細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ).ppt

第二章 細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ),山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)（cell and tissue culture）是動(dòng)物細(xì)胞工程的重要技術(shù)基礎(chǔ)。 動(dòng)物的細(xì)胞與組織培養(yǎng)是指從活的機(jī)體中取出組織或細(xì)胞，模擬機(jī)體內(nèi)生理?xiàng)l件，在體外建立無菌、適溫和一定營養(yǎng)條件等，使之生長和生存，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)。,組織培養(yǎng)的概念 組織培養(yǎng)這一名詞實(shí)際上是一個(gè)通用名詞，習(xí)慣上泛指所有的體外培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)物的不同可概括為三個(gè)不同概念：細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和器官培養(yǎng)。,A：細(xì)胞培養(yǎng)：將組織塊用機(jī)械方法或酶解法分離成單個(gè)細(xì)胞，做成細(xì)胞懸液，再培養(yǎng)于固體基質(zhì)上，成單層細(xì)胞生長，或在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)培養(yǎng)的技術(shù)稱為細(xì)胞培養(yǎng)。,B：組織培養(yǎng)：將活體的一小片組織放在盛有培養(yǎng)液的玻璃或塑料培養(yǎng)器皿中，待組織塊粘著后，沿底面平面移動(dòng)生長的過程稱為組織培養(yǎng)。 從組織塊中生長出來的仍然是細(xì)胞，細(xì)胞在生長的同時(shí)也發(fā)生移動(dòng)，至使組織培養(yǎng)難以長時(shí)間維持其原有結(jié)構(gòu)，結(jié)果也就成了細(xì)胞培養(yǎng)。,C：器官培養(yǎng)：是指采取某些措施使器官的原基、器官的一部分或整個(gè)器官在體外存活、生長，并保持其原有結(jié)構(gòu)和功能的培養(yǎng)技術(shù)。,體外培養(yǎng)的種類,二、 細(xì)胞培養(yǎng)的現(xiàn)實(shí)意義,生物技術(shù)上：生產(chǎn)各種生技術(shù)產(chǎn)品如：狂犬病、小兒麻痹 癥等病毒疫苗，表皮生長因子及干擾素、白 細(xì)胞介素等生長因子及單克隆抗體等。 科學(xué)研究上：在病毒學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)等方面。 臨床醫(yī)學(xué)上：胎兒的遺傳性疾病分析，藥物篩選及某些疾 病的治療等,三、細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn),1.研究的對(duì)象是活細(xì)胞 在實(shí)驗(yàn)過程中，根據(jù)要求可始終保持細(xì)胞活力，并可長時(shí)間監(jiān)控、檢測甚至定量評(píng)估一部分活細(xì)胞的情況，包括活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動(dòng)等。,2. 研究條件可以人為控制 可以根據(jù)需要，控制包括pH、溫度、氧氣、二氧化碳、張力等物理化學(xué)的條件，同時(shí)，可以施加化學(xué)、物理、生物等因素作為條件而進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察，這些因素同樣可以處于嚴(yán)格控制之下。,3. 研究的樣本可以達(dá)到比較均一性 通過細(xì)胞培養(yǎng)一定代數(shù)后，所得到的細(xì)胞系則可以達(dá)到均一性而屬于同一類型的細(xì)胞，需要時(shí)，可采用克隆化等方法使細(xì)胞達(dá)到純化。,4. 研究內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄 采用各種研究技術(shù)、記錄方法： 研究: 倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、流 式細(xì)胞術(shù)、激光共焦顯微鏡、免疫組織化學(xué)、原 位雜交、同位素標(biāo)記- 記錄: 攝影照片、縮時(shí)電影、電視-,5.研究的范圍比較廣泛 學(xué)科多： 細(xì)胞學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等 對(duì)象廣： 各種動(dòng)物：低等動(dòng)物-高等動(dòng)物-人類 一種動(dòng)物：不同年齡- 不同組織- 正?；虍惓＃[瘤-）,6.研究的費(fèi)用相對(duì)較經(jīng)濟(jì) 可提供大量、同一時(shí)期、重復(fù)性好的、生物學(xué)性狀相似的實(shí)驗(yàn)對(duì)象,四、細(xì)胞培養(yǎng)的缺點(diǎn),現(xiàn)人工模擬體內(nèi)環(huán)境的技術(shù)已經(jīng)很高, 但, 人工所模擬的條件與體內(nèi)實(shí)際情況 仍不完全相同. 當(dāng)細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后, 生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡的環(huán)境中, 久了，必然發(fā)生變化.,因此，對(duì)于體外培養(yǎng)的細(xì)胞，應(yīng)該把他們視作一種既能保持動(dòng)物體內(nèi)原細(xì)胞一定的性狀、結(jié)構(gòu)和功能又具有某些改變的特定的細(xì)胞群體，而不能將之與體內(nèi)的細(xì)胞完全等同。,五、細(xì)胞培養(yǎng)的工作原則,有標(biāo)準(zhǔn)化的工作方法 培養(yǎng)用的液體極多（如培養(yǎng)液、胰蛋白酶、HANKS液及 抗菌素等），應(yīng)由專人負(fù)責(zé)，并保證做到按規(guī)程行事，配制濃度準(zhǔn)確，滅菌可靠，所有配好的溶液瓶上都要標(biāo)明名稱、濃度、消毒與否和制備日期等。 一切培養(yǎng)用品都要有固定的存放點(diǎn)，避免雜亂無章，其中尤其重要的是：培養(yǎng)用品與非培養(yǎng)用品應(yīng)嚴(yán)格分開，已消毒品與未消毒品應(yīng)分別存放。,第二節(jié) 組織培養(yǎng)的細(xì)胞生物學(xué),一、體內(nèi)外細(xì)胞的差異和分化,（一）體內(nèi)外細(xì)胞的差異 培養(yǎng)細(xì)胞最多見的表現(xiàn)是：失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)，分化減弱或不顯，出現(xiàn)類似“反祖” 現(xiàn)象；表現(xiàn)為細(xì)胞趨單一化，或獲得不死性，或變成具有惡性性狀的細(xì)胞群。,1.與體內(nèi)主要不同 相對(duì)孤立、相對(duì)單一 缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié) 和細(xì)胞相互間的影響,2.主要表現(xiàn) 失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài) 分化減弱或不顯 細(xì)胞趨向單一化； 3.提示 要正確認(rèn)識(shí)體外培養(yǎng)細(xì)胞 是一種特定條件下生長的細(xì)胞群體。,二、培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)分類,體外細(xì)胞培養(yǎng)物的生長類型,按生長方式:2型 粘附型細(xì)胞:附著在某一固相支持物表面才能生長的細(xì)胞。 懸浮型細(xì)胞:不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長的細(xì)胞。 絕大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞屬粘附型細(xì)胞，只有少數(shù)細(xì)胞類型如某些腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞可在懸浮狀態(tài)下生長。,貼附(粘附)型細(xì)胞,粘附:是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi) 生存和生長發(fā)育的基本存在方式 含義 兩方面 結(jié)果 基于粘附特性，使細(xì)胞與細(xì)胞之間相互結(jié)合形成組織， 有機(jī)體的絕大多數(shù)細(xì)胞必須 粘附于一固相表面 才能生存和生長。,培養(yǎng)時(shí)：這些細(xì)胞被放到體外環(huán)境中以后,同樣需要粘附于某一固相表面才能生存和生長，因而屬于粘附型細(xì)胞。 粘附(錨定或錨著)依賴型(性)細(xì)胞：唯有粘附于固相表面才能生存的細(xì)胞,類型 細(xì)胞在體內(nèi)、外的粘附方式：存在差異 體內(nèi)：粘附是全方位 外形具有復(fù)雜的立體特征 體外：多數(shù)情況，細(xì)胞只有一個(gè)附著平面 外形一般與體內(nèi)時(shí)明顯不同 按照培養(yǎng)細(xì)胞粘附生長時(shí)的主要形態(tài)，可分為幾大類型,分類 根據(jù)形態(tài)大致的不同，主要2類： 上皮細(xì)胞型 成纖維細(xì)胞型 其它，不定型,上皮細(xì)胞型,名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實(shí)際上不完全等于- 來源：來源于外胚層，內(nèi)胚層細(xì)胞 如：皮膚及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡 上皮性腫瘤 形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞 扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核,生長特點(diǎn) 易相連成片 相靠緊密相連成薄層 鋪石狀 生長時(shí)呈膜狀移動(dòng) 很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng),體外培養(yǎng)細(xì)胞類型（1）上皮細(xì)胞型,成纖維細(xì)胞型,名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的 來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織 如：真正的成纖維細(xì)胞 心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，血管內(nèi)皮 形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài) 胞體梭形或不規(guī)則三角形 胞質(zhì)向外伸出23個(gè)長短不等的突起 中有卵圓形核,生長特點(diǎn) 排列成放射狀，漩渦狀 并不緊靠連成片， 細(xì)胞細(xì)胞接觸易斷開而 單獨(dú)行動(dòng) 游離的單獨(dú)的成纖維樣細(xì)胞， 常有幾個(gè)伸長的細(xì)胞突起,體外培養(yǎng)細(xì)胞類型（2）成纖維細(xì)胞型,貼附生長型-類型,1. 與體內(nèi)同名的細(xì)胞不完全相同 如：形態(tài)相似的成纖維細(xì)胞，可不同來源 自同一動(dòng)物不同組織的成纖維樣細(xì)胞相似但 發(fā)展趨向不同 2. 培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)不穩(wěn)定 條件改變，細(xì)胞形態(tài)可有變化,培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)不穩(wěn)定 血清 Hela 高血清 低血清 成纖維細(xì)胞樣 上皮樣細(xì)胞 pH Hela 太酸或太堿 標(biāo)準(zhǔn)pH 成纖維細(xì)胞樣 上皮樣細(xì)胞 細(xì)胞密度 3T3 低密度 高密度 成纖維細(xì)胞樣 上皮樣細(xì)胞 生長狀態(tài)改變 懸浮或貼附 懸浮 貼附 圓形 成纖維或上皮樣 轉(zhuǎn)化與否 未轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化后 成纖維樣 可成上皮樣,懸浮生長型,概念 培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長 或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長 來源 自血，脾或骨髓， 尤以血中白細(xì)胞 癌腫細(xì)胞也可能 特點(diǎn) 在懸浮中生長良好 細(xì)胞圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán),優(yōu)點(diǎn) 生存空間大，提供數(shù)量大 傳代方便(不需消化) 易于收獲 可獲得穩(wěn)定狀態(tài) 缺點(diǎn) 觀察不方便 很多細(xì)胞不能懸浮生長(尤以正常細(xì)胞),三、培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點(diǎn),（一）貼附,（二）接觸抑制,（三）密度抑制,四、培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程,（一）組織培養(yǎng)細(xì)胞生命期(Life Span of Culture Cells),所謂培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長 的時(shí)間。包括原代培養(yǎng)期、傳代培養(yǎng)期及衰退期。,正常培養(yǎng)的細(xì)胞周期,原代培養(yǎng)(Primary Culture)期,也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一 次傳代階段，一般持續(xù)1-4周。,特點(diǎn)：細(xì)胞呈活躍移動(dòng)，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。與 體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上相似性大。,傳代期,特點(diǎn)：在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長，細(xì)胞增殖旺 盛，并能維持二倍體核型。,傳代：體內(nèi)細(xì)胞生長在動(dòng)態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間和營養(yǎng)是有限的。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要分離出一部分細(xì)胞和更新營養(yǎng)液，否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存，這一過程叫傳代。初代培養(yǎng)的細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系（Cell Line）。,衰退期 特點(diǎn)：此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖， 最后衰退凋亡。,（二）體外培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期,潛伏期 指數(shù)增生期 停滯期,所謂細(xì)胞的“一代”是指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時(shí)間。,（三）單個(gè)細(xì)胞的生長過程,五、體外培養(yǎng)細(xì)胞的遺傳學(xué)特征,（一）核型變化,（二）永生化和惡變,（三）細(xì)胞性別,六、體外培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境,（一）無污染環(huán)境,（二）溫度,（三）氣體環(huán)境和氫離子濃度,七、體外培養(yǎng)細(xì)胞生存所需基本物質(zhì),（一）糖,（二）氨基酸,（三）維生素,（四）促生長因子,（五）其它物質(zhì),第三節(jié) 建立細(xì)胞系或細(xì)胞株,一、體外培養(yǎng)細(xì)胞的種類和命名,（一）初代培養(yǎng) 初代培養(yǎng)又稱原代培養(yǎng)，即直接從體內(nèi)取出的細(xì)胞、 組織和器官進(jìn)行的第一次的培養(yǎng)物。一旦已進(jìn)行傳代 培養(yǎng)(5ubculture)的細(xì)胞，便不再稱為初代培養(yǎng)，而改 稱為細(xì)胞系。,（二）細(xì)胞系 初代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞，即稱之為細(xì)胞系。,有限細(xì)胞系 無限細(xì)胞系,(三)克隆細(xì)胞株 從一個(gè)經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng) 或通過篩選購方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群，稱細(xì) 胞株。,(四)二倍體細(xì)胞 培養(yǎng)細(xì)胞染色體數(shù)目具有與原供體二倍細(xì)胞染色體數(shù) 相同或基本相同(2n細(xì)胞占75或80以上)的細(xì)胞群， 稱二倍體細(xì)胞培養(yǎng)。二倍體細(xì)胞在正常情況下具有限 生命期，故屬有限細(xì)胞系。,(五)腫瘤細(xì)胞系或株,是現(xiàn)有細(xì)胞系中最多的一類，我國已建立細(xì)胞系主要為這類細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞系多由癌瘤建成，多呈上皮細(xì)胞型，常已傳幾十代或百代以上，并并具有不死性和異體接種致瘤性。,對(duì)已建成的各種細(xì)胞系或細(xì)胞株習(xí)慣上都給以名稱；細(xì)胞的命名無嚴(yán)格統(tǒng)一規(guī)定，大多采用有一定意義縮寫字或代號(hào)表示。但不論什么形式，均不宜太長，以便記憶和了解，今列舉以下幾種代表性的細(xì)胞名稱供參考； HeLa：為供體患者的性名(來源于宮頸癌) CHO：中國地鼠卵巢細(xì)胞(Chinese Hamster Ovary) 宮743：富頸癌上皮細(xì)胞，1974年3月建立 NIH3T3；美國國立衛(wèi)生研究所(National Institute of Health)建立, 每3天傳代一次，每次接種3106細(xì)胞毫升。,（六）細(xì)胞系或細(xì)胞株的命名,二、建立細(xì)胞系（或株）的要求,（一）組織來源 （二）細(xì)胞生物學(xué)檢測 （三）培養(yǎng)條件和方法,三、已建立細(xì)胞系或株的簽定、管理和使用,培 養(yǎng) 簡 歷：組織來源日期、物種、組織起源、性別、年齡、 供體正?；虍惓＝】禒顟B(tài)、細(xì)胞已