高效液相色譜法測定甲硝唑的含量.ppt

藥劑綜合實(shí)驗(yàn)須知,實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目,一 高效液相色譜法測定甲硝唑的含量 二 氨茶堿加樣回收率實(shí)驗(yàn) 三 氨茶堿溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 四 紫外分光光度計法測定氨茶堿含量 五 氨茶堿原料藥穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 六 五味子散劑的制備 七 SOD的含量測定 八 蘆丁的提取和鑒別,實(shí)驗(yàn)要求,1課前認(rèn)真預(yù)習(xí)，明確本次實(shí)驗(yàn)的目的、要求、內(nèi)容、方法及步驟 2提前5-10min進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，檢查實(shí)驗(yàn)所需物品是否齊全，做好實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作。 3實(shí)驗(yàn)時嚴(yán)肅認(rèn)真，根據(jù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)要求進(jìn)行操作，仔細(xì)觀察和記錄，并進(jìn)行獨(dú)立思考，按時完成實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)報告。 4保持實(shí)驗(yàn)室安靜，實(shí)驗(yàn)時不得隨意走動和談笑。室內(nèi)嚴(yán)禁吸煙、不允許在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)接聽手機(jī).,5保持實(shí)驗(yàn)室清潔整齊，書包、衣帽等應(yīng)放在指定位置，不能置于實(shí)驗(yàn)臺上；一切實(shí)驗(yàn)用具用完后擦洗干凈，放回原處。 6愛護(hù)實(shí)驗(yàn)室一切儀器設(shè)備，珍惜藥品及一切消耗用品(如紗布、拭鏡紙、載玻片等)，節(jié)約水、電。按操作規(guī)程使用顯微鏡、解剖鏡等，使用前要檢查，使用后要擦拭整理，如發(fā)現(xiàn)損壞或故障應(yīng)及時報告指導(dǎo)教師。 7實(shí)驗(yàn)完畢后，值日生值日。值日工作范圍包括：關(guān)閉水、電、門、窗；檢查儀器，顯微鏡是否完好；查看水池，實(shí)驗(yàn)臺，桌椅，地面是否干凈整齊；最后在值日生記錄本上登記值日情況，再交于老師簽字后方可離開。,考核辦法,實(shí)驗(yàn)習(xí)慣10： 遲到1次扣1分，曠課一次扣3分，值日生必須最后走，早走者扣1分。 預(yù)習(xí)報告10%： 不能簡單抄書，要學(xué)會總結(jié)歸納。 實(shí)驗(yàn)報告20： 當(dāng)堂繪圖，當(dāng)堂交報告，遲交報告者要扣分。 實(shí)驗(yàn)操作30%： 要能獨(dú)立完成實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須交老師檢查；出現(xiàn)重大失誤者要扣分 實(shí)驗(yàn)考試成績30： 操作10%，筆試20% 遲到、早退、缺一次實(shí)驗(yàn)以上者或考試不及格者均不能得優(yōu)秀，缺兩次實(shí)驗(yàn)的不能得良好，缺該課程1/3以上者或不參加實(shí)驗(yàn)考試者，均沒有實(shí)驗(yàn)成績。,實(shí)驗(yàn)報告的書寫格式：,（1）實(shí)驗(yàn)名稱 （2）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?（3）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及步驟 （4）實(shí)驗(yàn)結(jié)果,實(shí)驗(yàn)一 高效液相色譜法測定 甲硝唑的含量,高效液相色譜儀的主要結(jié)構(gòu)及功能簡介,1.高壓輸液泵 2.進(jìn)樣器 3.高效分離柱 4.液相色譜檢測器 5.記錄儀,(1) 高壓輸液泵,主要部件之一，壓力：150350105 Pa。 注意排氣泡：purge 流速設(shè)置,（2）進(jìn)樣器,樣品液吸取方法：上下反復(fù)抽取液體，速度稍快，直到肉眼看不見氣泡為止，水平持進(jìn)樣針（液體吸取數(shù)量可多余20L），注入進(jìn)樣器。 進(jìn)樣器存在的兩個位置：load（右上）和inject。,(2) 高效分離柱,柱體為直型不銹鋼管，C18柱標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)徑及柱長為4.6*150mm或4.6*250mm，填料顆粒粒度5m。 色譜柱pH值范圍不同：酸性柱、堿性柱、中性柱。 安裝方向 柱溫箱：保持溫度穩(wěn)定。,(3) 液相色譜檢測器,a.紫外檢測器 b.光電二極管陣列檢測器 c.示差折光檢測器 d.熒光檢測器 e.電導(dǎo)檢測器,紫外檢測器,紫外檢測器對占物質(zhì)總數(shù)約80%的物質(zhì)（有機(jī)和部分無機(jī)物質(zhì)）均可檢測，既可測190-350 nm范圍的光吸收變化，也可向可見光范圍350-700 nm 延伸。 優(yōu)點(diǎn)：應(yīng)用最廣，靈敏度高，線性范圍寬。是高效液相色譜儀的標(biāo)準(zhǔn)配置。它的最重要特征是對流動相的流速（脈沖）和溫度變化不敏感，可用于梯度洗脫。 缺點(diǎn)：對無紫外吸收的組分不響應(yīng)，而對紫外吸收較大的溶劑如苯不能作流動相使用。,高效液相色譜的主要分離方法,液相色譜根據(jù)固定相性質(zhì)可分為以下幾種： 吸附色譜 (Adsorption Chromatography) 鍵合相色譜（Bonded phase chromatography） 離子交換色譜（Ion Exchanger Chromatogr.） 空間排阻色譜（Size Exclusion Chromatogr.） 親合色譜（Affinity Chromatography）,在以上五種分離方式中，反相鍵合相色譜應(yīng)用最廣，因?yàn)樗捎么妓螂嫠w系作流動相。純水易得廉價，它的紫外吸收極小。在純水中添加各種物質(zhì)可改變流動相選擇性。使用最廣的反相鍵合相是十八烷基鍵合相，即讓十八烷基（C18H37）鍵合到硅膠表面。這種鍵合相又稱ODS（Octadecylsilyl）鍵合相，如國外的partisil5-ODS、Zorbax-ODS、Shim-pack CLC-ODS，國產(chǎn)的YWG-C18等。,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?熟悉高效液相色譜儀主要結(jié)構(gòu)組成及功能； 了解反相色譜法的原理、優(yōu)點(diǎn)和應(yīng)用。 了解流動相的選擇依據(jù)及配制方法； 掌握高效液相色譜法進(jìn)行定性和定量分析的基 本方法。,實(shí)驗(yàn)原理,高效液相色譜法是采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱進(jìn)行分離測定的色譜方法。注入的供試品，由流動相帶入柱內(nèi)，各成分在柱內(nèi)被分離，并依次進(jìn)入檢測器，由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號。本實(shí)驗(yàn)以甲硝唑?yàn)闇y定對象，以反相HPLC來分離檢測未知樣中甲硝唑的含量。以甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的色譜峰面積對其濃度進(jìn)行線性回歸，再根據(jù)樣品中甲硝唑的峰面積，由線性方程計算其濃度。,實(shí)驗(yàn)器材與材料,實(shí)驗(yàn)器材：高效液相色譜儀、精密天平、50ml燒杯、玻璃棒、稱量紙、10ml容量瓶、50ml容量瓶、注射器、洗瓶、EP管、濾膜。 實(shí)驗(yàn)材料：甲硝唑原料、蒸餾水、HCl、乙腈、三氟乙酸、超純水。 0.1M HCl溶液配制：準(zhǔn)確量取HCl溶液 8.3ml,用蒸餾水定容至1000ml，即得。,實(shí)驗(yàn)步驟,色譜操作條件; 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制； 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立； 樣品溶液的配制； 甲硝唑樣品含量測定。,色譜柱：C18柱（1504.6mm,5m）； 流動相：乙腈：0.02%三氟乙酸水溶液（20：80） 流速：1mL/min 檢測波長：277nm 柱溫：35 進(jìn)樣量：20L,1.色譜操作條件：,2. 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制,精密稱取在105條件下干燥至恒重的甲硝唑?qū)φ掌?0mg，置于50mL容量瓶中，用0.1M HCl溶液溶解并定容至刻度，即得濃度為0.2mg/mL的甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)儲備液，備用。,3、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立,精密量取甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別為0.3ml、0.5ml、0.7ml、0.9ml、1.1ml置于10ml的容量瓶中，然后用0.1M HCl溶液定容至刻度，得到濃度梯度為6g/mL、10g/mL、14g/mL、18g/mL和22g/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別過0.22m的微孔濾膜過濾，濾液置于1.5ml的EP管中并標(biāo)號，各進(jìn)樣20L檢測，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。,線性要求：,色譜峰分離度大于1.5，濃度點(diǎn)n5。用濃度c對峰面積A作線性回歸處理，得一直線方程，r應(yīng)大于0.999，方程的截距應(yīng)近于零。,4. 樣品溶液的配制,精密稱取甲硝唑原料藥10mg，置于50ml容量瓶中，用0.1M HCl溶液溶解并定容至刻度，搖勻，再從中取出0.7ml定容至10ml，即得甲硝唑樣品溶液。,5.甲硝唑樣品含量測