蛋白質(zhì)核磁脈沖序列分析.ppt

蛋白質(zhì)核磁脈沖序列分析,阮科 ,生物大分子波譜學(xué)原理 吳季輝,脈沖序列基本原則,1、平衡態(tài)密度算符：SgIIZ，如15N標(biāo)記蛋白，gHHZ+gNNZ 2、Delay時(shí)期，Hamilton算符為wIIZ + wSSZ + pJIzSz(兩核體系），多核體系包括所有的化學(xué)位移算符和可能的J耦合算符 3、短的硬脈沖，一般只考慮脈沖所起的作用（90，180)，忽略化學(xué)位移和J演化 4、大多成形脈沖可以近似為90/180脈沖 5、Ix/y/zIx/y/z? Ix/y/zIx/y/zSx/y/z?,生物大分子波譜學(xué)原理 吳季輝,Ix,Iy,Iz,Ix,IySz,IzSz,脈沖序列分析基本思路,1、乘積算符 基本單元：自旋回波，INEPT, COSY, TOCSY，NOESY 2、相干傳遞途徑 從0開始，-1接收 自由進(jìn)動(dòng)時(shí)相干階不變，只有脈沖才能改變相干階 相干傳遞途徑只畫出想要的途徑 3、相位循環(huán) 脈沖相位變化f，則相干階Dp經(jīng)歷的相位變化為-fDp，即接收相位變化。 若相位循環(huán)為360/N，Dp為想要的相干階變化，則Dp+nN （n=-3,-2-1,0,1,2,3)也被選擇，其它被抑制,生物大分子波譜學(xué)原理 吳季輝,t1,t2,t1,-t2,脈沖序列分析基本思路,4、梯度場(chǎng) 可作為z向的脈沖處理 Gz 180 Gz：完善180度脈沖 乘積算符z向后，+強(qiáng)梯度：除去所有的非z向相干階 梯度選擇Gz/gS RevINEPT Gz/gI： 5、間接維正交檢波 States, TPPI，States-TPPI,生物大分子波譜學(xué)原理 吳季輝,/ref_info/statful.htm#1,第六章 同核核磁實(shí)驗(yàn)方法,COSY型實(shí)驗(yàn) 多量子譜 TOCSY NOESY ROESY,生物大分子波譜學(xué)原理 吳季輝,同核核磁譜,生物大分子波譜學(xué)原理 吳季輝,同核核磁譜,在記錄二維譜或三維譜等之前均需要記錄一維氫譜，通常蛋白質(zhì)溶于水或適當(dāng)?shù)木彌_液，加5-10%的D2O作為鎖場(chǎng)介質(zhì)。一維氫譜可用于檢查樣品是否有足夠濃度，通常1632次采樣要能得到足夠信噪比的譜圖，甲基由于快速旋轉(zhuǎn)呈現(xiàn)窄峰，而酰胺質(zhì)子由于化學(xué)交換及14N的標(biāo)量弛豫呈現(xiàn)寬峰； 一維氫譜還可用于檢查樣品的共振峰寬是否合理，蛋白質(zhì)在高濃度下容易聚集從而增寬譜線，嚴(yán)重時(shí)甚至1H譜上看不到明顯的峰，樣品在這種條件下顯然無(wú)法進(jìn)行核磁研究；一維氫譜還可用于判別樣品的化學(xué)位移分布情況，可判別樣品是否變性，同時(shí)也對(duì)研究工作的難度提供一些預(yù)測(cè)。 蛋白質(zhì)的一維氫譜一般不應(yīng)該有非常尖的峰，若出現(xiàn)這種峰，往往是殘留的小分子雜質(zhì)，當(dāng)然蛋白質(zhì)的末端及l(fā)oop區(qū)由于分子運(yùn)動(dòng)較快也會(huì)出現(xiàn)一些較尖的峰。,生物大分子波譜學(xué)原理 吳季輝,當(dāng)樣品條件不佳時(shí)，一維譜（以及若干信號(hào)強(qiáng)的二維譜如1H-15N HSQC）可用來(lái)探索適合的樣品條件。,生物大分子波譜學(xué)原理 吳季輝,ubiquitin（一種蛋白質(zhì)，76個(gè)殘基）的一維譜：a 水溶液中，b 箭頭所指甲基區(qū)的放大，c 8M尿素溶液中，顯示變性譜。,生物大分子波譜學(xué)原理 吳季輝,生物大分子波譜學(xué)原理 吳季輝,生物大分子波譜學(xué)原理 吳季輝,生物大分子波譜學(xué)原理 吳季輝,COSY型實(shí)驗(yàn),COSY COSY的變型 Relayed COSY 多量子濾波COSY E-COSY,生物大分子波譜學(xué)原理 吳季輝,COSY,生物大分子波譜學(xué)原理 吳季輝,COSY(correlated spectroscopy),是人們發(fā)明的第一種二維譜，同時(shí)也是研究蛋白質(zhì)的最有用的二維譜之一。二個(gè)有J偶合的核在COSY上可產(chǎn)生一個(gè)交叉峰，由于蛋白質(zhì)（包括多數(shù)其他有機(jī)物）中有J偶合意味著這兩個(gè)核最多通過(guò)3個(gè)共價(jià)鍵連接，所以COSY譜對(duì)于分子結(jié)構(gòu)的拓?fù)溥B接可提供非常有價(jià)值的信息。,COSY,生物大分子波譜學(xué)原理 吳季輝,COSY：脈沖序列分析,生物大分子波譜學(xué)原理 吳季輝,第一項(xiàng)為縱向磁化，第二項(xiàng)為多量子項(xiàng)，均不能被觀測(cè)到； 第三項(xiàng)仍然是第一核的橫向磁化，在檢測(cè)期的頻率同演化期類似，均是第一核的，對(duì)應(yīng)于對(duì)角峰； 第四項(xiàng)是第二核的反向磁化，在檢測(cè)期的頻率為第二核的化學(xué)位移，與演化期不同，對(duì)應(yīng)于交叉峰，這是二維譜最有意義的峰。,COSY：脈沖序列分析,生物大分子波譜學(xué)原理 吳季輝,COSY,生物大分子波譜學(xué)原理 吳季輝,COSY的交叉峰為反相峰，這一點(diǎn)非常重要，決定了COSY型實(shí)驗(yàn)采樣及處理時(shí)需要注意的問(wèn)題。而交叉峰與對(duì)角峰在相位相差90度，對(duì)于譜圖在對(duì)角線附近的質(zhì)量有重要的影響。,COSY,生物大分子波譜學(xué)原理 吳季輝,F 應(yīng)用 在高場(chǎng)區(qū)由于化學(xué)位移的簡(jiǎn)并，譜峰的重疊，對(duì)角峰的干擾，通常不容易由COSY辨認(rèn)整個(gè)自旋系統(tǒng)，在蛋白質(zhì)COSY特別有用處是用于檢查所謂的指紋區(qū)特別是酰胺質(zhì)子與質(zhì)子的交叉峰。在這個(gè)區(qū)域，脯氨酸由于沒(méi)有氨基沒(méi)有交叉峰；甘氨酸有兩個(gè)質(zhì)子故有兩個(gè)交叉峰（除非兩者的化學(xué)位移相同）；N端殘基上的NH由于與水交換快也沒(méi)有交叉峰。除特殊情況外，對(duì)于不大的蛋白質(zhì)，所有的峰都應(yīng)該能找到。,COSY的變型,生物大分子波譜學(xué)原理 吳季輝,1. COSY- 第二個(gè)90度脈沖用小于90度的脈沖代替，其結(jié)果是： 交叉峰被減弱 多核體系中被動(dòng)偶合產(chǎn)生的某些交叉峰被減弱，導(dǎo)致精細(xì)結(jié)構(gòu)的變化，起到簡(jiǎn)化圖譜的作用,COSY的變型,生物大分子波譜學(xué)原理 吳季輝,COSY的變型,生物大分子波譜學(xué)原理 吳季輝,COSY的變型,生物大分子波譜學(xué)原理 吳季輝,2 pre-TOCSY COSY 預(yù)飽和同時(shí)抑制接近水峰的H信號(hào)，因而從H到其他質(zhì)子特別是NH的交叉峰減弱甚至消失，而NH到H的交叉峰往往淹沒(méi)在水峰產(chǎn)生的t1噪聲中。在pre-TOCSY COSY中，在COSY序列前插入一個(gè)短時(shí)間的TOCSY混合脈沖，使其他質(zhì)子的信號(hào)先傳遞給H，這樣可部分恢復(fù)H到其他質(zhì)子的信號(hào)。,COSY的變型,生物大分子波譜學(xué)原理 吳季輝,2QF-COSY,生物大分子波譜學(xué)原理 吳季輝,2QF-COSY,生物大分子波譜學(xué)原理 吳季輝,2QF-COSY,生物大分子波譜學(xué)原理 吳季輝,3，4項(xiàng)為交叉峰，二維均是反相裂分，被動(dòng)偶合呈同相裂分； 1，2項(xiàng)是對(duì)角峰，二維均是反相裂分，被動(dòng)偶合呈同相裂分； 這兩個(gè)對(duì)角峰的相位與交叉峰相同； 第5項(xiàng)也是對(duì)角峰，在兩維均是反相峰（兩個(gè)J偶合的作用均是反相），但相位與其他峰相差90度，在交叉峰調(diào)成吸收型時(shí)，這峰呈色散型，不過(guò)由于是反相峰，有部分相互抵銷，其拖尾延伸不遠(yuǎn)，影響遠(yuǎn)不如普通COSY。 結(jié)論：即使在三核體系，對(duì)角峰有色散成分，對(duì)交叉峰的影響也不大,2QF-COSY,生物大分子波譜學(xué)原理 吳季輝,2QF-COSY,生物大分子波譜學(xué)原理 吳季輝,3QF-COSY,生物大分子波譜學(xué)原理 吳季輝,類似地可以記錄三量子濾波COSY。至少三核體系才能產(chǎn)生三量子信號(hào)，要注意其交叉峰在兩維對(duì)兩個(gè)J偶合均呈反相峰即雙反相峰，這同