課件：基因治療現(xiàn)狀研究生.ppt

基因治療,Gene Therapy,第一節(jié) 基因治療概念,經(jīng)典的基因治療：指正常的基因整合入細(xì)胞基因組以校正或置換致病基因的一種治療方法。 廣義的基因治療：將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，以達(dá)到治療疾病目的的方法。 目前基因治療：凡是采用分子生物學(xué)的方法和原理，在核酸水平上開展的疾病治療方法都可以稱為基因治療。,基因治療分類,體細(xì)胞(somatic cell)基因治療 生殖細(xì)胞(germline)基因治療,只限于某一體細(xì)胞的基因的改變 只限于某個(gè)體的當(dāng)代 對(duì)缺陷的生殖細(xì)胞進(jìn)行矯正 當(dāng)代及子代,1973年第一例人體實(shí)驗(yàn) 1978年第二例基因治療實(shí)驗(yàn) 基因治療動(dòng)物實(shí)驗(yàn)廣泛開展 Dr. Anderson（1980） 首先闡明基因治療前景和發(fā)展方向 Rosenberg （1990） 利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因?qū)肽[瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL），并將TIF輸回體內(nèi)，TIF集中在腫瘤部位， 表達(dá)neoR。,1990年9月14日：第一例正式批準(zhǔn)的基因治療實(shí)驗(yàn)開始進(jìn)行 （美國(guó)，世界上開展基因治療最早的國(guó)家） 大規(guī)模進(jìn)行基因治療臨床實(shí)驗(yàn)必須經(jīng)歷以下階段： 體外試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn) I期臨床試驗(yàn)6-10名志愿者 II期臨床試驗(yàn)20-30名志愿者 III期臨床試驗(yàn)充分分析療效、安全性 中國(guó) 1991年7月開始進(jìn)行基因治療試驗(yàn),基因治療的策略,The Strategy of Gene Therapy,基因治療的策略大致可分為以下幾種,基因置換 gene replacement 基因修復(fù) gene correction 基因修飾 gene augmentation 基因干預(yù) gene inactivation 自殺基因治療 suicide gene therapy 基因免疫治療 immune adjustment 其他,（一）基因置換（gene replacement）,定義：將特定的目的基因?qū)胩囟?xì)胞，通過(guò)定位重組，以導(dǎo)入的正?；蛑脫Q基因組內(nèi)原有的缺陷基因。,目的：將缺陷基因的異常序列進(jìn)行矯正。 對(duì)缺陷基因的缺陷部位進(jìn)行精確的原位修復(fù)，不涉及基因組的任何改變。,又稱為基因打靶(gene targeting） 定點(diǎn)整合的條件: 轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的載體與染色體上的DNA具有相同的序列。帶有目的基因的載體就能找到同源重組的位點(diǎn)，進(jìn)行部分基因序列的交換，使基因置換這一治療策略得以實(shí)現(xiàn)。,基因同源重組技術(shù) ,要實(shí)現(xiàn)基因置換，需要采用同源重組技術(shù)使相應(yīng)的正常基因定向?qū)胧荏w細(xì)胞的基因缺陷部位。,定向?qū)氲陌l(fā)生率約1/100萬(wàn)，采用胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的方法，這種同源重組的檢出率最高可達(dá)1/10。,基因置換必要條件：,1、對(duì)導(dǎo)入的基因及其產(chǎn)物有詳盡的了解 2、外來(lái)基因能有效地導(dǎo)入靶細(xì)胞 3、導(dǎo)入基因能在靶細(xì)胞中長(zhǎng)期穩(wěn)定存在 4、導(dǎo)入基因能有適度水平的表達(dá) 5、基因?qū)氲姆椒八幂d體對(duì)宿主細(xì)胞安全無(wú)害,（二） 基因修飾,基因添加或稱基因增補(bǔ)（gene augmentation）: 通過(guò)導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表達(dá)其本身不表達(dá)的基因。,類型: 在有缺陷基因的細(xì)胞中導(dǎo)入相應(yīng)的正?；?，而細(xì)胞內(nèi)的缺陷基因并未除去，通過(guò)導(dǎo)入正?；虻谋磉_(dá)產(chǎn)物，補(bǔ)償缺陷基因的功能； 向靶細(xì)胞中導(dǎo)入靶細(xì)胞本來(lái)不表達(dá)的基因，利用其表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到治療疾病的目的。,基因干預(yù)(gene interference) 指采用特定的方式抑制某個(gè)基因的表達(dá)，或者通過(guò)破壞某個(gè)基因而使之不表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。,反義核酸： 封閉基因表達(dá) 核酶： 裂解特異的靶mRNA RNA干涉技術(shù)：,（三）基因干預(yù),（四）自殺基因治療 自殺基因治療(suicide gene therapy) 自殺基因治療:惡性腫瘤基因治療的主要方法之一。 原理:將“自殺”基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，這種基因編碼的酶能使無(wú)毒性的藥物前體在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性代謝物，誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生“自殺”效應(yīng)，從而達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的目的。,自殺基因的作用機(jī)制,TK/GCV 單純皰疹病毒（herps simplex virus, HSV）型胸苷激酶（thymidine kinase, tk）基因編碼胸苷激酶，特異性地將無(wú)毒的核苷類似物丙氧鳥苷（ganciclovir, GCV）轉(zhuǎn)變成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。,CD/5-FC 大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶（cytosine deaminase, CD）基因，在細(xì)胞內(nèi)將無(wú)毒性5-氟胞嘧啶（5-FC）轉(zhuǎn)變成毒性產(chǎn)物5-氟尿嘧啶（5-FU）。,1.自殺基因系統(tǒng),5-氟尿嘧啶通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制胸苷酸合酶的活性，從而抑制脫氧胸苷三磷酸的合成。,旁觀者效應(yīng):“自殺基因”治療不僅使轉(zhuǎn)導(dǎo)了“自殺基因”的腫瘤細(xì)胞在用藥后被殺死，而且與其相鄰的未轉(zhuǎn)導(dǎo)“自殺基因”的腫瘤細(xì)胞也被殺死。,2. 旁觀者效應(yīng),（五）基因免疫治療 immune adjustment,通過(guò)將抗癌免疫增強(qiáng)細(xì)胞因子或MHC基因?qū)肽[瘤組織，以增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中的抗癌免疫反應(yīng)。,第二節(jié) 基因治療的必要條件 ,1、發(fā)病機(jī)制在DNA水平上已經(jīng)清楚； 2、要轉(zhuǎn)移的基因已經(jīng)克隆分離，其表達(dá)產(chǎn)物有詳盡的了解； 3、該基因正常表達(dá)的組織可在體外進(jìn)行遺傳操作；,1、外源基因可有效導(dǎo)入靶細(xì)胞 2、外源基因能在靶細(xì)胞中長(zhǎng)期穩(wěn)定存留 3、導(dǎo)入基因能適量表達(dá) 4、導(dǎo)入基因的方法及載體對(duì)宿主細(xì)胞安全無(wú)害,理想的基因治療還必須：,基因轉(zhuǎn)移技術(shù),The Technique of Gene Transfer,基因治療的兩種途徑,載體,目的基因,in vivo,ex vivo,靶細(xì)胞,基因治療途徑,1、間接體內(nèi)治療途徑（ex vivo） 是先從患者體內(nèi)取出某一器官組織的細(xì)胞，體外擴(kuò)增后，將目的基因轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞形成表達(dá)外源基因的遺傳修飾細(xì)胞，選擇高表達(dá)的細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)，以一定數(shù)量移植患者體內(nèi)。（安全、易控制但操作復(fù)雜） 2、直接體內(nèi)治療途徑（in vivo） 將目的基因體內(nèi)直接轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞，所用載體必須具有特異的導(dǎo)向性和轉(zhuǎn)移效率。（操作簡(jiǎn)單但療效短、免疫排斥等）,基因轉(zhuǎn)移(gene transfer)技術(shù)：,1.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。 2.非病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。,1.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng),病毒載體 介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移效率較高，因此它也是使用最多的基因治療載體。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有72%的臨床實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和71%的病例使用了病毒載體，其中用得最多的是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。,Retrovirus,（1）逆轉(zhuǎn)錄病毒,（1）兩端各有一長(zhǎng)末端重復(fù)序列LTR。,逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),（2）LTR由U3、R和U5三部分組成。,(1)在U3內(nèi)有增強(qiáng)子和啟動(dòng)子； (2)U3和U5兩端分別有病毒整合序列(IS) ； (3)在R內(nèi)還有poly(A)加尾信號(hào)。,（3）病毒有三個(gè)結(jié)構(gòu)基因,(1)gag基因，編碼核心蛋白及屬特異性抗原； (2)pol基因，編碼逆轉(zhuǎn)錄酶； (3)env基因，編碼病毒外殼或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。,（4）5端LTR下游有一段病毒包裝所必需的包裝信號(hào)序列（）及剪接供體位點(diǎn)(SD)和剪接受體位點(diǎn)(SA)。,逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),（5）含有負(fù)鏈DNA轉(zhuǎn)錄的引物結(jié)合位點(diǎn)(PBS)和正鏈DNA轉(zhuǎn)錄的引物結(jié)合位點(diǎn)(PPT)。,逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),構(gòu)成逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng) 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體由兩部分組成：,(1)保留病毒顆粒的包裝信號(hào)而缺失病毒蛋白基因,(2) 輔助細(xì)胞株(如PA317)：它由缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒感染構(gòu)建而成,Retroviral packaging system,LTR,gag,pol,env,LTR,Gag蛋白,PoL蛋白,Env蛋白,包裝細(xì)胞系,LTR,LTR,靶細(xì)胞,目的基因,標(biāo)記基因,LTR,LTR,目的基因,標(biāo)記基因,1,2,3,4,5,假病毒顆粒的產(chǎn)生并感染靶細(xì)胞,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,重組逆轉(zhuǎn)錄病毒 (核酸部分只能是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體),輔病毒,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點(diǎn), 逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜上由env編碼的糖蛋白，能夠被許多哺乳 動(dòng)物細(xì)胞膜上的特異性受體識(shí)別，從而使逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的遺傳物質(zhì)高效地進(jìn)入靶細(xì)胞。, 逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因gag、env和pol的缺失不影響其他部分的活性。, 前病毒可以高效整合至靶細(xì)胞基因組中，有利于外源基因在靶細(xì)胞中的永久表達(dá)。, 包裝好的假病毒顆粒（攜帶目的基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體）以芽生的方式分泌至輔助細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中，易于分離制備。,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的主要缺點(diǎn),隨機(jī)整合，有插入突變、激活癌基因的潛在危險(xiǎn)； 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的容量較小，只能容納7 kb以下的外源基因。,（2）腺病毒(adenovirus，AV)載體 腺病毒是一種大分子(36 kb)雙鏈無(wú)包膜DNA病毒。它通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中。 腺病毒是人類呼吸道感染的病原體，但目前尚未發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生有關(guān)聯(lián)。宿主細(xì)胞范圍廣，可感染分裂和非分裂終末分化細(xì)胞，如神經(jīng)元等。,腺病毒載體的優(yōu)點(diǎn),1.基因?qū)胄矢撸瑢?duì)人類安全；,2.宿主范圍廣；,3.基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞分裂無(wú)關(guān)；,4.重組腺病毒可通過(guò)口服經(jīng)腸道吸收、或噴霧吸入或氣管內(nèi)滴注；,5.腺病毒載體容量較大，可插入7.5 kb外源基因；,腺病毒載體缺點(diǎn),2.宿主的免疫反應(yīng)導(dǎo)致腺病毒載體表達(dá)短暫。,3.有兩個(gè)環(huán)節(jié)可能產(chǎn)生復(fù)制型腺病毒。,4.靶向性差。,1.不能整合到靶細(xì)胞的基因組DNA中。分裂增殖快的細(xì)胞，導(dǎo)入的重組病毒載體，隨分裂而丟失的機(jī)會(huì)增多，表達(dá)時(shí)間相對(duì)較短。,(1)腺病毒產(chǎn)生過(guò)程中與293輔助細(xì)胞內(nèi)E1區(qū)序列發(fā)生同源重組； (2)腺病毒載體與被治療的患者體內(nèi)已感染的野生型腺病毒，甚至乳頭瘤病毒、巨細(xì)胞病毒發(fā)生重組。,（3）腺病毒相關(guān)病毒載體 腺病毒相關(guān)病毒(adenovirus associated virus，AAV)是一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒。其基因組DNA小于5 kb，無(wú)包膜，外形為裸露的20面體顆粒。AAV不能獨(dú)立復(fù)制，只有在輔助病毒（如腺病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒）存在時(shí)，才能進(jìn)行復(fù)制和溶細(xì)胞性感染，否則只能建立溶源性潛伏感染。,Structure of AAV Virus Genomic DNA,REP:病毒復(fù)制基因, CAP:編碼衣殼蛋白的基因,AAV的特點(diǎn), 以潛伏感染為主； 病毒基因組與細(xì)胞共存； 只要宿主細(xì)胞正常，AAV基因表達(dá)就處于抑制而維持潛伏狀態(tài)； 若細(xì)胞受刺激，表達(dá)應(yīng)激基因，AAV基因表達(dá)從而使AAV病毒復(fù)制； 產(chǎn)生子代病毒并釋放，又感染新的細(xì)胞，建立新的潛伏狀態(tài)。,AAV載體是目前正在研究的一類新型安全載體，它對(duì)人類無(wú)致病性。 AAV可以高效定點(diǎn)整合至人19號(hào)染色體的特定區(qū)域19q13.4中，并能較穩(wěn)定地存在。這種靶向定點(diǎn)整合可以避免隨機(jī)整合可能帶來(lái)的抑癌基因失活和原癌基因激活的潛在危險(xiǎn)性，而且外源基因可以持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，并可受到周圍基因的調(diào)控，兼具逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體兩者的優(yōu)點(diǎn)。,AAV載體的缺陷：,2.非病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng) （1）脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使用方便、成本低 廉。 基本原理:利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，可以自動(dòng)形成包埋外源DNA的脂質(zhì)體，然后與細(xì)胞一起孵育，即可通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用將外源DNA（即目的基因）轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，并進(jìn)行表達(dá)。,脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移示意圖,脂質(zhì)體介導(dǎo)法缺點(diǎn)： 脂質(zhì)體介導(dǎo)進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，易被單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)選擇性吞噬、降解。,（2）受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù),將DNA與細(xì)胞或組織親和性的配體偶聯(lián)，可使DNA具有靶向性。這種偶聯(lián)通常通過(guò)多聚陽(yáng)離子（如多聚賴氨酸）來(lái)實(shí)現(xiàn)。多聚陽(yáng)離子與配體共價(jià)連接后，又通過(guò)電荷相互作用與帶負(fù)電荷的DNA結(jié)合，將DNA包圍，只留下配體暴露于表面。這樣形成的復(fù)合物可被帶有特異性受體的靶細(xì)胞吞飲，從而將外源DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞。,缺點(diǎn)：受體介導(dǎo)的DNA通常進(jìn)入細(xì)胞溶酶體內(nèi)被降解。,2019/9/1,51,可編輯,受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù)示意圖,（3）基因直接注射技術(shù) 不需要進(jìn)行基因工程的繁瑣操作，直接將裸露基因DNA注入動(dòng)物肌肉或某些器官組織內(nèi)。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：接受注射外源DNA的小鼠能夠按其基因編碼合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，并能維持?jǐn)?shù)月之久。 1.將促進(jìn)心臟血管生長(zhǎng)的基因直接注入實(shí)驗(yàn)鼠的心臟，可使其心臟壁內(nèi)毛細(xì)血管增加30%40%； 2.將胰島素基因直接注入鼠骨骼肌細(xì)胞，能分泌糖尿病所缺少的胰島素； 3.肌內(nèi)注射凝血因子基因，可產(chǎn)生血友病所需的凝血因子等等。,基因直接注射法的優(yōu)點(diǎn),1.制備具有調(diào)控部件的質(zhì)粒DNA重組體的技術(shù)較容易； 2.排除病毒載體可能潛在的致癌性或其他副作用； 3.導(dǎo)入的基因不需整合即可表達(dá)，避免了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入整合后，一旦發(fā)生副作用不易中止或逆轉(zhuǎn)的缺點(diǎn)； 4.基因直接注射法可反復(fù)使用，而病毒載體則可能誘導(dǎo)體內(nèi)免疫應(yīng)答，致使反復(fù)治療效果下降。,三、基因轉(zhuǎn)移的靶細(xì)胞,靶細(xì)胞的選擇須考慮： 1、容易取出和移植。血液系統(tǒng)的細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞； 2、細(xì)胞具有較長(zhǎng)的壽命 3、離體細(xì)胞較易受外源基因轉(zhuǎn)化 4、離體細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染和一定時(shí)間培養(yǎng)后再植回體內(nèi)，仍較易成活,體細(xì)胞,生殖細(xì)胞,目前常用的靶細(xì)胞有： 1、造血細(xì)胞 2、皮膚成纖維細(xì)胞 3、肝細(xì)胞 4、血管內(nèi)皮細(xì)胞 5、淋巴細(xì)胞 6、肌肉細(xì)胞 7、腫瘤細(xì)胞,基因干預(yù),Gene Interference,主要干擾特定細(xì)胞的mRNA 轉(zhuǎn)錄和翻譯,基因干預(yù)的種類：,1.反義RNA (antisense RNA) 2.干擾RNA (RNA interference) 3.核酶 (ribozyme),（一）反義RNA 1. 反義RNA與基因表達(dá)調(diào)控 利用反義RNA對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控，通常采用的方法有兩種： （1）體外合成反義RNA，直接作用于培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞吸收RNA后，發(fā)揮作用。 缺點(diǎn)：RNA易降解 （2）構(gòu)建能轉(zhuǎn)錄反義RNA的重組質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄出反義RNA而發(fā)揮作用 缺點(diǎn)：細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的反義RNA量不易控制,反義RNA的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題：,反義RNA進(jìn)入靶細(xì)胞前的降解問(wèn)題,專一性轉(zhuǎn)移問(wèn)題：如何解決某一組織、器官或系統(tǒng)中部分細(xì)胞病變進(jìn)行專一性轉(zhuǎn)移治療。,2.受體介導(dǎo)反義RNA轉(zhuǎn)移技術(shù),受體介導(dǎo)的RNA轉(zhuǎn)移十分專一，而且效率高； 被轉(zhuǎn)移的RNA是被保護(hù)的，與周圍環(huán)境之間存在多聚賴氨酸的保護(hù)層, 可以抵抗環(huán)境中的核酸酶的降解作用。,將脫唾液酸血清類粘蛋白（ASGP）與多聚賴氨酸（PL）共價(jià)連接，得到ASGP-PL復(fù)合物，成為運(yùn)載核酸的工具。ASGP-PL反義RNA復(fù)合物可以專一性地被肝細(xì)胞表面的ASGP受體所識(shí)別，并吞噬到肝細(xì)胞中，反義RNA進(jìn)入肝細(xì)胞后，可被逐漸釋放出來(lái)發(fā)揮作用。,借助受體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)移方法把DNA換成反義RNA，就可以實(shí)現(xiàn)受體介導(dǎo)的反義RNA的轉(zhuǎn)移。,3. 反義RNA的應(yīng)用前景,受體介導(dǎo)的反義RNA基因治療有其自身的優(yōu)點(diǎn)，而在 一定程度上補(bǔ)充了轉(zhuǎn)基因治療的不足。,（l）安全性高,（2）反義RNA設(shè)計(jì) 和制備方便,（3）具有劑量調(diào)節(jié)效應(yīng),（4）能直接作用于一些RNA病毒,反義RNA只作用于特異的mRNA分子，不改變所調(diào)節(jié)基因的結(jié)構(gòu)。反義RNA分子無(wú)論怎樣修飾，最終將在細(xì)胞內(nèi)部被降解，不留“殘?jiān)薄?在治療RNA病毒感染性疾病時(shí)，受體介導(dǎo)的反義RNA基因治療比一般的DNA基因治療有更大的優(yōu)勢(shì)。利用反義RNA可以直接作用于病毒RNA，阻斷RNA病毒的繁殖。,（二）RNA干擾,對(duì)RNA干擾的認(rèn)識(shí)來(lái)源于用線蟲（C. elegans）和果蠅所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，有義鏈RNA（sense RNA）或反義鏈RNA（antisense RNA）均能抑制線蟲基因的表達(dá)，雙鏈RNA比單鏈RNA更為有效。將特異的雙鏈RNA注入線蟲體內(nèi)可抑制有同源序列的基因的表達(dá)。得到的結(jié)果是有義鏈RNA和反義鏈RNA都同樣阻斷基因表達(dá)途徑。這與傳統(tǒng)上對(duì)反義RNA技術(shù)的解釋正好相反。而且其抑制基因表達(dá)的效率比反義RNA至少高2個(gè)數(shù)量級(jí)。,1.RNA干擾現(xiàn)象,RNA干擾（RNA interference， RNAi）是一種由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。在此過(guò)程中，與雙鏈RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，從而抑制該基因的表達(dá)。,2.RNA干擾的機(jī)制,RNA干擾過(guò)程主要有2個(gè)步驟：,（1）小干擾性RNA（siRNA）,（2）siRNA與細(xì)胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex, RISC)。,該復(fù)合體可識(shí)別與siRNA有同源序列的mRNA，并在特異的位點(diǎn)將該mRNA切斷。,長(zhǎng)雙鏈RNA被細(xì)胞內(nèi)的雙鏈RNA特異性核酸酶Dicer切成21-23個(gè)堿基對(duì)的短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA（small interfering RNA，siRNA）。,A. 賈第鞭毛蟲Dicer的晶體結(jié)構(gòu)； RNA干擾機(jī)制示意圖,1. 體外化學(xué)合成;,2. 用質(zhì)粒載體或病毒載體可在細(xì)胞內(nèi) 穩(wěn)定地生成。,siRNA的產(chǎn)生,3.RNA干擾的應(yīng)用前景 RNA干擾研究目前已經(jīng)在功能基因組學(xué)研究、微生物學(xué)研究、基因治療和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等廣泛領(lǐng)域取得了令人矚目的進(jìn)展，使其在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用有著廣闊的前景。,（1） 研究基因功能的新工具,由于 RNA干擾技術(shù)具有高度的序列專一性和有效的干擾能力，可以使特定基因沉默或功能喪失，因此可以作為功能基因組學(xué)的一種強(qiáng)有力的研究工具。,RNA干擾技術(shù)能夠在哺乳動(dòng)物中抑制特定基因的表達(dá)，建立多種表型；抑制基因表達(dá)的時(shí)間可以控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)。,（2） 腫瘤的基因治療,傳統(tǒng)反義RNA技術(shù)誘發(fā)的單一癌基因的阻斷，不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長(zhǎng)，而RNA干擾技術(shù)可以利用同一基因家族的多個(gè)基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設(shè)計(jì)針對(duì)這一區(qū)段序列的雙鏈RNA分子，只使用一種雙鏈RNA即可以產(chǎn)生多個(gè)基因同時(shí)剔除的表型，也可以同時(shí)使用多種雙鏈RNA而將多個(gè)序列不相關(guān)的基因同時(shí)剔除。RNA干擾技術(shù)可用于治療有異?；虮磉_(dá)的惡性腫瘤。, K-RAS蛋白為腫瘤發(fā)生所必需； bcr/ab1融合基因與人白血病有關(guān)， 用RNA干擾技術(shù) * 可以阻礙K-RAS蛋白的表達(dá)從而抑制腫瘤發(fā)生； * 或殺死有bcr/ab1的人白血病細(xì)胞系。 通過(guò)RNA干擾抑制某些內(nèi)源性基因的表達(dá)，能促進(jìn) 白血病細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡或增加其對(duì)化療藥物的反 應(yīng)性。,（3） 病毒性疾病的基因治療 RNA干擾可以被看成是一種與免疫系統(tǒng)類似的防御機(jī)制。 用siRNA抑制人類免疫缺陷病毒（HIV）某些基因的表達(dá)，如P24、Vif、nef、tat或rev，阻礙HIV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。 用RNA干擾技術(shù)抑制HIV的受體（CD4）或輔助受體（CXCR4或CCR5）在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，可阻礙HIV感染細(xì)胞。 也可通過(guò)RNA干擾抑制其他病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，如脊髓灰質(zhì)炎病毒、人乳頭狀瘤病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等。,siRNA在病毒感染的早期階段能有效地抑制病毒的復(fù)制，病毒感染能被針對(duì)病毒基因和相關(guān)宿主基因的siRNA所阻斷，RNA干擾技術(shù)將成為一種有效的抗病毒治療手段。這對(duì)于許多嚴(yán)重的病毒性疾病的防治具有十分重大的意義。,（三）核酶(ribozyme)用于基因治療,天然核酶多為單一的RNA分子，具有自我剪切作 用。但核酶也可以由兩個(gè)RNA分子組成。,在基因治療時(shí)，利用核酶分子結(jié)合到靶RNA分子中適當(dāng)?shù)泥徫?，形成錘頭核酶結(jié)構(gòu)，將靶RNA分子切斷，通過(guò)破壞靶RNA分子達(dá)到治療疾病（如清除病毒基因組RNA）的目的。 只要兩個(gè)RNA分子通過(guò)互補(bǔ)序列相結(jié)合，形成錘頭狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)（3個(gè)螺旋區(qū)），并能組成核酶的核心序列（13個(gè)或11個(gè)保守核苷酸序列），就可在錘頭右上方產(chǎn)生剪切反應(yīng)。,錘頭型核酶的二級(jí)結(jié)構(gòu) 和空間立體結(jié)構(gòu)示意圖,三個(gè)雙螺旋區(qū) 13個(gè)核苷酸殘基保守序列 剪切反應(yīng)在右上方GUX序列的3端自動(dòng)發(fā)生,（N代表任意核苷酸， H代表A,U或C）,1. 核酶的設(shè)計(jì),核酶是通過(guò)靶RNA分子與核酶分子共同組成酶活性結(jié)構(gòu)域，要從靶分子和核酶分子兩個(gè)方面來(lái)設(shè)計(jì)核酶。,（1）選擇合適的靶部位，該部位具有核酶切割位點(diǎn)，能與核酶分子結(jié)合并組成酶活性結(jié)構(gòu)域。,（2）核酶的基本組成：用于基因治療的核酶分子由三個(gè)部分組成，中間是保守序列（能夠組成酶活性結(jié)構(gòu)域），兩端是引導(dǎo)序列。,在基因治療中，主要是根據(jù)治療的靶基因序列的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)和合成特定的核酶。設(shè)計(jì)的基本原則是核酶分子與靶部位結(jié)合后能形成酶活性結(jié)構(gòu)域。,核酶的作用機(jī)制,2.核酶的應(yīng)用,與一般的反義RNA相比，核酶具有較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，不易受到RNA酶的攻擊。更重要的是，核酶在切斷mRNA后，又可從雜交鏈上解脫下來(lái)，重新結(jié)合和切割其它的mRNA分子。,核酶導(dǎo)入細(xì)胞方法,1、外源導(dǎo)入法：可以通過(guò)化學(xué)合成；也可以采用體外轉(zhuǎn)錄方法 2、內(nèi)源導(dǎo)入法：利用表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生核酶分子。,治療基因的受控表達(dá),Regulated Expression of Therapeutic Gene,時(shí)間:,治療基因的受控表達(dá)包括控制治療基因表達(dá)的時(shí)間、空間和水平三個(gè)方面。,空間:,表達(dá)水平：希望治療基因能在一個(gè)適當(dāng)?shù)乃奖磉_(dá)。,1.控制治療的基因在患者需要實(shí)施治療時(shí)才表達(dá)，而平時(shí)不需要進(jìn)行治療時(shí)則處于關(guān)閉狀態(tài)； 2.根據(jù)不同疾病的治療要求，控制治療基因持續(xù)表達(dá)的時(shí)間跨度。,是指為了提高基因治療的專一性和安全性，嚴(yán)格限制治療基因只在靶細(xì)胞中表達(dá)，避免治療基因指導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)干擾非靶細(xì)胞的正常生活，產(chǎn)生毒副作用。,要實(shí)現(xiàn)治療基因的受控表達(dá)，必須建立 完善的基因表達(dá)調(diào)控體系。 基因調(diào)控策略大致有以下幾種： 基因內(nèi)部調(diào)節(jié)機(jī)制 基因外部調(diào)節(jié)機(jī)制 利用病灶微環(huán)境使治療基因特異性表達(dá)以及治療基因的誘導(dǎo)表達(dá)等,使用正常細(xì)胞的組織特異性啟動(dòng)子、增強(qiáng)子元件 使用病變細(xì)胞的組織特異性啟動(dòng)子、增強(qiáng)子元件,（一）基因內(nèi)部的調(diào)節(jié)機(jī)制,1.使用正常細(xì)胞的組織特異性啟動(dòng)子、增強(qiáng)子元件,例如，酪氨酸酶是皮膚細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生色素途徑中的一種酶，可利用其啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)治療基因只在黑色素瘤細(xì)胞中表達(dá)，而不在正常的周邊細(xì)胞中表達(dá)。,不同類型的正常細(xì)胞或組織中往往存在某些特有的蛋白質(zhì)，它們的基因表達(dá)調(diào)控元件可用于驅(qū)動(dòng)治療基因的特異性表達(dá)，從而起到治療作用。,前列腺特異性抗原(PSA)是參與精液凝塊中蛋白質(zhì)降解、使精液液化的一種絲氨酸蛋白酶。它主要在前列腺中產(chǎn)生，而在前列腺癌細(xì)胞中含量很高，可以利用PSA基因調(diào)控元件驅(qū)動(dòng)治療基因在PSA陽(yáng)性的前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)而發(fā)揮作用，而其在PSA陰性細(xì)胞和非前列腺癌細(xì)胞中不能使治療基因表達(dá)。,2.使用病變細(xì)胞的組織特異性啟動(dòng)子、增強(qiáng)子元件,某些病變的細(xì)胞或組織產(chǎn)生一些特殊的蛋白質(zhì)，其基因表達(dá)調(diào)節(jié)元件也可以用來(lái)控制治療基因的特異性表達(dá)。,甲胎蛋白(AFP)基因正常情況下只在胚胎肝細(xì)胞中表達(dá)，不在成年肝臟細(xì)胞中表達(dá)。肝細(xì)胞腺癌細(xì)胞中AFP基因異常激活，因此可利用該基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)治療基因(如自殺基因)在癌細(xì)胞中表達(dá)，使癌細(xì)胞經(jīng)給藥后被殺死。 癌胚抗原(CEA)是膜糖蛋白家族的成員，在許多腺癌細(xì)胞中表達(dá)很高，采用其啟動(dòng)子可以使治療基因只在CEA陽(yáng)性的癌細(xì)胞中表達(dá)，而不會(huì)在陰性細(xì)胞中表達(dá)。,（二）基因外部的調(diào)節(jié)機(jī)制,除利用基因內(nèi)部的調(diào)節(jié)機(jī)制以外，還可通過(guò)施加外部刺激，促進(jìn)治療基因在特定細(xì)胞或組織中表達(dá)。,采用熱休克蛋白基因的表達(dá)調(diào)控元件來(lái)啟動(dòng)治療基因，可以通過(guò)對(duì)病灶局部進(jìn)行熱處理，達(dá)到使治療基因特異性表達(dá)的目的。,組織纖溶酶原激活物(t-PA)作為溶解血栓的藥劑，在中風(fēng)和心肌梗死等疾病治療中起著重要的作用。t-PA的活性在輻射后增加50倍，表明其基因表達(dá)調(diào)控元件中存在受輻射誘導(dǎo)的調(diào)控元件，故可利用其調(diào)控元件啟動(dòng)治療基因的表達(dá)，增強(qiáng)放療效果。,（三）利用病灶微環(huán)境使治療基因特異性表達(dá),病灶微環(huán)境與正常時(shí)往往不同，因此可利用這些變化控制治療基因的表達(dá)。,例如，在腫瘤病灶處，常常出現(xiàn)葡萄糖缺乏等情況，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP78/Bip的含量也隨之增加，使癌細(xì)胞能夠抵御應(yīng)激。當(dāng)采用這種基因的啟動(dòng)子來(lái)控制治療基因時(shí)，可以使治療基因在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，使腫瘤組織壞死。,腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速度快于形成血管的內(nèi)皮細(xì)胞，造成供血不足，因此在腫瘤內(nèi)部形成酸性、缺氧和營(yíng)養(yǎng)缺乏的區(qū)域。缺氧條件可以通過(guò)缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)和缺氧響應(yīng)元件(HRE)相互作用，調(diào)節(jié)一些基因的表達(dá)；如果采用缺氧響應(yīng)元件(HRE)來(lái)控制治療基因的表達(dá)，即可實(shí)現(xiàn)治療基因只在缺氧的腫瘤組織中表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)。,（三）利用病灶微環(huán)境使治療基因特異性 表達(dá),（四）治療基因的誘導(dǎo)表達(dá) 采用組織特異性啟動(dòng)子控制治療基因的表達(dá)，可能造成這些基因在靶細(xì)胞中表達(dá)，不再受外界控制。為了避免這種情況發(fā)生，研究人員正在開發(fā)和完善一些可誘導(dǎo)性基因表達(dá)系統(tǒng)。 這種系統(tǒng)的必要成分：一種是轉(zhuǎn)錄激活劑，它只在誘導(dǎo)藥物存在時(shí)才能與DNA結(jié)合；另一種則是特異性基因表達(dá)調(diào)控元件，僅對(duì)這種轉(zhuǎn)錄激活劑有所響應(yīng)。,四環(huán)素抗性操縱子系統(tǒng)原理,四環(huán)素抗性基因的轉(zhuǎn)錄受Tet阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控。,無(wú)四環(huán)素存在時(shí)，阻遏蛋白與四環(huán)素抗性操縱子序列結(jié)合阻斷四環(huán)素抗性基因的表達(dá)； 四環(huán)素存在時(shí)，阻遏蛋白與四環(huán)素具有極高的親和性，造成阻遏蛋白對(duì)四環(huán)素抗性操縱子阻遏解除，使四環(huán)素抗性基因的轉(zhuǎn)錄得以進(jìn)行。,基因治療的應(yīng)用研究,The Application of Gene Therapy,世界上第一個(gè)正式被批準(zhǔn)用于基因治療的病例是先天性腺苷脫氨酶（ADA）缺乏癥。1990年9月美國(guó)Blaese博士成功地將正常的人的ADA基因植入ADA缺乏癥病人的淋巴結(jié)內(nèi)，完成世界上首例基因治療試驗(yàn)。,腺苷脫氨酶(ADA)缺乏的 嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID),病因: 淋巴細(xì)胞缺乏ADA酶 腺苷、dATP堆積 破壞免疫功能 患兒很少活到成年,第一個(gè)基因臨床治療的方案(1990.9.14,NIH),治療策略： 淋巴細(xì)胞ADA酶 恢復(fù)至正常水平的 5%-10% 維持免疫系統(tǒng)功能 改善病人癥狀,治療基本步驟:,ADA基因+逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 導(dǎo)入患者淋巴細(xì)胞 體外擴(kuò)增 回輸病人體內(nèi) 淋巴細(xì)胞ADA酶恢復(fù)至正常水平的5%-10% 維持免疫系統(tǒng)功能,改善病人癥狀,（一）遺傳病的基因治療研究,已知人類有4000多種遺傳病，在人群中的發(fā)病率約為4050。但真正了解病因，能進(jìn)行產(chǎn)前診斷的僅限于那些為數(shù)不多的常見遺傳病。,1.在DN