酵母RNA的提取與鑒定.pptVIP

酵母RNA的提取與鑒定,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握稀堿法分離酵母RNA的原理與操作過程。 了解RNA的組分并掌握定性鑒定的具體方法。,實(shí)驗(yàn)原理,由于RNA的來源和種類很多，因而提取制備方法也各異，一般有苯酚法、去污劑法和鹽酸胍法。 苯酚法是實(shí)驗(yàn)室最常用的。組織勻漿用苯酚處理并離心后，RNA即溶于上層被苯酚飽和的水相中，DNA和蛋白質(zhì)則留在苯酚層中，向水層加入乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出。 此法能較好地除去DNA和蛋白質(zhì)，提取的RNA具有生物活性。,實(shí)驗(yàn)原理,酵母細(xì)胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量為干菌體的2.67%10.0%，而DNA含量較少，僅為0.03%0.516%, 為此提取RNA多以酵母為原料。 工業(yè)上制備RNA多選用低成本、適于大規(guī)模操作的稀堿法或濃鹽法。這兩種方法所提取的核酸均為變性的RNA，主要用作制備單核苷酸的原料，其工藝比較簡單。,稀堿法是用氫氧化鈉使酵母細(xì)胞壁變性、裂解，然后用酸中和，除去蛋白質(zhì)和菌體后的上清液用乙醇沉淀RNA或調(diào)pH2.5利用等電點(diǎn)沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。 濃鹽法是用高濃度鹽溶液處理，同時加熱，以改變細(xì)胞壁的通透性，使核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來。,實(shí)驗(yàn)原理,RNA含有核糖、嘌呤堿/嘧啶堿和磷酸各組分。RNA在酸性條件下，即發(fā)生降解，形成的核糖繼而轉(zhuǎn)變?yōu)榭啡?，后者與地衣酚（3，5-二羥基甲苯）反應(yīng)呈鮮綠色，該反應(yīng)需用三氯化鐵或氧化銅作催化劑。,本實(shí)驗(yàn)采用的稀堿，既可加速細(xì)胞的破裂，又可增大 RNA的溶解度。當(dāng)堿被中和后，可用乙醇將RNA沉淀，此為 RNA的粗品。 樣品中少量脫氧核糖核酸(DNA)存在對鑒定無干擾，蛋白質(zhì)、粘多糖可干擾鑒定。,試劑的配制,地衣酚(苔黑酚) 三氯化鐵試劑 將100mg苔黑酚溶于100ml濃鹽酸中，再加入100mgFeCl36H2O(或等量CuO)。此液需臨用時配制。,實(shí)驗(yàn)步驟,1、酵母RNA的提取 稱5g干酵母粉于150 ml三角燒瓶中，加50ml 0.2的 NaOH，沸水浴中攪拌提取30 min。冷卻后滴加乙酸使其略偏酸性(pH56)。 離心(4000 rmin，15 min)，去除沉淀。向上清液中加入30 ml 95乙醇，稍攪拌后靜置。待完全沉淀后離心(4000 rmin，15 min) ，去上清液。沉淀加10 ml 95乙醇，攪拌后再次離心。沉淀再依次用10 ml的無水乙醇、乙醚(2)洗滌, 得RNA粗品。,2RNA的鑒定 取沉淀約0.2 g，加2 ml 10H2SO4沸水浴中加熱2 min加1.5 ml地衣酚試劑沸水浴中加熱觀察顏色變化。,實(shí)驗(yàn)步驟,注意事項(xiàng),稀堿法提取的RNA為變性RNA，可用于RNA組分鑒定及單核苷酸制備，不能作為RNA生物活性實(shí)驗(yàn)材料。 利用等電點(diǎn)控制R