綜合化學實驗配位化學和生物無機化學部分.ppt

綜合化學實驗配位化學和生物無機化學部分,氨基酸銅配合物的模板合成 及其對質粒DNA的切割,指導教師：毛宗萬 劉文婷 黃華珍 997160366 ,中山大學化學與化學工程學院 2013年09月,/comlab/,實驗1 氨酸銅配合物的合成和表征 模板合成 IR光譜表征 自由基的UV光譜檢測 實驗4 DNA提取及其與氨酸銅配合物的作用 瓊脂糖凝膠電泳 凝膠成像 總學時：15 學時 地點：豐盛堂212室,實驗內容, 超螺旋DNA 缺刻型DNA 線型DNA,自由基機理 自由基進攻糖環(huán)或堿基，導致氧化破壞,酯水解機理 親核試劑進攻磷原子，發(fā)生親核取代反應,酯水解機理優(yōu)于自由基機理,DNA結構及其斷裂方式,配合物與未受損的DNA表面結合并誘導其斷裂 進一步在新的斷裂處結合 斷裂反應 互補鏈的斷裂,DNA的自由基斷裂,實驗背景模擬博萊霉素,在天然物質中，由5 個氨基酸、2 個六碳糖和1 個氨基側鏈構成的博來霉素（bleomycin）可導致DNA鏈的斷裂,從而作為一族廣譜抗菌抗腫瘤藥物。,導致DNA鏈的斷裂原因是由于博來霉素分子的一部分是鐵或銅的配合物，這類配合物能夠產生導致DNA鏈斷裂的自由基。,CuP-3A的配位結構示意圖,博萊霉素的活性中心,Pamatong, F. V.; Detmer. C. A., III; Bocarsly, J. R.; J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 5339. Detmer. C. A., III; Pamatong, F. V.; Bocarsly, J. R.; Inorg. Chem., 1996, 21, 6292.,博萊霉素的模型化合物,Cu2+ + e- = Cu+ Cu+ + H2O2 = Cu2+ + OH- + OH,氨基酸銅化合物的合成路線,模板反應的化學機理,化合物1的紅外光譜,(COO-),(COO-),(NO2),(NO2),化合物2的紅外光譜,(COO-),(COO-),(NH2),氫氧自由基的形成和UV光譜檢測,由于羅丹明B可與HO迅速反應，并在553nm有強吸收，因此我們可以利用此反應采用分光光度法檢驗HO的生成。,瓊脂糖凝膠電泳,瓊脂糖凝膠電泳是一種非常簡便、快速、最常用的分離純化和鑒定核酸的方法 瓊脂糖是從海藻中提取的一種線狀高聚物 根據(jù)瓊溶解溫度，把瓊脂糖分為一般瓊脂糖和低熔點瓊脂糖 低熔點瓊脂糖熔點為6265，溶解后在37下維持液體狀態(tài)約數(shù)小時，主要用于DNA片段的回收，質粒與外源性DNA的快速連接等,凝膠濃度選擇瓊脂糖凝膠的濃度與DNA分離范圍,電泳緩沖液,常用三種緩沖液 Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)、Tris-磷酸(TPE) TBE與TPE：緩沖容量高，DNA分離效果好，但TPE在DNA片段回收時含磷酸鹽濃度高，容易使DNA沉淀 TAE：緩沖容量低，但價格較便宜，因而推薦選用TAE。緩沖液中的 EDTA 可螯合二價陽離子，從而抑制DNA酶的活性，防止PCR擴增產物降解,核酸電泳的指示劑,指示劑：溴酚蘭、二甲苯青 溴酚蘭：在堿性液體中呈紫蘭色，電泳中，溴酚蘭的遷移率與雙鏈線性DNA片段 二甲苯青：水溶液呈蘭色，電泳時，其遷移速率與雙鏈線性DNA大致相當,核酸電泳的染色劑溴化乙錠,一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光 可在凝膠電泳液中加入終濃度為0.5ug/ml的EB，有時亦可在電泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色1015min 瓊脂糖凝膠EB染色，肉眼可見核酸電泳帶，其DNA量一般5ng 溴化乙錠太多，凝膠染色過深，核酸電泳帶看不清時，可將凝膠放入蒸餾水浸泡30min后再觀察,ethidium bromide，EB,DNA斷裂的凝膠電泳圖, 超螺旋DNA 缺刻型DNA 線型DNA,電泳實驗裝置,電泳儀（普通） 電泳槽（水平平板） 灌膠模具等,電泳實驗方法,洗凈電泳槽，架好梳子 配制瓊脂糖凝膠及倒膠 上樣與通電 結果觀察,配制瓊脂糖凝膠及倒膠,0.5TBE電泳緩沖液100ml于三角燒瓶中，稱取一定量的瓊脂糖粉放入后沸水鍋或微波爐內加熱熔化，冷卻至60(需要時可加入EB)，倒入電泳槽中，待凝固。 向電泳槽中倒入0.5 TBE，其量以沒過膠面2mm為宜，小心移去梳子（如樣品孔內有氣泡，應除去）,上樣與通電,在DNA樣品中加入0.2體積的載樣緩沖液，混勻后，加入樣品孔內 接通電源，一般紅色為正極黑色為負極，切記DNA樣品由負極往正極泳動（靠近加樣孔的一端為負），電壓為1 5V/cm（長度以兩個電極之間的距離計算） 根據(jù)指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳。一般 電泳條件為：電壓 90V，時間 40min。,結果觀察和記錄,紫外儀上觀察電泳帶及其位置 拍照 進一步使用軟件對光密度進行分析,合成實驗要點,檢查回流裝置是否保持干燥 硝酸銅在稱量前用濾紙吸干固體表面潮解的溶液 合成實驗中前半個小時注意觀察反應混合物的顏色變化，亮藍色或紫藍色為反應正常 實驗中化合物合成與DNA斷裂實驗需交叉進行， DNA斷裂所需的配合物由準備室提供 若硝基還原使用了較多溶劑，需使用旋轉蒸發(fā)器除去多余溶劑 凝膠電泳照相需戴手套,模板合成大環(huán)化合物的合成方法（212室） 旋轉蒸發(fā)器除去多余溶劑（212室） 紅外光譜化合物結構表征 （210室） 紫外可見光譜跟蹤羅丹明B與氫氧自由基的反應 凝膠電泳切割DNA （317室） 凝膠成像分析檢測DNA斷裂狀況（317室）,實驗技術和方法,實驗要求,做好預習（查閱藥品及溶劑的性質、羧基和硝基的IR特征峰值、光譜技術原理及思考題預習等） 實驗中做好實驗記錄及相關計算（包括實驗現(xiàn)象、產品重量、產率等） 做好每一次測試，并打印結果 實驗結束時提交最終產品和測試圖譜供檢查 對實驗結果作簡要討論 下一次實驗提交本次實驗報告 遵守實驗規(guī)則，嚴禁違規(guī)操作，做好清潔值日,（配位化學、生物無機化學、生物技術） V. V. Gerbeleu, V. B. Arion, J. Burgess, “Template synthesis of macrocyclic compounds”, WILEY-VCH ve