喹啉雙季銨鹽與小牛胸腺DNA的作用研究-本科畢業(yè)論文

本科畢業(yè)論文（設計） 題 目：喹啉雙季銨鹽與小牛胸腺喹啉雙季銨鹽與小牛胸腺 DNADNA 的作用的作用研究研究 目目 錄錄 摘要摘要 . I 關鍵詞關鍵詞 . I Abstract . II Keywords . II 1 緒論緒論 .1 1.1 BZQN 的結(jié)構(gòu)特征及生物效應 . 1 1.2 DNA 的結(jié)構(gòu)特征與生理作用. 2 1.3 本課題的研究方法 . 2 1.4 本課題研究的主要內(nèi)容、目的及意義 . 3 2 實驗部分實驗部分 .4 2.1 實驗儀器與試劑 . 4 2.2 實驗內(nèi)容 . 5 3 結(jié)果與討論結(jié)果與討論 .7 3.1 BZQN 對 ctDNA 的紫外吸收光譜的影響 . 7 3.2 熒光光譜 . 8 3.3 堿變性實驗 . 11 3.4 金屬離子對 BZQN 與 DNA 相互作用的影響 . 12 3.5 熱變性實驗 . 13 3.6 BZQN 對 DNA 的結(jié)構(gòu)影響 . 14 3.7 BZQN 與 DNA 相互作用的焓變 . 15 3.8 分子模擬 . 16 4 結(jié)論結(jié)論 .17 參考文獻參考文獻 .18 I 喹啉雙季銨鹽與小牛胸腺喹啉雙季銨鹽與小牛胸腺 DNA 的作用的作用研究研究 摘要摘要：本論文采用圓二色譜法、等溫滴定量熱法、分子模擬、熒光光譜法等方式 研究了喹啉雙季銨鹽(BZQN)與小牛胸腺 DNA(ctDNA)的相互作用機理及熱力學。 研究結(jié)果表明， BZQN 具有顯著的熒光， 在 340nm 激發(fā)， 470nm 發(fā)射； 隨著 DNA 濃度的增加，BZQN 的熒光發(fā)生明顯的猝滅，并且猝滅常數(shù)（Ksv）隨著溫度的 升高而增大，符合動態(tài)猝滅的特征；紫外可見光譜實驗、熱變性實驗及圓二色譜 結(jié)果均表明，BZQN 與 DNA 發(fā)生嵌插結(jié)合，從而導致 DNA 的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改 變；離子選擇性實驗表明 K+ 使 BZQN-DNA 體系的熒光發(fā)生最顯著的猝滅；分 子模擬的結(jié)果表明，BZQN 可能是以靜電作用方式結(jié)合在 DNA 大溝附近；等溫 滴定量熱實驗表明 BZQN 與 DNA 的結(jié)合位點數(shù)約為 4，推測 BZQN 與 DNA 的 結(jié)合是熵驅(qū)動過程。綜合以上實驗結(jié)果可以推斷，BZQN 與 DNA 能發(fā)生熵驅(qū)動 的相互作用，其作用模式既有嵌插作用又有靜電作用，且靜電作用占主導。 關鍵詞關鍵詞: : 喹啉雙季銨鹽；小牛胸腺 DNA；光譜法；等溫滴定微量熱；分子模擬 II Study on interaction of quinoline biquaternary ammonium salt with calf thymus DNA Abstract: In this paper, the interaction and thermodynamics of quinoline biquaternary ammonium salt (BZQN) with calf thymus deoxyribonucleic (ctDNA) was investigated by circular dichroism (CD), isothermal titration calorimetry (ITC), molecular simulation and fluorescent spectrometry. The results showed BZQN had significant fluorescence at 470nm when it was excited at 340nm. Its fluorescence was quenched by ctDNA and the quenching constant (Ksv) was increased as the temperature rose, which was fitted the characteristics of dynamic fluorescence quenching. The results of UV spectra, thermotropy experiment and CD spectra indicated that the secondary structure of DNA had been changed because of the intercalation effect between BZQN and DNA. The effect of different metal ions on BZQN-DNA showed that the fluorescence of BZQN-DNA was sharply quenched by K+, but other cations had a little influence. The molecular simulation indicated that BZQN was bound to DNA near the big ditch by electrostatic interaction. By means of ITC, the binding point between BZQN and DNA was 4 and the combination process of BZQN and DNA was driven by entropy. So the binding mode of BZQN to DNA both included the intercalation and electrostatic effects, and the electrostatic effect was the dominant. Keywords: Quinoline biquaternary ammonium salt; Calf thymus DNA; Spectroscopy; Isothermal titration calorimetry; Molecular simulation 1 1 緒論緒論 1.1 BZQN 的結(jié)構(gòu)特征及生物效應的結(jié)構(gòu)特征及生物效應 1.1.1 BZQN 的結(jié)構(gòu)特征的結(jié)構(gòu)特征 喹啉是雜環(huán)芳香性有機化合物，分子式是 C9H7N，微溶于水，易發(fā)生取代 反應， 因此可以在喹啉環(huán)的基礎上通過修飾母體結(jié)構(gòu)改善水溶性，連接不同的取 代基實現(xiàn)其不同的生物功能?；诖耍菊撐耐ㄟ^喹啉環(huán)上的芐溴取代反應合成 了喹啉雙季銨鹽（BZQN），其結(jié)構(gòu)如下圖所示： (R)-(6-methoxy-quinonine-4-yl)(2S,4S,8R)-8-vinylquinuclidin-2-yl)methanol 1.1.2 BZQN 的的生物效應生物效應 喹啉類化合物屬于芳香雜環(huán)類化合物， 多種藥物及具有藥理活性的天然產(chǎn)物 中都存在喹啉結(jié)構(gòu)的骨架，由于其易發(fā)生親電取代反應，可以連接不同的基團形 成不同功能的衍生物， 因此喹啉類化合物在醫(yī)藥及分子生物學等領域都有重要的 應用，尤其在抗瘧疾、腫瘤、結(jié)核、HIV 病毒等領域具有突出的作用，是藥物研 究的一個焦點。 自從 20 世紀 30 年代人類認識到喹啉類化合具有抗瘧疾的作用以 來， 對喹啉類化合物的研究從未停止過，孫業(yè)欣等人全面綜述了近十年來喹啉類 化合物在抗瘧方面的研究進展1；冷元紅等人對喹啉類及其衍生物的抗瘧藥物的 合成及推廣作了簡要介紹，同時闡述了其中幾類藥物的作用機理2；Hoppe HC 等人通過分子示蹤法研究了喹啉藥物氯喹和甲氟喹在惡性瘧原蟲的內(nèi)吞作用， 分 析發(fā)現(xiàn)氯喹抑制血紅蛋白消化但沒有其他重要影響寄生蟲的內(nèi)吞作用的途徑， 而 2 甲氟喹抑制內(nèi)吞作用效果顯著3；劉春亮等人通過小鼠肝癌模型及免疫學實驗方 法研究了吡咯喹啉醌的抗腫瘤作用， 結(jié)果表明吡咯喹啉醌對靶細胞的殺傷效率很 高， 具有顯著的抗腫瘤生長的效果，同時口服給藥時能夠提高機體的抗腫瘤免疫 功能4；應苗法等人通過動物實驗和臨床實驗均證實了貝達喹啉能夠特異性的抑 制結(jié)核桿菌的 ATP 合酶發(fā)揮作用，對耐藥和非耐藥的結(jié)核桿菌都有效5；霸明 宇等人采用細胞水平模型、酶聯(lián)免疫吸附法和熒光法研究了 N4-芳基磺酰基喹喔 啉酮類化合物抗 HIV-1 作用機制及特點，結(jié)果顯示該化合物作用于 HIV-1 復制 的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)，抑制了逆轉(zhuǎn)錄酶的 RNA 依賴 DNA 聚合酶活性，表現(xiàn)出優(yōu)異的 抗 HIV-1 活性6；李小芳等人采用摩爾電導率、光譜法和熱重分析手段研究了鑭 -磺基水楊酸-8-羥基喹啉三元配合物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和真菌黑曲霉 的抑菌活性，結(jié)果顯示該三元配合物對三種真菌均有非常好的抑菌效果7。 1.2 DNA 的結(jié)構(gòu)特征與生理作用的結(jié)構(gòu)特征與生理作用 參與 DNA 組成的主要有四種堿基即： 腺嘌呤(A)、 鳥嘌呤(G)、 胸腺嘧啶(T)、 胞嘧啶(C)。所有 DNA 中腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩爾含量相等，即 A=T，鳥嘌呤 與胞嘧啶的摩爾含量相等，即 C=G。DNA 的一級結(jié)構(gòu)是由數(shù)量及其龐大的四種 脫氧核糖核苷酸即： 脫氧腺嘌呤核苷酸， 脫氧鳥嘌呤核苷酸， 脫氧胞嘧啶核苷酸， 脫氧胸腺嘧啶核苷酸，通過 3, 5- 磷酸二酯鍵連接起來的直線形或環(huán)形多聚體。 DNA 分子骨架是由反向平行的核苷酸鏈圍繞同一中心相互纏繞，嘌呤和嘧啶堿 位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)，磷酸與核糖在外側(cè)，彼此通過 3, 5- 磷酸二酯鍵連接。雙 螺旋結(jié)構(gòu)上有兩條螺形凹溝，一條較深，一條較淺。較深的溝稱大溝，較淺的溝 稱小溝。雙螺旋的平均直徑為 2 nm，堿基堆積距離為 0.34 nm，沿中心軸每旋轉(zhuǎn) 一周有10個核苷酸， 兩條核苷酸鏈依靠彼此堿基之間形成的氫鍵結(jié)合在一起8。 DNA 是生物體遺傳信息存儲和表達的載體，對生物體具有重要的意義9。 1.3 本課題的研究方法本課題的研究方法 圓二色譜法：圓二色譜法：圓二色譜主要是用于研究生物大分子的結(jié)構(gòu)， 通過圓二色光譜 獲得生物大分子如蛋白質(zhì)、 多糖等的二級結(jié)構(gòu)信息， 與分子設計與計算互相驗證。 可應用于蛋白質(zhì)折疊蛋白質(zhì)構(gòu)象研究， DNA/RNA 反應， 糖類等光學活性物質(zhì) 的結(jié)構(gòu)、純度測量，藥物篩選等。研究生物大分子之間的相互作用，大分子與小 3 分子的相互作用，測定分子相互作用后引起的生物大分子結(jié)構(gòu)的變化，進而進行 以生物大分子作為靶點活性物的篩選或者研究藥物的作用機制。 分子模擬：分子模擬：利用理論方法與計算技術模擬或仿真分子運動的微觀行為，廣泛 的應用于計算化學，計算生物學，材料科學領域，小至單個化學分子，大至復雜 生物體系或材料體系。分子模擬不僅避免了繁瑣的量子力學方程的求解，而且在 保證精度的同時，大大擴展了原子的計算機模擬的使用范圍。在藥物設計領域， 可用于研究病毒、藥物的作用機理等；在生物科學領域，可用于表征蛋白質(zhì)的多 級結(jié)構(gòu)與性質(zhì)； 在藥物研究方面通過分析和計算一系列活性藥物分子的三維構(gòu)象 并將其疊合，了解某一類藥物分子所應具有的藥物構(gòu)象，這一信息給予新藥研究 很大幫助， 藥效構(gòu)象的計算為今后的藥效基團方法以及數(shù)據(jù)庫虛擬篩選的方法打 下了基礎10-11。 等溫滴定量熱法：等溫滴定量熱法：是研究生物熱力學與動力學的重要方法，利用高自動化、 高靈敏度的微量量熱儀連續(xù)、準確地監(jiān)測、記錄一個變化過程的熱力學、動力學 曲線。等溫滴定量熱法具有許多獨特優(yōu)勢：對被研究體系的限制條件少，樣品用 量小且無損，靈敏度和精確度高，實驗時間較短，操作簡單。通過測定藥物與 DNA 或者 RNA 相互作用， 可以獲得生物分子相互作用的完整熱力學和動力學參 數(shù)12-13。 熒光光譜法熒光光譜法：由于熒光光譜技術具有操作方便，靈敏度高等優(yōu)點，常用于研 究小分子與核酸相互作用。對于本身具有熒光的物質(zhì)，其熒光性質(zhì)是研究它與 DNA 相互作用的關鍵性質(zhì)。 當化合物嵌插入 DNA 后， 由于該化合物自身振動模 式受到影響，該化合物的熒光強度通常會有所改變。因此，可以依據(jù)熒光強度的 變化推測該化合物與 DNA 作用的程度及機理。對于本身無熒光的化合物則可以 通過溴乙錠競爭實驗來研究其與 DNA 的相互作用8。 紅紅外光譜法：外光譜法：紅外光譜法實質(zhì)上是一種依據(jù)分子內(nèi)部原子間的相對振動、 分 子轉(zhuǎn)動等信息來確定物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和鑒別化合物的分析方法。 將分子吸收紅外光 的情況用儀器記錄下來，就是紅外光譜圖，紅外光譜圖能夠顯示 DNA 分子中的 主鏈骨架、特征振動譜帶以及側(cè)鏈在 2000-500nm 范圍振動譜帶等，可以依據(jù) DNA 在加入化合物前后紅外圖譜的變化來推測該化合物與 DNA 的相互作用8。 1.4 本課題研究的主要內(nèi)容、目的及意義本課題研究的主要內(nèi)容、目的及意義 4 DNA 是生物的基本遺傳物質(zhì)， 是遺傳信息的載體， 是基因表達的物質(zhì)基礎， 因此 DNA 也是很多類藥物的重要靶點。 DNA 與藥物分子相互作用的研究對藥物 的設計合成、結(jié)構(gòu)改造及相關的作用機制研究具有重要的意義。喹啉類化合物是 一類在醫(yī)藥等領域有著廣泛應用的芳香雜環(huán)化合物， 有關此類化合物的合成及應 用近年來受到人們的廣泛關注。因此，我們在合成喹啉環(huán)的基礎上通過修飾喹啉 的母體結(jié)構(gòu)，連接不同功能的取代基來實現(xiàn)其不同的生物能，本論文對新合成的 喹啉雙季銨鹽化合物通過紫外、熒光、圓二色譜、等溫滴定量熱、分子模擬等方 式進行結(jié)構(gòu)鑒定和表征，并進一步探討其與 DNA 間的相互作用。 2 實驗部分實驗部分 2.1 實驗儀器與試劑實驗儀器與試劑 2.1.1 實驗儀器實驗儀器 本實驗所用實驗儀器如表 1 所示： 表表 1 實驗儀器實驗儀器 儀器 型號 產(chǎn)地 瞬態(tài)熒光分析儀 FLS920 英國愛丁堡儀器有限公司 雙光束紫外可見分光光度計 T-1901 北京普析通用儀器有限責任公司 圓二色譜儀 Chirascan 英國應用光物理公司 等溫滴定量熱儀 Nano 美國 TA 公司 傅立葉紅外光譜儀 Nicolet-380 美國尼高力公司 2.1.2 實驗試劑實驗試劑 本實驗所用實驗試劑如表 2 所示： 表表 2 實驗實驗試劑試劑 藥品 類型 產(chǎn)地 ctDNA BR sigma 公司 喹啉雙季銨鹽 曾林濤老師饋贈 磷酸二氫鈉 AR 天津市天力化學試劑有限公司 磷酸氫二鈉 AR 天津市天力化學試劑有限公司 5 2.2 實驗內(nèi)容實驗內(nèi)容 2.2.1 圓二色譜圓二色譜 DNA 是光學活性物質(zhì)，因此可測定它的圓二色譜，從而了解其構(gòu)象。實驗 所用儀器為 Chirascan 圓二色譜儀，光源系統(tǒng)用氮氣保護(流量為 5 L/min)，樣品 池的光徑為 0.5 mm。測量參數(shù)：掃描速率 100 nmmin-1 ，分辨率 0.1 nm，響應 時間 1 s，累積次數(shù) 3 次。掃描波段為 200320 nm，DNA 的濃度為 0.3 g/L。 實驗時在樣品池中放置 90 L 2.17 10-5 mol/L 的 DNA 溶液， 加入 9 L 1.13 10-3 mol/L BZQN 溶液，測溶液的 CD 譜。 2.2.2 分子模擬分子模擬 本實驗采用 SYBYL 8.1 軟件， SYBYL 是美國 Tripos 公司為從事藥物及相關 領域研究的用戶提供的全面的藥物設計工具， 是目前藥物設計方面的權(quán)威工具軟 件。在 SYBYL-X 軟件包中有著當今最先進、最現(xiàn)代的同源建模技術與工作流， 同源蛋白識別、 從序列預測結(jié)構(gòu)與功能、 配體結(jié)合位點分析以及3D 建模技術等， 用來解決諸如生物大分子建模以及生物信息學分析之類的結(jié)構(gòu)生物學設計任務。 不論是進行配體 - 受體的相互作用的理論計算，還是依據(jù)生物大分子的結(jié)構(gòu)設 計新配體，都是把配體對接到受體的結(jié)合部位去，形成配體 - 受體復合物，這 個過程即為分子對接11。在進行分子對接時，首先是以已知配體 5-乙氧羰基-6- 甲基-4-4-甲氧基芐基-3,4-二氫嘧啶-2(1H)-酮(EMMD)與受體 ctDNA 的晶體結(jié)構(gòu) 為基礎，計算受體 ctDNA 結(jié)合部位的表面性質(zhì)；然后刪去原來的配體 EMMD， 計算用于分子對接的新配體 BZQN 的各表面性質(zhì)，然后依據(jù)互補匹配原則，將 配體 BZQN 對接到受體 ctDNA 的結(jié)合部位上去。 2.2.3 等溫滴定等溫滴定微微量熱量熱 BZQN 與 DNA 作用的熱力學焓變由美國 TA 公司的 Nano ITC3G采用連續(xù)注 射的方法完成，用儀器自帶 Nano ITC Analyze 軟件進行數(shù)據(jù)采集和處理。具體 實驗過程為：將 250 L 1.13 10-4 mol/L 的 BZQN 溶液裝入 250 L 滴定針，設 定總的滴定次數(shù)為25次， 每次滴 10 L于1.00 mL 2.17 10-5 mol /L DNA溶液中； 連續(xù)滴定時間間隔為 300 s，每次滴定持續(xù)時間為 2 s。2 次滴定實驗的時間間隔 大約 45min，使信號有足夠的時間返回基線。測量池的溫度控制為 25 oC，安培 6 瓶中攪拌器的轉(zhuǎn)速固定在 350 r/min，等基線穩(wěn)定后再啟動實驗，以便使因攪拌 而產(chǎn)生的熱量被自動扣除。 為扣除 BZQN 和 DNA 的稀釋熱， 要進行空白實驗。 2.2.4 紫外光譜紫外光譜實驗實驗 小牛胸腺 DNA 用 PBS 稀釋，采用文獻所述方法14，將 0.01 g/L ctDNA 在 紫外吸收光譜 260 nm 處，根據(jù)文獻中摩爾吸收系數(shù) 2606600 L mol-1 cm-1， 可以確定其濃度為 2.2 10-5 mol/L，溶液保存于 4 C 的冰箱中備用。 取 2 mL 2.17 10-5 mol/L ctDNA 溶液于比色皿中，相應的試劑 PBS 做參比， 測試溶液紫外吸收強度做空白對照，加入 5 L 7.5 10-1 g/L BZQN 溶液，測試溶 液紫外吸收強度，重復 10 次。 在 25 oC 時，測試 2 mL 2.44 10-5 mol /L ct DNA 溶液紫外吸收強度。將恒溫 槽升溫至 35 oC (35-95 oC 間、每隔 5 oC 的溫度，總共 12 組溫度)，重復測試溶液 紫外吸收強度。然后在 2mL 2.44 10-5 mol/L ct DNA 溶液中加入 2 L 5.63 10-4 mol/L BZQN 溶液混合，重復上述過程。 2.2.5 熒光光譜熒光光譜實驗實驗 取 2 mL 2.25 10-5 mol/L BZQN 溶液于比色皿中，測試溶液的熒光強度做空 白對照，加入 5 L 1.08 10-3 mol /L ctDNA 溶液，測試溶液的穩(wěn)態(tài)熒光強度，重 復 10 次。 在初始激發(fā)波長為 490 nm，350 - 470 nm 之間記錄發(fā)射光譜，間距為 10 nm 的條件下，分別掃描 BZQN 和 BZQN-ctDNA 體系的三維熒光光譜，其中 BZQN 的濃度為 2.63 10-5 mol/L，BZQN-ctDNA 體系 ctDNA 的濃度為 1.52 10-6 mol/L。 在控制 25 oC 恒溫， 取 2 mL 2.25 10-5 mol/L BZQN 溶液于比色皿中， 測試溶 液的熒光強度做空白對照，加入 5 L 1.08 10-3 mol/L ctDNA 溶液，測試溶液熒 光強度，重復 10 次。再分別控制 31 oC、37 oC 恒溫，重復上述實驗。本實驗中 的數(shù)據(jù)分析均遵循 Sterm Volmer 方程15， 其中靜態(tài)猝滅公式為： 0 1 q F KC F 動態(tài)猝滅公式為： 0 1 sv F KC F 。 7 取2 mL1.08 10-4 mol/L ctDNA溶液， 加入10 L 5.63 10-4 mol/L BZQN溶液， 測得體系熒光光譜。加入 4L 1 mol/L 的 K+，測溶液的熒光強度，重復 5 次。再 將 K+ 溶液分別換為 Fe3+ 和 Na+，重復上述實驗，測試體系熒光光譜。 取40 L 5.42 10-3 mol/L的ctDNA溶液和10 L 5.63 10-4 mol/L的BZQN 溶 液分別用 pH=8，9，10，11，12，13 的 Britton-Robison 緩沖溶液配成 2 mL 的溶 液，固定最佳激發(fā)波長(340 nm)和最佳發(fā)射波長(490 nm)測不同 pH 值下的溶液 的熒光強度。 2.2.6 紅外光譜實驗紅外光譜實驗 采用液膜法，在壓好的溴化鉀片上，分別滴加 DNA，DNA-BZQN 體系的溶 液，檢測個體系的紅外光譜。 3 結(jié)果與討論結(jié)果與討論 3.1 BZQN 對對 ctDNA 的紫外吸收光譜的影響的紫外吸收光譜的影響 圖 1 BZQN 對 ctDNA 紫外吸收強度的影響 5 8.35 10/c DNAmol L 3 10/:0,2.81,8.45,14.1,19.7 BZQN cmol LAH 圖 1 是不同濃度的 BZQN 在 ctDNA 溶液中的紫外吸收光譜， 其中曲線 F 是 2.75 10-2 mmol/L BZQN。溶液在 325nm 左右有最大吸光度，紫外吸收光譜發(fā)生 增色效應，溶液的紫外吸收隨 BZQN 濃度的增大而增強，說明 BZQN 與 ctDNA 8 之間發(fā)生了較強的相互作用。增色效應與減色效應是 DNA 所特有的，與其雙螺 旋結(jié)構(gòu)密切相關的光譜性質(zhì)，若藥物嵌入到 ctDNA 的堿基對中，則會改變構(gòu)成 堿基堆積力的疏水作用力和范德華力，從而使 DNA 的構(gòu)象和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性產(chǎn)生 改變，表現(xiàn)為顯著的增色效應16。因此可以推斷 BZQN 與 ctDNA 之間可能是嵌 插作用。 3.2 熒光光譜熒光光譜 3.2.1 穩(wěn)態(tài)熒光穩(wěn)態(tài)熒光 圖 2 BZQN 滴定 ctDNA 的熒光光譜 5 8.35 10/c DNAmol L 3 10/:1.41,2.82,4.22,7.04,9.85,12.7 BZQN cmol LBG 圖 3 ctDNA 滴定 BZQN 的熒光光譜 5 2.25 10/c BZQNmol L 3 10/:0,2.70,5.42,8.13,10.8,13.5,16.3,19.0,21.7,24.4 DNA cmol LAJ 9 圖 2 是 BZQN 滴定 ctDNA 溶液的熒光光譜。 其中曲線 A 是 1.67 10-5 mol/L ctDNA， BZQN空白對照的濃度為1.88 10-3mmol/L。 ctDNA無熒光， 當加入BZQN 后， 溶液的熒光發(fā)射峰從 470nm 移動 388 nm 處， 且熒光強度隨 BZQN 濃度的增 大而增強。說明 BZQN 對 DNA 具有增敏作用，表明 BZQN 與 DNA 之間發(fā)生了 相互作用。 圖 3 是不同濃度的 ct DNA 在 BZQN 溶液中的熒光光譜，其中 ctDNA 空白 對照溶液的濃度為 1.67 10-2 mmol/L。 BZQN 在 470 nm 處出現(xiàn)特征吸收峰， 溶液 的熒光強度隨著 DNA 濃度的增大而減小，說明 BZQN 與 ctDNA 發(fā)生了某種方 式的結(jié)合，DNA 的存在對 BZQN 的熒光有猝滅作用。 3.2.2 三維熒光三維熒光 三維熒光光譜不僅能夠直觀地表現(xiàn)核酸分子在不同條件下的構(gòu)象變化， 還可 全面展現(xiàn)待測樣品的熒光信息， 由此使核酸特征構(gòu)象變化的研究更具有科學性和 可靠性9。 圖 4 BZQN 的三維熒光光譜 10 圖 5 BZQN-ctDNA 的三維熒光光譜 BZQN 的三維熒光光譜如圖 4 所示，BZQN-DNA 的三維熒光光譜如圖 5 所 示，比較圖 4 和 5 可以看出：加入 ctDNA 后，散射峰明顯增強，說明 BZQN 與 DNA 之間發(fā)生了強烈的相互作用；而熒光發(fā)射峰的強度減弱，與穩(wěn)態(tài)熒光的結(jié) 果相同，表明 DNA 與 BZQN 發(fā)生相互作用后使 BZQN 的熒光猝滅。 3.2.3 變溫熒光變溫熒光 圖 6 不同溫度下 ctDNA 對 BZQN 的 Stern-Volmer 關系圖 熒光猝滅機理可分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅。 靜態(tài)猝滅是猝滅常數(shù) Ksv 隨溫度 的升高而減小，而動態(tài)猝滅是猝滅常數(shù) Ksv 隨溫度的升高而增大。猝滅常數(shù) Ksv 11 能夠衡量 DNA 對 BZQN 熒光猝滅的速率。以 F0/F-1 對 ctDNA 的濃度作圖，可 以得到 DNA 對 BZQN 的 Stern - Volmer 猝滅曲線，如圖 6 所示。 圖 6 是利用溫度在 298，303，310 K 時的熒光實驗數(shù)據(jù)，分別做出 3 個溫度 下的 Stern - volmer 曲線，對實驗數(shù)據(jù)線性擬合，得 298 K 時 BZQN 與 DNA 作 用的猝滅常數(shù) Ksv=5.3 104 L mol-1，303K 時的猝滅常數(shù) Ksv =7.9 104 L mol-1 ， 310K 時的猝滅常數(shù) Ksv =8.8 104 L mol-1。動態(tài)猝滅作用的 Ksv 值一般都小于 2.00 1010 L mol-1，初步判斷 DNA 對 BZQN 的猝滅方式可能為動態(tài)猝滅。據(jù)文 獻17報道，隨著溫度的升高，會使分子擴散系數(shù)增大，分子間發(fā)生碰撞的幾率 增大，發(fā)生熒光猝滅的可能性也隨之增大。如果熒光猝滅機理是靜態(tài)猝滅，溫度 升高會使 Ksv 減?。蝗羰莿討B(tài)猝滅，則溫度的升高會使 Ksv 增大。同時，升高 溫度后將降低配合物的穩(wěn)定性，這就使得形成配合物的可能性也減小。圖 6 中， 隨溫度升高， Ksv 的值明顯增大， 表明 ctDNA 對 BZQN 的猝滅方式為動態(tài)猝滅。 3.3 堿變性實驗堿變性實驗 圖 7 BZQN-DNA 體系堿變性曲線 ctDNA 是具有雙螺旋結(jié)構(gòu)的大分子，通過兩條鏈之間的堿基對由氫鍵相互 作用而緊密連接在一起。BZQN 是本身具有熒光的物質(zhì)，和 DNA 相互作用后形 成的 BZQN-DNA 溶液也具有熒光。DNA 的堿變性指的是，互補堿基間的氫鍵 作用力在堿性溶液中會減弱， 導致DNA開鏈成兩條單鏈， 破壞其雙螺旋結(jié)構(gòu)18。 12 曲線 A-F 是 pH=8, 9, 10, 11, 12, 13 的 BZQN-DNA 溶液的熒光光譜，由圖可 以看出：隨著溶液的堿性增強，溶液的熒光強度減弱，且在堿性較強的溶液中熒 光強度特別微弱。這種現(xiàn)象可能是因為溶液的堿性增強后使 DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu) 發(fā)生變化，致使 BZQN 從 DNA 上脫落，在溶液中游離使能量降低，熒光強度減 弱，據(jù)此可以推測 BZQN 應該嵌插于 ctDNA 的堿基間。 3.4 金屬離子對金屬離子對 BZQN 與與 DNA 相互作用的影響相互作用的影響 金屬陽離子易與 DNA 的磷酸基團負離子發(fā)生靜電作用，使得 DNA 的結(jié)構(gòu) 特征發(fā)生變化，其理化性質(zhì)和生理功能也會發(fā)生相應的改變。DNA 分子收縮后 使具有熒光的分子從 DNA 上脫落，游離的熒光分子由于相互碰撞或者與器壁碰 撞使能量降低，熒光強度減弱18。不同的金屬陽離子加入后，對 BZQN-DNA 體 系熒光的影響不同，結(jié)果如圖 8 所示。 圖 8 Na+、Fe3+、K+ 對 BZQN-DNA 體系熒光強度的影響 圖 9 K+ 對 BZQN 熒光強度的影響 c(Mn+)=0.002, 0.004, 0.006, 0.008, 0.010 mol/L 13 由圖 8 可以看出，隨金屬陽離子強度的增加，BZQN-DNA 體系熒光強度明 顯減小，其中 K+ 離子的影響最顯著。圖 9 是 K+ 對 BZQN 熒光強度的影響，表 明 K+ 對 BZQN 并無特異性結(jié)合，只是對 BZQN-DNA 體系的影響比較顯著。文 獻19報道，金屬陽離子與 DNA 的相互作用模式主要是靜電作用。因此推測本實 驗中熒光強度減弱可能是由于金屬陽離子相對于BZQN更容易與DNA的負離子 磷酸基團作用，金屬陽離子與 DNA 的靜電作用更強，使得 BZQN 從 DNA 上脫 落，處于游離狀態(tài)的 BZQN 在溶液中做無規(guī)則運動，容易發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，導致 BZQN 的能量降低，體系的熒光強度降低。這種現(xiàn)象說明在 DNA 與 BZQN 之間 的相互作用中，靜電引力仍然是主要的作用力， 本實驗進一步證實了靜電作用是 二者的作用模式之一。 3.5 熱變性實驗熱變性實驗 加熱可破壞 DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)，使堿基之間的氫鍵斷裂，形成兩條單鏈。 通常將 DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)失去一半時的溫度稱為 DNA 的熔點 Tm13。本實驗中 Tm 的測定采用 35-100 oC 內(nèi)每隔 5 oC 記錄 ctDNA 及其復合物在 260 nm 處的吸光度 （A）。以 0 0 ss f AA f AA 對溫度 T 作熱變性曲線圖。 0 0 ss f AA f AA 式中 A和 A 分別為起始溫度和最終溫度時的吸光度，A 為不同溫度下體系的吸光度，則 fss 0.5 所對應的溫度即為 ctDNA 和 BZQNDNA 復合物的 Tm。 圖 10 ctDNA 與 BZQN-ctDNA 的熱變性曲線 14 圖10是溫度對DNA及BZQN-DNA溶液的吸光度的影響曲線。 線a是ctDNA， 線 b 是 BZQN-DNA，由上圖可以看出游離 ctDNA 的 Tm約為 87oC，而 BZQN DNA 復合物的 Tm約為 92 oC，Tm明顯升高。由于嵌插結(jié)合會使 Tm增加，而溝 槽或靜電結(jié)合對 Tm影響很小，因此推測 BZQN 部分嵌入 ctDNA 的堿基對中， 并在一定程度上增強了 ctDNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。 3.6 BZQN 對對 DNA 的結(jié)構(gòu)影響的結(jié)構(gòu)影響 3.6.1 圓二色譜（圓二色譜（CD）法研究法研究 BZQN 對對 DNA 的結(jié)構(gòu)影響的結(jié)構(gòu)影響 DNA 的 CD 圖中 275 nm 波長附近的正峰代表 DNA 堿基對的堆積，240 nm 處的負峰是 DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)的 B 型構(gòu)象的特征峰20，可以通過正負峰的強度 和位置的變化判斷 DNA 結(jié)構(gòu)變化。 圖 11 DNA 和 DNA-BZQN 溶液的 CD 譜 圖 11 是 DNA 和 BZQN-DNA 的 CD 光譜圖。在 200-300 nm 的紫外區(qū)內(nèi)， ctDNA 在 275 nm 左右出現(xiàn)一個正的最大值，主要是由于 DNA 的堿基對堆積而 產(chǎn)生的；在 240 nm 左右出現(xiàn)一個負的最大值，是由于 DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)導致 的，是 B 型 DNA 的特征峰20。加入 BZQN 溶液后，導致 DNA 的 CD 譜發(fā)生變 化， 在 275 nm 處的 CD 正峰強度減弱， 240 nm 處的負峰的強度增強。 說明 BZQN 與 DNA 之間發(fā)生了相互作用， 且作用后影響了 ctDNA 的二級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象。 而二 級結(jié)構(gòu)的變化會導致 DNA 三、四級結(jié)構(gòu)的改變，從而引起 DNA 生物學功能的 改變并使 ctDNA 分子雙螺旋鏈發(fā)生解鏈21。BZQN 加入后 ctDNA 的 CD 譜的譜 15 峰的峰位并未發(fā)生改變，說明 BZQN 的加入只影響了 DNA 的二級構(gòu)象，并沒有 使 ctDNA 分子雙螺旋鏈發(fā)生解鏈。 3.6.2 FTIR 研究研究 BZQN 對對 DNA 結(jié)構(gòu)的影響結(jié)構(gòu)的影響 圖 13 BZQN、DNA、BZQN-DNA 的紅外圖譜 圖 13 是 BZQN、DNA 以及 BZQN-DNA 體系的紅外光譜，在 DNA 的紅外 光譜中，1631 cm-1是鳥嘌呤（G）的特征吸收峰；1487 cm-1是胸腺嘧啶（T）的 特征吸收峰；1400 cm-1是腺嘌呤（A）的特征吸收峰；1174 cm-1是胞嘧啶（C） 的吸收峰。加入 BZQN 后 DNA 的紅外光譜中，G、T、A、C 堿基的特征吸收峰 的峰位分別由 1631 cm-1移至 1637 cm-1，1487 cm-1移至 1489 cm-1，1400 cm-1移 至 1400 cm-1，1174 cm-1移至 1175 cm-1。其中 G，T，C 堿基峰位移動明顯，推 測 BZQN 可能是嵌入到 DNA 的堿基對中。G，C 堿基特征峰的振動強度隨著 BZQN的加入增大的比較明顯， 而T， A堿基特征峰的振動強度只有微細的變化， 因此推測 BZQN 能與 DNA 的 G，C 堿基上的活躍位點作用22。 3.7 BZQN 與與 DNA 相互作用的焓變相互作用的焓變 圖 12 是 BZQN 與 DNA 結(jié)合的 ITC 曲線， 以及對其積分得到的結(jié)合反應熱 對 BZQN 與 DNA 物質(zhì)的量之比的線性擬合曲線。用儀器自帶的 Nano ITC Analyze 軟件處理線性擬合曲線可以得到 BZQN 與 DNA 反應的焓變H與熵變 S分別為 27.72 KJ/mol 和 200.9 J/(mol K)，結(jié)合常數(shù) Ka為 4.32 105 L/mol，結(jié) 16 合位點數(shù) n = 4。根據(jù)吉布斯-赫姆霍茲公式GHT S (等溫狀態(tài)下)，常溫 下 BZQN 與 ctDNA 結(jié)合的吉布斯自由能變G為-32.16 kJ/mol， 負值說明 ctDNA 與 BZQN 的結(jié)合在標準狀態(tài)下是自發(fā)過程。 圖 12 298.15K 時 BZQN 與 DNA 結(jié)合的 ITC 曲線 藥物與生物大分子之間相互作用的作用力主要有靜電、氫鍵、疏水作用。對 于 DNA - 藥物體系，焓值和熵值都為正值，則表明藥物 DNA 的作用過程是吸 熱、熵增的過程23-24。據(jù)此推測 BZQN 與 DNA 作用是吸熱熵增的，主要作用力 是氫鍵和靜電作用。DNA 分子周圍的水分子在藥物與之相互作用的過程中會被 擠出，并且結(jié)合位點附近的水化層也會因為藥物的靠近而失去一部分水分子， DNA 和藥物的脫水作用都是吸熱的過程， 并且對于熵增是正的貢獻， 如果H0 且S0， 則是熵驅(qū)動過程23-24。 由于 BZQN 與 DNA 的作用過程中H0，S0 且 0G，所以推測 BZQN 與 DNA 的結(jié)合是熵驅(qū)動過程。 3.8 分子模擬分子模擬 圖 13 是 BZQN 與 DNA 相互作用的分子模擬圖，由圖 13 可以清晰地看到 BZQN 非?？拷?DNA 的磷酸骨架， 可能是 BZQN 中帶正電的部分與帶負電的磷 酸骨架之間有靜電引力； BZQN 的苯環(huán)上的 H 原子與 DNA 的胞嘧啶環(huán)側(cè)鏈的 N 17 原子之間形成氫鍵，氫鍵長度僅僅只有 2.12 ，表明 BZQN 與 DNA 的堿基對之 間也很容易發(fā)生相互作用。 圖 13 BZQN 與 DNA 相互作用的分子模擬圖 分子模擬的結(jié)果表明，BZQN 是結(jié)合在 DNA 大溝附近的，羥基氫原子與 胞嘧啶 C4上的 N 原子形成氫鍵，由于 BZQN 分子帶正電，DNA 的磷酸骨架帶 負電，因此推測在 BZQN 與 DNA 的相互作用中靜電作用占主導。 4 結(jié)論 (1) BZQN與DNA之間發(fā)生了相互作用， DNA能使BZQN的熒光發(fā)生猝滅， 且猝滅模式為動態(tài)猝滅；圓二色譜和紅外光譜實驗表明，BZQN 與 DNA 相互作 用后影響了 DNA 的二級結(jié)構(gòu)，推測 BZQN 可能是嵌入到 DNA 的堿基對中，與 G，C 堿基上的活躍位點作用，并增強了 DNA 的穩(wěn)定性； (2) BZQN 與 DNA 相互作用的結(jié)合常數(shù)為 4.32 105 L/mol；BZQN 與 DNA 相互作用的H 0，S 0，推測 BZQN 與 DNA 的結(jié)合是熵驅(qū)動過程； (3) 分子模擬的結(jié)果表明，BZQN 是結(jié)合在 DNA 大溝附近，羥基氫原子與 胞嘧啶 C4上的 N 原子形成氫鍵。 18 參考文獻參考文獻 1 孫業(yè)欣, 章怡彬. 喹啉及其相關雜環(huán)類抗瘧藥研究進展J. 國外醫(yī)藥 （抗生素分冊） , 2012, 33(1): 6-22. 2 冷元紅, 萬莉, 袁萍等. 抗瘧疾藥物的發(fā)現(xiàn)與發(fā)展J. 化學教育, 2013, 34(7): 6-9. 3 Hoppe HC, Van Schalkwyk DA, Wiehart UI et al., Antimalarial quinolines and artemisinin inhibit endocytosis in Plasmodium falciparum. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2004, 48: 2370-2378. 4 劉春亮, 曹歡, 李蓉等. 吡咯喹啉醌抗腫瘤作用J.中國藥理學與毒理學雜志, 2013, 27(3): 473-475. 5 應苗法, 朱劍萍, 馬珂等. 新型抗結(jié)核藥物貝達喹啉的作用及研究進展J. 中國新藥與 臨床雜志, 2014, 33(5): 325-329. 6 霸明宇, 曹穎莉, 徐柏玲等. N4-芳基磺?；高惢衔锟?HIV-1 作用機制及特點 J. 藥學學報, 2013, 48(6): 860-865. 7 李小芳, 馬小強, 楊聲等. 鑭-磺基水楊酸-8-羥基喹啉三元配合物合成、表征及其抑菌J. 合成纖維, 2010, 39(7): 30