胞處于異常代謝狀態(tài)，細(xì)胞經(jīng)濟(jì)體系呈現(xiàn)導(dǎo)向型細(xì)胞經(jīng)濟(jì)的特色。,2019/7/1,30,21. 細(xì)胞經(jīng)濟(jì)受到嚴(yán)格的制約 工業(yè)發(fā)酵依靠細(xì)胞群體的代謝來獲得產(chǎn)品，導(dǎo)向型細(xì)胞經(jīng)濟(jì)固然有利于特定的代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，但競(jìng)爭型細(xì)胞經(jīng)濟(jì)向?qū)蛐图?xì)胞經(jīng)濟(jì)的轉(zhuǎn)化受到能量代謝、還原力的平衡等條件的嚴(yán)格制約(以保證有熵的輸出)，表現(xiàn)出代謝網(wǎng)絡(luò)的剛性。若細(xì)胞經(jīng)濟(jì)實(shí)體的運(yùn)行狀態(tài)過度偏離競(jìng)爭型運(yùn)行狀態(tài)，活細(xì)胞的高度有序狀態(tài)將走向無序，最終導(dǎo)致細(xì)胞經(jīng)濟(jì)的崩潰。,2019/7/1,31,22. 信息流指導(dǎo)下的工業(yè)發(fā)酵 在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中，可以把微生物細(xì)胞看作是細(xì)胞機(jī)器，它們進(jìn)行能量代謝和物質(zhì)代謝；同時(shí)又可以把它們看作是信息處理器，它們復(fù)制和傳遞自己的生物信息，接收細(xì)胞內(nèi)外的物理、化學(xué)甚至生物信息，并在對(duì)內(nèi)外信息流進(jìn)行綜合處理的基礎(chǔ)上，發(fā)出代謝調(diào)控的指令，在網(wǎng)絡(luò)剛性的范圍之內(nèi)控制微生物細(xì)胞自身的生命活動(dòng)。,2019/7/1,32,23. 限制性遺傳信息之謎 可以推測(cè)在每個(gè)微生物細(xì)胞的遺傳物質(zhì)中必有其限制性的生死攸關(guān)的遺傳信息，它們規(guī)定微生物細(xì)胞生命活動(dòng)的基本的代謝網(wǎng)絡(luò)及其調(diào)節(jié)機(jī)制。這些遺傳信息是微生物細(xì)胞能夠自主生活與獨(dú)立存在的依據(jù)，也是微生物對(duì)環(huán)境的有限的適應(yīng)性以及設(shè)計(jì)育種的計(jì)劃往往不能完全兌現(xiàn)的內(nèi)在原因。,2019/7/1,33,24. 從發(fā)酵工程到微生物代謝工程 微生物生物工程(現(xiàn)代發(fā)酵工程)基本理論在對(duì)代謝流及其控制做出了定性或半定量的分析，并在此基礎(chǔ)上建立了工業(yè)發(fā)酵的策略思想。這就為代謝流(及其控制)的定量分析架起了橋梁