（植物學(xué)專業(yè)論文）碳納米管對(duì)植物細(xì)胞影響的細(xì)胞生物學(xué)分析.pdf

中i ij 人學(xué)碩士學(xué)位論文 摘要 碳納米管對(duì)植物細(xì)胞影響的細(xì)胞生物學(xué)分析 專業(yè) 植物學(xué) 碩士生 申聰香 指導(dǎo)教師 姚楠教授 碳納米管 c a r b o nn a n o t u b e s c n t s 是一種具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)的新型 納米材料 近年來隨著研究的不斷深入 其廣闊的應(yīng)用前景特別是在生物醫(yī)藥上的 潛在優(yōu)勢(shì)開始展現(xiàn) 同時(shí)該類材料對(duì)生態(tài)環(huán)境 人類健康的影響目前也逐漸引起科 學(xué)家的注意 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中 納米技術(shù)在增強(qiáng)植物吸收養(yǎng)分能力 增加農(nóng)藥和除草 劑的功效 降低農(nóng)藥和除草劑的劑量等方面有著可觀的應(yīng)用前景 然而當(dāng)前納米材 料對(duì)植物影響的研究幾乎還是空白 探討納米材料對(duì)植物及其環(huán)境的影響 正確評(píng) 估碳納米管的生物學(xué)效應(yīng) 是具有重要意義的前瞻性研究 本文利用擬南芥和水稻 原生質(zhì)體系統(tǒng) 結(jié)合光鏡 電子顯微鏡觀察 以及e m t u n e l r t p c r 等檢測(cè)手 段 從多方面探討了單壁碳納米管 s i n g l e w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s s w c n t s 對(duì)植 物細(xì)胞的影響 我們用s w c n t s 處理原生質(zhì)體和植物組織后 檢測(cè)了細(xì)胞活性 形態(tài)變化 d n a 損傷 活性氧 r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s r o s 產(chǎn)生和相關(guān)基因表達(dá) 結(jié)果表 明 s w c n t s 在一定程度上能影響原生質(zhì)體的活性 并且這種影響呈現(xiàn)濃度依賴性 關(guān)系 但和處理時(shí)間關(guān)系不大 此外 單壁碳納米管還能引起原生質(zhì)體聚集 植株 葉肉細(xì)胞染色質(zhì)凝縮 t u n e l 的陽性反應(yīng)和h 2 0 2 積累 我們發(fā)現(xiàn)s w c n t s 處理 后葉肉細(xì)胞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜上有氯化鈰的沉積和類似內(nèi)吞的膜結(jié)構(gòu) 提出了碳納米 管穿過細(xì)胞膜的可能途徑 本研究說明 盡管碳納米管具有許多特異的性質(zhì) 但是 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用時(shí)要對(duì)其毒性作出充分的評(píng)價(jià) 關(guān)鍵詞 擬南芥 納米材料 原生質(zhì)體 水稻 單壁碳納米管 中山大學(xué)碩士學(xué)位論文 c e l lb i o l o g ya n a l y s i so fe f f e c t so fc a r b o nn a n o t u b e so n p l a n tc e l l s a b s t r a c t m a j o r b o t a n y n a m e c o n g x i a n gs h e n s u p e r v i s o r p r o f n a ny a o a sn e wm e m b e r so fn a n o m a t e r i a lf a m i l y c a r b o nn a n o t u b e s c n t s h a v em a n y u n i q u es t r u c t u r a la n dm e c h a n i c a lp r o p e r t i e s t h e i rp o t e n t i a la p p l i c a t i o n se s p e c i a l l yi n b i o m e d i c i n eh a v ei n c r e a s i n gi nr e c e n ty e a r s t h ee f f e c t so fc n t so nt h ee c o l o g i c a l e n v k o n m e n ta n dh u m a nh e a i t ha r ea l s og r a d u a l l yc a u s e dt h es c i e n t i s t sa t t e n t i o n i nt h e a g r i c u l t u r a lp r o d u c t i o n n a n o t e c h n o l o g yh a sac o n s i d e r a b l ea p p l i c a t i o np r o s p e c ti n e n h a n c i n gt h ea b i l i t yo fp l a n t st oa b s o r bn u t r i e n t s i n c r e a s i n gt h ee f f i c i e n c yo fp e s t i c i d e s a n dh e r b i c i d e s a l l o w i n gl o w e rd o s e st ob eu s e de t c h o w e v e r t h et o x i c o l o g i c a li m p a c t o fn a n o p a r t i c l e sh a s r a r e l yb e e ns t u d i e di np l a n t s i ti sa ni m p o r t a n tp r o s p e c t i v er e s e a r c h t os t u d yt h ee f f e c t so fn a n o m a t e r i a lo np l a n t sa n de n v i r o n m e n t a n de v a l u a t ec a r b o n n a n o t u b e sb i o c o m p a t i b i l i t ye x a c t l y u s i n gap r o t o p l a s ts y s t e mf r o ma r a b i d o p s i so rr i c e l e a v e s c o m b i n e dw i t hl i g h tm i c r o s c o p e e l e c t r o nm i c r o s c o p e e m t u n e la n dr t p c r w et e s t e df o rt h ee f f e c t so fs i n g l e w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s s w c n t s o np l a n tc e l l s f r o mm a n ya s p e c t s w ee x p o s e dl e a fp r o t o p l a s tc e l l sa n dp l a n tt i s s u e st os w c n t sa n de x a m i n e dc e l l v i a b i l i t y c e l lm o r p h o l o g y d n ad a m a g e r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s r o s g e n e r a t i o na n d m o l e c u l a rs i g n a l i n ga l t e r a t i o n s w ef o u n dt h a tt h ee f f e c to fs w c n t so nt h es u r v i v a lo f c e u sw a sd o s ed e p e n d e n t b u tn o tt i m ed e p e n d e n t w ea l s of o u n ds w c n t sc a nc a u s e a d v e r s ec e l l u l a rr e s p o n s e si n c l u d i n gc e l la g g r e g a t i o n c h r o m a t i nc o n d e n s a t i o nw i t ha 中山大學(xué)碩士學(xué)位論文 t u n e l p o s i t i v er e a c t i o n p l a s m am e m b r a n ed e p o s i t i o n a n dh 2 0 2a c c u m u l a t i o n m o r e o v e r w ef o u n de n d o c y t o s i s q i k es t r u c t u r ew i t hc e r i u mc h l o r i d ed e p o s i t sa r e r s w c n t t r e a t m e n t s u g g e s t i n gap o s s i b l ep a t h w a yf o rn a n o p a r t i c l e st ot r a v e r s et h ec e l l m e m b r a n e c o n s e q u e n t l y a r h o u g hn a n o m a t e r i a l sh a v eg r e a ta d v a n t a g e si nm a n y r e s p e c t s t h e i rc y t o t o x i c i t yn e e d st ob ee v a l u a t e dw h e nt h e ya r eu s e di nt h ea g r i c u l t u r a l p r o d u c t i o n k e y w o r d s a r a b i d o p s i s n a n o p a r t i c l e s p r o t o p l a s t s r i c e s i n g l e w a l l e d c a r b o n n a n o t u b e s s w c n t s 中山大學(xué)碩十學(xué)位論文 簡(jiǎn)稱 a c c m h 2 d c f d a d a p i e m f d a g a m o p s p c d p f a r o s t u n e l 縮略詞 英文全稱 a c t i v a t e dc a r b o n 5 a n d 6 c h l o r o m e t h y l 2 7 一 d i c h l o r o d i h y d r o f l u o r e s c e i n d i a c e t a t e a c e t y le s t e r 4 6 d i a m i d i n e 2 p h e n y l i n d o l e d i h y d r o c h l o r i d e e l e c t r o nm i c r o s c o p e f l u o r e s c e i nd i a c e t a t e g l u t a r a l d e h y d e 3 n m o r p h o l i n o p r o p a n e s u l f o n i ca c i d p r o g r a m m e dc e l ld e a t h p a r a f o r m a l d e h y d e r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s s i n g l e w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s t e r m i n a l d e o x y n u c l e o t i d y l t r a n s f e r a g em e d i a t e dd u t pn i c k e n d l a b e l l i n g 中文全稱 活性碳 氯甲基二氯二氫熒光 素二乙酯 4 6 一聯(lián)脒 2 一苯基吲哚 二鹽酸鹽 電子顯微鏡 熒光素二乙酸酯 戊二醛 3 n 一嗎啡啉 2 一羥基 丙磺酸 程序性細(xì)胞死亡 多聚甲醛 活性氧 單壁碳納米管 脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移 酶介導(dǎo)的d u t p 缺口末 端標(biāo)記 中山大學(xué)碩士學(xué)位論文 論文原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明 所呈交的學(xué)位論文 是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下 獨(dú)立 進(jìn)行研究工作所取得的成果 除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外 本論文不 包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果 對(duì)本文的研究 作出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體 均已在文中以明確方式標(biāo)明 本人完全意 識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān) 學(xué)位論文作者簽名 可磋商 日期 刀年莎月7 曰 學(xué)位論文使用授權(quán)聲明 本人完全了解中山大學(xué)有關(guān)保留 使用學(xué)位論文的規(guī)定 即 學(xué)校 有權(quán)保留學(xué)位論文并向國(guó)家主管部門或其指定機(jī)構(gòu)送交論文的電子版 和紙質(zhì)版 有權(quán)將學(xué)位論文用于非贏利目的的少量復(fù)制并允許論文進(jìn)入 學(xué)校圖書館 院系資料室被查閱 有權(quán)將學(xué)位論文的內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù) 庫(kù)進(jìn)行檢索 可以采用復(fù)印 縮印或其他方法保存學(xué)位論文 保密論文保密期滿后 適用本聲明 學(xué)位論文作者簽名 嗍 日期 沙f 口年6 月j 7 r 日 導(dǎo)師簽名 m 相 日期 知1 年石月7 日 中i i j 人學(xué)碩士學(xué)位論文 1 1 納米材料概述 第一章前言 納米材料是近年來科學(xué)上的一項(xiàng)重大發(fā)現(xiàn) 己經(jīng)成為當(dāng)今許多學(xué)科研究的熱 點(diǎn) 納米材料是一種介于分子和宏觀常規(guī)材料之間的介觀態(tài)材料 是指在三維空間 中至少有一維處于納米尺度范圍 1 1 0 0n m 或由它們作為基本單元構(gòu)成的材料1 1 1 包括納米顆粒 n a n o p a r t i c l e s 納米纖維 n a n o f i b e r s 納米管 n a n o t u b e s 復(fù)合材 料 c o m p o s i t em a t e r i a l s 和表面具有納米結(jié)構(gòu)的物質(zhì) n a n o s t r u c t u r es u r f a c e s 1 2 1 納米 材料的尺寸很小 結(jié)構(gòu)特殊 由于諸如表面效應(yīng) 小尺寸效應(yīng) 量子尺寸效應(yīng)和宏 觀量子隧道效應(yīng)等因素 納米材料具有許多獨(dú)特的性質(zhì) 納米材料最主要的特點(diǎn)是尺寸小 處于單個(gè)原子或分子與宏觀粒子交界的過渡 區(qū)域 3 1 當(dāng)直徑小于1 0 0n m 時(shí) 納米顆粒表面原子數(shù)與總原子數(shù)之比隨著直徑變小 而急劇增大 直徑為3 0a m 時(shí) 有大概1 0 的原子分布在表面 然而直徑降至3n n l 時(shí) 顆粒表面原子數(shù)已經(jīng)占總原子數(shù)的5 0 表面對(duì)體積之比決定了潛在的活性基 團(tuán)的數(shù)目 根據(jù)使用目的的不同這種高表面活性可以是有益的 例如抗氧化 藥物 運(yùn)載能力 增強(qiáng)吸收能力和與生物組織間的相互作用 或者有害的 有毒性 不穩(wěn) 定 誘導(dǎo)氧脅迫等 4 5 1 除尺寸小之外 納米材料還表現(xiàn)出許多機(jī)械 光學(xué) 物理 化學(xué)及超導(dǎo)等方面 的特性 因此被廣泛應(yīng)用于填充劑 遮光劑 催化劑 半導(dǎo)體 化妝品 微電子和 生物醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)圳4 1 例如將納米二氧化鈦 t i 0 2 按照一定比例添加到化妝品 中 不但可以吸收紫外線 而且可以散射紫外線 可同時(shí)屏蔽c 型紫外線 b 型紫 外線和部分a 型紫外線 目前 日本等國(guó)已有部分含納米二氧化鈦的化妝品問世 6 隨著納米技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化 各種形式的納米尺度的物質(zhì)已經(jīng)以各種不同的途徑進(jìn) 入我們的日常生活當(dāng)中 人們?cè)诠ぷ骱蜕钪薪佑|到他們的機(jī)會(huì)越來越多 從2 0 0 6 年發(fā)生在德國(guó)的魔術(shù)納米氣溶膠玻璃危害人體健康事件 7 到美國(guó)環(huán)境保護(hù)局公布發(fā) 現(xiàn)防曬霜中的納米二氧化鈦可能導(dǎo)致小鼠腦損傷的研究結(jié)果后導(dǎo)致的防曬霜爭(zhēng)議 中山人學(xué)碩士學(xué)位論文 引 越來越多的人開始關(guān)注納米材料是否對(duì)環(huán)境和人類健康帶來不利影響 從2 0 0 3 年起 n a t u r e 和s c i e n c e 等權(quán)威雜志已相繼發(fā)表論文 開始討論納米尺度材料的生 物效應(yīng)以及對(duì)環(huán)境和健康的影響問題 3 5 9 1 2 1 科學(xué)界不僅看到納米材料在各個(gè)領(lǐng)域巾的巨大作用 同時(shí)也認(rèn)識(shí)到納米技術(shù)可 能帶來的危害 2 0 0 3 年以后 美國(guó) 歐盟 德國(guó) 日本等發(fā)達(dá)國(guó)家相繼制定了國(guó)家 研究計(jì)劃 資助納米科技生物安全性的研究 例如2 0 0 4 年美國(guó)國(guó)家環(huán)保局撥款4 0 0 萬美元委托1 2 所大學(xué)開展納米材料對(duì)環(huán)境和人體可能產(chǎn)生危害的研究 研究課題 包括 皮膚對(duì)納米材料的吸附及其毒性 納米材料對(duì)飲水的影響 納米粒子對(duì)操作 者肺組織的影響 在海洋和淡水水域沉積的納米材料對(duì)環(huán)境的影響等 1 3 1 我國(guó)的國(guó) 家自然科學(xué)基金委 國(guó)家科技部也相繼啟動(dòng)和資助了一些重大課題 總體來講 國(guó) 內(nèi)外納米生物安全性的研究從起點(diǎn) 水平看相差不大 1 4 1 1 2 碳納米管及其細(xì)胞毒理學(xué)研究現(xiàn)狀 1 2 1 碳納米管簡(jiǎn)介 碳納米管 c a r b o nn a n o t u b e s c n t s 是日本電子顯微鏡專家i i j i m a 在1 9 9 1 年 意外發(fā)現(xiàn)的一 種碳結(jié)構(gòu) 1 由片層結(jié)構(gòu)的石墨卷成的無縫中空的納米級(jí)同軸圓柱 體 兩端由富勒烯半球封帽而成 1 6 l 根據(jù)石墨片層的數(shù)目碳納米管可以分為單壁碳 納米管 s i n g l e w a u e dc a r b o nn a n o t u b e s s w c n t s 和多壁碳納米管 m u l t i w a l l e d c a r b o nn a n o t u b e s m w c n r s 單壁碳納米管的的直徑在0 7 5n m 3n m 之間 長(zhǎng)度 為1 5 0p m 多壁碳納米管的直徑在2 3 0n m 之間 長(zhǎng)度為0 1 5 0 m 層間距約為 0 3 4r i m 17 1 碳納米管具有許多獨(dú)特的性質(zhì) 如重量輕 強(qiáng)度高 具有很好的熱穩(wěn)定性 化 學(xué)穩(wěn)定性和導(dǎo)電性 1 2 例如碳納米管的抗拉強(qiáng)度是鋼的1 0 0 倍 彈性模量與金剛石 相當(dāng) 約為鋼的5 倍 硬度與金剛石相當(dāng) 卻擁有良好的柔韌性 除本身具有許多 特異性質(zhì)之外 碳納米管還可以通過物理吸附 靜電作用和共價(jià)連接等手段進(jìn)行表 面修飾 近些年來隨著碳納米管及納米材料研究的不斷深入其廣闊的應(yīng)用前景也不 2 中山大學(xué)碩十學(xué)位論文 斷展現(xiàn)出來 在生物 醫(yī)藥上也開始嶄露頭腳 有研究發(fā)現(xiàn) 碳納米管在運(yùn)輸載體 生物傳感器 檢測(cè)病原體 治療癌癥等方面具有良好的應(yīng)用前景 1 8 2 5 1 1 2 2 碳納米管毒理學(xué)研究現(xiàn)狀 隨著碳納米管在生物醫(yī)學(xué)方面應(yīng)用的可能性不斷增加 關(guān)于碳納米管對(duì)細(xì)胞安 全性的研究也越來越多 碳納米管是否具有細(xì)胞毒性目前在不同的研究系統(tǒng)巾有不 同的結(jié)論 具有一定的爭(zhēng)議性 有研究顯示 碳納米管能夠抑制細(xì)胞增殖 并且呈 劑量和時(shí)間依賴性關(guān)系 2 6 2 7 碳納米管能誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生1 2 7 3 0 引起細(xì)胞聚集 2 6 3 誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡 2 6 3 2 3 4 1 和激活核岡子k b n f k b 2 7 2 9 3 0 除此之外 c u i 等 2 0 0 5 用單壁碳納米管處理人體胚胎腎細(xì)胞l 5 天后 發(fā)現(xiàn)單壁碳納米管能降低細(xì)胞黏附 能力 流式細(xì)胞儀分析顯示單壁碳納米管還能改變細(xì)胞周期 細(xì)胞被阻滯在g 0 g 1 期 s 期細(xì)胞顯著減少f 2 6 1 同樣d i n g 等 2 0 0 5 用多壁碳納米管處理人皮膚成纖 維細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞被阻滯在g 2 m 期 3 3 1 n i c o l a 等 2 0 0 8 用單壁碳納米管 多壁 碳納米管和兩者的混合物處理j u r k a t 細(xì)胞2 4 小時(shí) 流式細(xì)胞儀分析顯示碳納米管 能引起質(zhì)膜超極化 并且這種影響呈現(xiàn)濃度依賴性關(guān)系 3 2 1 另外單壁碳納米管能促 使細(xì)胞因子白介素8 i l 8 的釋放 3 0 3 5 p a c u r a r i 等 2 0 0 8 用未修飾的單壁碳納 米管處理人體正常和惡性問皮細(xì)胞2 4 小時(shí)后發(fā)現(xiàn)單壁碳納米管造成細(xì)胞d n a 損傷 2 9 1 o 雖然上述研究報(bào)道表明碳納米管可能具有細(xì)胞毒性的作用 但也有研究發(fā)現(xiàn)其 毒性作用不大 f l a h a u t 等 2 0 0 6 用相同的催化化學(xué)氣相沉積法 c c a d 制備了 三種不同的碳納米管 所用的金屬催化劑和量不同 處理人靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞后 同時(shí)用中性紅染色法和m t t 檢驗(yàn)法檢驗(yàn)細(xì)胞活性 研究結(jié)果表明任何一種碳納米 管都沒有細(xì)胞毒性 3 6 除了體外細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)之外 碳納米管在模式動(dòng)物體內(nèi)中的生物學(xué)效應(yīng)也開 始得到重視 2 0 0 4 年w a r h e i t 等將5m g k g 單壁碳納米管緩慢灌入小鼠的氣管中 發(fā)現(xiàn)小鼠的肺發(fā)生短暫的炎癥反應(yīng) 處理1 個(gè)月后組織切片顯示小鼠的肺中發(fā)生多 發(fā)性肉芽腫 3 7 類似實(shí)驗(yàn)也表明碳納米管能誘導(dǎo)小鼠肺部發(fā)生肉芽腫 3 8 枷 此外 有研究證實(shí)碳納米管進(jìn)入小鼠腹腔后能引起炎癥和肉芽腫的形成 4 1 1 然而 與此相 中山大學(xué)碩士學(xué)位論文 反 有報(bào)道顯示小鼠靜脈注射單壁碳納米管后在體內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)明顯的副作用 4 2 剞 1 2 3 碳納米管細(xì)胞毒性影響因素 在研究和爭(zhēng)論碳納米管是否具有細(xì)胞毒性的同時(shí) 近年來科學(xué)家們對(duì)于碳納米 管的生物學(xué)效應(yīng)及其影響因素進(jìn)行了深入探討 除了劑量這個(gè)關(guān)鍵岡素之外 j i a 等用直徑1 4n m 長(zhǎng)度l m 純化的單壁碳納米管和直徑1 0 2 0h i l l 長(zhǎng)度0 5 4 0 m 的多壁碳納米管處理小泡巨噬細(xì)胞 發(fā)現(xiàn)單壁碳納米管的細(xì)胞毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于多壁碳 納米管f 3 4 1 k a n g 等研究發(fā)現(xiàn)在抗菌方面單壁碳納米管比多壁碳納米管效果更好 而且證明碳納米管的大小是決定抗菌效果的一個(gè)關(guān)鍵岡剝4 5 1 些研究發(fā)現(xiàn)將碳納米管表面修飾或者高度純化的碳納米管能降低其毒性 k a m 等用流式細(xì)胞儀分析了暴露于連接羧基 生物素和熒光素的單壁碳納米管1 小時(shí)后的h l 6 0 和t u r k a tt 細(xì)胞 結(jié)果顯示表面功能化的單壁碳納米管并無明顯毒 性作用1 4 6 1 s a y e s 等 2 0 0 6 探討了不同程度功能化單壁碳納米管的細(xì)胞毒性 發(fā) 現(xiàn)碳納米管的細(xì)胞毒性與功能化密度有判4 7 1 f i o r i t o 等用高度純化的單壁碳納米管 處理人巨噬細(xì)胞4 8 小時(shí)后觀察統(tǒng)計(jì)凋亡或壞死細(xì)胞 p i 染色 發(fā)現(xiàn)純化的單壁碳 納米管只引起大約4 的細(xì)胞死亡 4 引 c h l o p e k 等 2 0 0 6 將高純度的多壁碳納米 管處理纖維原細(xì)胞和造骨細(xì)胞后檢測(cè)細(xì)胞活性及反應(yīng) 研究結(jié)果表明細(xì)胞的骨鈣 素 細(xì)胞因子白介素 6 i l 6 和氧自由基的水平?jīng)]有明顯變化 因此該小組認(rèn)為 多壁碳納米管和檢測(cè)的兩種細(xì)胞具有良好的生物適應(yīng)性 4 9 1 也有人認(rèn)為聚合程度是影響納米顆粒細(xì)胞毒性的因子之一 w i c k 等為了確定 團(tuán)聚狀態(tài)如何影響單壁碳納米管細(xì)胞毒性 測(cè)試了四種不同的單壁碳納米管溶液 碳納米管生產(chǎn)過程中的原材料 合成后的塊狀碳納米管 由塊狀碳納米管離心過濾 得到的束狀碳管和球狀碳管 5 除了分散得很好的束狀單壁碳納米管 其余的碳管 都是聚集成塊狀的 結(jié)果發(fā)現(xiàn)塊狀的碳納米管細(xì)胞毒性比分散性較好的碳管的細(xì)胞 毒性大 該研究推測(cè)團(tuán)聚的單壁碳納米管具有較大的剛性和尺寸 使碳納米管具有 類似石棉纖維的毒性 因此毒性相對(duì)較大 然而 與此相反t i a n 等研究了未純化單 壁碳納米管和已經(jīng)除去金屬催化刺的單壁碳納米管 發(fā)現(xiàn)未純化的單壁碳納米管的 細(xì)胞毒性較低 5 該研究認(rèn)為未純化的單壁碳納米管細(xì)胞毒性較低是岡為其聚集程 4 中i lj 大學(xué)碩士學(xué)位論文 度大 岡此毒性較低 這與w i c k 等提出的假設(shè)相悖 可能是由于使用了兩種不同 的細(xì)胞系 石棉誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞 從而得出不同的結(jié)論 碳納米管在生產(chǎn)過程中會(huì)使用一些金屬催化劑 如鐵 鎳等 k a n g a n 等探究 了單壁碳納米管巾鐵在細(xì)胞毒性方面的作用 他們選擇含有2 6 鐵催化劑的未純化 碳納米管和儀含0 2 3 鐵催化劑的純化碳納米管處理鼠巨噬細(xì)胞系r a w 2 6 4 7 與 純化的碳納米管相比 未純化富含鐵的單壁碳納米管誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生更多的羥自由 基 氧自由基并顯著降低了細(xì)胞內(nèi)谷胱甘 肽 g s h 的含量 積累脂質(zhì)過氧化物 因此他們推斷碳管中鐵的存在可能是決定巨噬細(xì)胞中氧化還原產(chǎn)生的重要原因 5 2 1 s h v e d o v a 等報(bào)道了未純化的單壁碳納米管 含鐵雜質(zhì) 對(duì)人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞具有 劑量和時(shí)間依賴性的細(xì)胞毒性 2 8 1 用較高濃度單壁碳納米管處理較長(zhǎng)時(shí)間后 發(fā)現(xiàn) 細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生自由基和過氧化物 谷胱甘肽 g s h 水平減少以及核和線粒體的形態(tài) 發(fā)生變化 但是加入金屬螯合劑后能降低毒性 這表明單壁碳納米管中剩余的鐵催 化劑可能參與了細(xì)胞毒性作用 此外 j i a 等發(fā)現(xiàn)使用低濃度的單壁碳納米管 1 1 4 m g c m 2 能抑制2 0 以上的細(xì)胞生長(zhǎng)p 4 1 由于單壁碳納米管的純度為9 0 推測(cè)是金屬催化劑導(dǎo)致的細(xì)胞毒性 碳納米管的分散性一直是 4 個(gè)難以解決的問題 岡此有時(shí)候加入一定濃度的表 面活性劑以分散碳管 d o n g 等研究了不同的表面活性劑對(duì)碳納米管細(xì)胞毒性的影 響 5 3 l 實(shí)驗(yàn)表明分散在十二烷基硫酸鈉 s d s 和鈉十二烷基苯磺酸鈉 s d b s 中單壁碳納米管對(duì)1 3 2 1 n 1 人星細(xì)胞瘤細(xì)胞的毒性是由于碳納米管表面的s d s 和 s d b s 產(chǎn)生的 而分散在膽酸鈉 s o 和單鏈d n a 中的單壁碳納米管對(duì)細(xì)胞的增 殖和存活率沒有影響 因此研究者呼吁在探討碳納米管的細(xì)胞毒性時(shí)應(yīng)注意其分散 劑的毒性效應(yīng) 除了上述因素之外 碳納米管的尺寸 比表面積 處理時(shí)間等也是影響細(xì)胞毒 性的重要因素 5 1 1 因此在探討碳納米管的細(xì)胞毒性時(shí) 對(duì)其表征進(jìn)行全面的考慮是 非常必要的 1 2 4 碳納米管細(xì)胞毒性產(chǎn)生機(jī)制 目前 對(duì)碳納米管引起細(xì)胞毒性的機(jī)制研究還很少 一些假說被提出來用來解 5 中山人學(xué)碩七學(xué)位論文 釋碳納米管的細(xì)胞毒性 其中一種被廣泛認(rèn)可并得到實(shí)驗(yàn)證明的的機(jī)制是碳納米管 誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生活性氧 r o s 導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生氧脅迫從而產(chǎn)生毒性 2 7 2 9 3 0 5 4 實(shí)驗(yàn)表 明碳納米管刺激細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧能激活核因子k b n f l c b 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 r o s 激活i k b 激酶 i k k 使i r b a 磷酸化 于是被磷酸化的i k b a 與n f l c b 分離 n f k b 從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至核內(nèi) 與d n a 結(jié)合后啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄 與此同時(shí)活性氧釋放到細(xì)胞外 刺 激細(xì)胞分泌炎癥因子 t m h 和i l 8 進(jìn)入細(xì)胞凋亡通路 導(dǎo)致細(xì)胞死亡 此外 t a n g 等用富勒烯 f u l l e r e n e 研究對(duì)微生物的影響時(shí)提出納米材料跟微 生物的物理接觸導(dǎo)致細(xì)胞損傷是納米材料的主要致死機(jī)制 5 5 1 k a n g 等用不同濃度 高度純化的單壁碳納米管處理大腸桿菌k 1 2 e c o l ik 1 2 后也提出了相同的猜想 5 剮 k a n g 等研究結(jié)果表明只有直接跟碳納米管接觸的大腸桿菌失去活性 且大腸桿菌 的活性并不隨碳納米管的濃度增加而變化 掃描電鏡觀察結(jié)果顯示大腸桿菌的細(xì)胞 膜已經(jīng)嚴(yán)重受損 失去了細(xì)胞完整性 同時(shí)檢測(cè)了大腸桿菌培養(yǎng)液中細(xì)胞內(nèi)含物質(zhì) 粒d n a 和r n a 的含量 發(fā)現(xiàn)單壁碳納米管處理的菌液中質(zhì)粒d n a r n a 的含量 比對(duì)照組中的含量分別高出5 倍和2 倍 證明細(xì)胞內(nèi)含物已經(jīng)外泄 因此 該研究 小組認(rèn)為碳納米管對(duì)細(xì)菌的毒性是碳納米管跟細(xì)菌之間的物理接觸導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞 膜受損而引起的 1 2 5 碳納米管對(duì)植物細(xì)胞影響研究現(xiàn)狀 碳納米管細(xì)胞毒性的研究大部分圍繞著動(dòng)物或人體細(xì)胞 很少有關(guān)于納米材料 對(duì)植物細(xì)胞影響的報(bào)道 l i n 等 2 0 0 9 首次利用多壁碳納米管研究了對(duì)擬南芥 a r a b i d o p s i st h a l i a n a 懸浮細(xì)胞系t 8 7 的細(xì)胞毒性1 5 7 1 用不同濃度 1 0i l l 雩幾6 0n l g 幾 1 0 0m v l6 0 0m g 1 多壁碳納米管 有兩種不同聚集程度的碳納米管 處理擬南芥 懸浮細(xì)胞2 7 天后 檢測(cè)了細(xì)胞干重 活性 細(xì)胞葉綠素含量和過氧化物歧化酶 s o d 的酶活 研究結(jié)果表明多壁碳納米管處理細(xì)胞后 細(xì)胞干重減少 活性下 降 葉綠素含量減少 s o d 酶活性降低 并且聚集程度小的碳納米管對(duì)細(xì)胞的影響 更明顯 植物細(xì)胞壁是植物細(xì)胞區(qū)別于動(dòng)物細(xì)胞的主要特征之一 主要由相交聯(lián)的多糖 組成 由于有細(xì)胞壁和細(xì)胞膜組成的雙重屏障 外界分子很難進(jìn)入植物細(xì)胞 碳納 6 中山大學(xué)碩士學(xué)位論文 米管具有許多獨(dú)特的性質(zhì) 已經(jīng)有研究報(bào)道碳納米管能運(yùn)輸生物大分子進(jìn)入動(dòng)物細(xì) 胞中阢5 8 5 9 1 在植物中也有研究報(bào)道硅納米顆粒能運(yùn)輸d n a 和化學(xué)藥品進(jìn)入去掉 細(xì)胞壁的原生質(zhì)體當(dāng)中l(wèi) 刪 l i u 等的研究發(fā)現(xiàn)單壁碳納米管能穿過完整植物細(xì)胞的 細(xì)胞壁和細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部 并且能運(yùn)輸單鏈d n a 分子進(jìn)入植物細(xì)胞中 6 1 1 而且該研究還推測(cè)碳納米管能運(yùn)輸生物大分子至特定的細(xì)胞器 由此可見 單壁碳 納米管作為運(yùn)輸載體應(yīng)用到植物細(xì)胞中是很有可能的 1 3 植物程序性細(xì)胞死亡簡(jiǎn)介 細(xì)胞死亡是生物體的一種常見生命現(xiàn)象 根據(jù)死亡的形式一般可分為兩種 細(xì) 胞壞死 n e c r o s i s 和程序性細(xì)胞死亡 p r o g r a m m e dc e l ld e a t h p c d 細(xì)胞壞死是 細(xì)胞在遭受環(huán)境中的強(qiáng)熱 冰凍 強(qiáng)烈機(jī)械損傷等因素時(shí)出現(xiàn)的一 種非生理性細(xì)胞 死亡 這種死亡以原生質(zhì)膜的破裂為特征 6 2 1 造成細(xì)胞內(nèi)含物的外泄 引起周闈組 織發(fā)生炎癥反應(yīng) 故對(duì)生物體的生長(zhǎng)發(fā)育很不利 程序性細(xì)胞死亡是生物體在發(fā)育 過程中或環(huán)境影響下 通過自身內(nèi)部機(jī)制啟動(dòng)并調(diào)節(jié)的細(xì)胞生理性自然死亡的過程 6 3 1 是一種主動(dòng)的 生理性的細(xì)胞死亡過程 這種死亡是由基因啟動(dòng)和調(diào)控的 在 高等生物體內(nèi)廣泛存在 對(duì)生物體生長(zhǎng)發(fā)育具有積極意義 程序性細(xì)胞死亡的研究最先開始于動(dòng)物細(xì)胞 1 9 5 1 年 g l u c k m a n n 首先提出了 細(xì)胞程序化死亡的概念 證明在脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物中都存在該現(xiàn)象 6 4 1 1 9 6 1 年 k a r l 發(fā)表文章闡述程序化細(xì)胞死亡的形式及對(duì)植物正常生理活動(dòng)的重要性 1 9 7 2 年 k e r r 等在生物體發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)了一種與細(xì)胞壞死形態(tài)特征完全不同的 細(xì)胞死亡方式 將其命名為細(xì)胞凋亡 a p o p t o s i s 6 5 1 并認(rèn)為細(xì)胞凋亡是程序性死 亡一 種的組織形式 植物p c d 的研究起步較晚 1 9 8 5 年 尤瑞麟研究了正常小麥珠心細(xì)胞衰退過 程中超微結(jié)構(gòu)的變化 引用了p c d 的概念慚l 二十世紀(jì)9 0 年代初 g r e e n b e r g 等 發(fā)現(xiàn)在植物對(duì)病原菌的防御反應(yīng)中存在程序性死亡的現(xiàn)象 6 7 1 此后 眾多研究者從 形態(tài)學(xué)觀察 超微結(jié)構(gòu) 細(xì)胞化學(xué) 生物化學(xué) 基岡調(diào)控 酶學(xué)和信號(hào)傳導(dǎo)等方面 對(duì)植物p c d 進(jìn)行了研究 近年來研究證實(shí)p c d 廣泛存在于植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階 段和抵抗病原菌 外界脅迫的防御反應(yīng)中 如胚柄形成 6 8 1 糊粉層降解 6 9 1 導(dǎo)管的 7 中i ij 人學(xué)碩士學(xué)位論文 分化形成 7 0 1 和葉片形態(tài)的正常形成 7 1 l 珠心細(xì)胞的退化口2 1 通氣組織的形成1 7 3 1 根皮層細(xì)胞的死亡f 7 4 1 植物病原微生物互作引發(fā)的過敏反應(yīng) h y p e r s e n s i t i v er e s p o n s e h r 7 5 7 8 1 等 j o n e s 認(rèn)為植物p c d 的研究主要集中在三個(gè)方面 終端分化 t e r m i n a l d i f f e r e n t i a t i o n 植物衰老 環(huán)境脅迫和病害抵抗 7 9 1 目前國(guó)際上主要研究是以病 原菌引起的植物p c d f 8 0 8 3 1 在p c d 發(fā)生過程當(dāng)中 一般伴隨著特定的形態(tài) 生理 生化特征出現(xiàn)1 8 4 1 3 1 植物程序性細(xì)胞死亡特征 發(fā)生p c d 的植物細(xì)胞有其獨(dú)特的形態(tài)學(xué)特征 主要表現(xiàn)為 細(xì)胞體積縮小 密度增大 細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核發(fā)生凝縮 染色質(zhì)凝集并邊緣化 細(xì)胞器發(fā)生有序解體 消失 部分細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核碎片由細(xì)胞膜包被形成凋亡小體 a p o p t o t i cb o d y 細(xì) 胞膜保持完整性 沒有細(xì)胞內(nèi)含物溢出 髓1 但也有研究認(rèn)為植物細(xì)胞由于細(xì)胞壁的 存在不會(huì)產(chǎn)生凋亡小體 細(xì)胞死亡后并不被臨近細(xì)胞吞噬 在程序性死亡過程中液 泡參與降解細(xì)胞器 在一些情況下構(gòu)成利于自身發(fā)展的特殊結(jié)構(gòu) 如皮層細(xì)胞死亡 形成通氣組織 導(dǎo)管細(xì)胞死亡后形成輸導(dǎo)組織 7 0 7 3 8 6 植物程序性細(xì)胞死亡在生物化學(xué)上的特征主要表現(xiàn)為細(xì)胞核內(nèi)d n a 的變化 在內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的作用下 細(xì)胞內(nèi)d n a 在核小體連接區(qū)被切開降解成以1 8 0 b p 為基數(shù)的寡聚核小體片段 在瓊脂糖凝膠電泳上呈現(xiàn)特異性的 梯狀 條帶 d n a 斷裂會(huì)形成3 o h 端 6 7 1 1 3 2 植物程序性細(xì)胞死亡檢測(cè)方法 研究p c d 的方法有很多 目前主要采用的是形態(tài)觀察法和生化檢測(cè)法 發(fā)生 p c d 的植物細(xì)胞與壞死的細(xì)胞形態(tài)存在明顯差別 根據(jù)其典型的形態(tài)學(xué)特征 應(yīng)用 光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡可以觀察并區(qū)分細(xì)胞是否發(fā)生p c d 電子顯微鏡是觀察細(xì) 胞形態(tài)變化的最佳方法 樣品制成超薄切片后 經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色 在電鏡下可以清楚得觀察到細(xì)胞核和細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu)變化 并且可以觀察到p c d 不同時(shí)期的細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化 可對(duì)細(xì)胞程序性死亡提供確切的證據(jù) 8 p c d 發(fā)生時(shí) 內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活 導(dǎo)致d n a 非隨機(jī)性斷裂成1 8 0 b p 整倍 中山大學(xué)碩士學(xué)位論文 數(shù)的寡核苷酸片段 形成d n al a d d e r l 6 7 1 而壞死細(xì)胞的d n a 降解隨機(jī)發(fā)生 電泳 時(shí)表現(xiàn)為連續(xù)分布的d n a 條帶 但有研究表明并非所有發(fā)生p c d 的細(xì)胞都能產(chǎn)生 d n a 特異片段f 鵝 根據(jù)細(xì)胞發(fā)生p c d 時(shí)d n a 斷裂成不同長(zhǎng)度的片段 還可以采 用彗星電泳法 c o m e ta s s a y 檢測(cè) 在電流作用下d n a 片段會(huì)移出細(xì)胞核 d a p i 染色后可觀測(cè)到彗星狀的核d n a 的遷移 彗星電泳法敏感度高 所需細(xì)胞用量少 可較精確地反映細(xì)胞的凋亡 但是不能直接檢測(cè)帶壁植物細(xì)胞的凋亡f 黔1 t u n e l t e r m i n a ld e o x y n u c l e o t i d y lt r a n s f e r a s em e d i a t e dd u t pn i c ke n d l a b e l l i n g 是指脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的d u t p 缺口末端標(biāo)記法 是原位檢測(cè)細(xì)胞凋 亡最為敏感 快速 特異的方法 該法最早是由g a v r i e l i 等建立即1 利用細(xì)胞凋亡 中染色體d n a 雙鏈斷裂或一條鏈上出現(xiàn)缺口產(chǎn)生的y o h 端 在脫氧核糖核苷酸 末端轉(zhuǎn)移酶 t d t 的作用下 將脫氧核糖核苷酸和熒光素 過氧化物酶 磷酸化 酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到d n a 的3 末端 從而進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè) t u n e l 法實(shí)際上是分子生物學(xué)和形態(tài)相結(jié)合的方法 對(duì)完整的凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行 原位染色 能準(zhǔn)確地反映細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征 6 3 1 1 9 9 9 年g o p i n g 等將該技術(shù)改良后應(yīng)用到電鏡上 9 1 1 證明該技術(shù)在電鏡上也能準(zhǔn)確地檢測(cè)細(xì)胞凋 亡 由于其可靠性 t u n e l 檢測(cè)成為目前植物細(xì)胞程序性死亡檢測(cè)的首選手段 同時(shí)應(yīng)用l m t u n e l 和e m t u n e l 檢測(cè) y a o 等證明毒素v i c t o r i n 能誘導(dǎo)燕麥葉 片發(fā)生程序性細(xì)胞死亡 并且該實(shí)驗(yàn)首次在植物中運(yùn)用e m t u n e l 技術(shù)檢測(cè)程序 性細(xì)胞死亡 9 2 1 1 3 3 活性氧與植物程序性細(xì)胞死亡 活性氧 r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s r o s 是 類具有超氧化能力 能持續(xù)進(jìn)行反 應(yīng)的物質(zhì) 如超氧陰離子 0 2 過氧化氫 h 2 0 2 羥自由基 o h 等 在植 物中可以在多個(gè)部位通過多條途徑生成 如葉綠體可通過m e h l e r 反應(yīng)產(chǎn)生0 2 和 h 2 0 2 線粒體在消耗n a d h 的同時(shí)產(chǎn)生0 2 i 和h 2 0 2 過氧化物酶體通過乙醇酸氧 化產(chǎn)生h 2 0 2 9 3 r o s 最初被認(rèn)為是細(xì)胞代謝的有毒的副產(chǎn)物 植物細(xì)胞具有多種清除r o s 的 酶 如超氧化物歧化酶 s o d 抗壞血酸過氧化物酶 a p x 過氧化氫酶 c a t 9 中 1 1 人學(xué)碩士學(xué)位論文 等 使細(xì)胞免受r o s 的毒害 l e v i n e 等研究大豆懸浮細(xì)胞時(shí)證實(shí)h 2 0 2 在植物抵御 環(huán)境脅迫中充當(dāng)了信號(hào)分子 誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生過敏反應(yīng) h y p e r s e n s i t i v er e s i s t a n c e h r 9 4 1 近年來越來越多的證據(jù)表明 r o s 在植物細(xì)胞程序性死亡過程巾具有調(diào)節(jié)信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用 在植物抵御病原菌侵染以及誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的過程中 r o s 大量產(chǎn)生于 細(xì)胞壁 細(xì)胞膜 線粒體 葉綠體等不同部位 y a o 等利用電鏡氯化鈰 c e c l 3 染 色法 研究毒素v i c t o r i n 誘導(dǎo)燕麥葉片發(fā)生p c d 時(shí)發(fā)現(xiàn) h 2 0 2 首先在線粒體上產(chǎn) 生和積累 之后才發(fā)生染色質(zhì)凝縮和d n a 斷裂 并且阻止線粒體r o s 迸發(fā)也能阻 止p c d 發(fā)生 因此推測(cè)源于線粒體的r o s 是調(diào)節(jié)植物p c d 的一個(gè)重要因素 9 列 目前 人們普遍認(rèn)為 在植物的p c d 過程中r o s 可能起到三個(gè)方面的作用 一是 低濃度時(shí)作為信號(hào)分子傳導(dǎo)環(huán)境脅迫信號(hào) 二是中等濃度時(shí)能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生p c d 三是高濃度時(shí)細(xì)胞發(fā)生壞死 9 6 1 1 4 本課題的研究意義及創(chuàng)新性 根據(jù)j o s e p h 和m o r r i s o n 報(bào)道 在農(nóng)業(yè)和糧食產(chǎn)業(yè) 納米技術(shù)很可能應(yīng)用于分 子治療疾病 快速疾病診斷 增強(qiáng)植物吸收養(yǎng)分能力等方面 微型傳感器和微型傳 輸系統(tǒng)能幫助農(nóng)業(yè)作物抵抗病毒及其他病原菌 在癥狀可見之前確定植物的健康狀 態(tài) 在不久的將來很可能利用納米級(jí)別的催化劑增加農(nóng)藥和除草劑的功效 降低農(nóng) 藥和除草劑的劑量 以減少對(duì)環(huán)境的污染 納米技術(shù)也可以通過使用納米級(jí)催化劑 減少農(nóng)藥污染或清除已存在的污染來間接保護(hù)環(huán)境 97 1 碳納米管具備許多特異的力學(xué) 電學(xué)和化學(xué)性能 近些年來隨著研究的深入其 廣闊的應(yīng)用前景也不斷展現(xiàn)出來 l i u 等的研究發(fā)現(xiàn)單壁碳納米管能運(yùn)輸單鏈d n a 分子穿過完整植物細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部 6 1 1 由此可見 單壁碳納 米管作為運(yùn)輸載體應(yīng)用到植物細(xì)胞中是極有可能的 然而 碳納米管進(jìn)入環(huán)境或生物體內(nèi)是否存在風(fēng)險(xiǎn)仍不確定 目前已有大量碳 納米管的細(xì)胞毒理學(xué)研究 但絕大多數(shù)都集中在動(dòng)物細(xì)胞和組織中 且已公開的研 究結(jié)果也存在極大的爭(zhēng)議 碳納米管對(duì)植物細(xì)胞的影響鮮有報(bào)道 正確評(píng)估碳納米 管的生物學(xué)效應(yīng) 探討納米對(duì)植物及其環(huán)境的影響 是具有重要意義的前瞻性研究 1 0 中i i j 入學(xué)碩十學(xué)位論文 本文利用擬南芥和水稻原生質(zhì)體系統(tǒng) 結(jié)合光鏡 電子顯微鏡觀察 以及 e m t u n e l r t p c r 等檢測(cè)手段 從多方面探討了商業(yè)化單壁碳納米管對(duì)植物細(xì) 胞的影響 本研究為進(jìn)一步研究碳納米管作用于植物細(xì)胞的分子機(jī)理打好了基礎(chǔ) 給碳納米管在植物中的應(yīng)用提供了一些科學(xué)依據(jù) 中i i j 人學(xué)碩士學(xué)位論文 2 1 實(shí)驗(yàn)材料 第二章實(shí)驗(yàn)材料和方法 擬南芥野生型 c o l u m b i a c 0 1 水稻 日本晴 n i p p o n b a r e 植物培養(yǎng)土 丹麥進(jìn)口品氏水蘚泥炭土 納米材料 單壁碳納米管 s w c n t s 購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)有限公司 直徑為1 2n n l 長(zhǎng)度約為3 0 m 碳納米管的純度大于9 5 其中單壁 碳納米管的含量大于9 0 比表面積大于3 8 0m 2 g 2 2 實(shí)驗(yàn)試劑 c m i 1 2 d c f d a 購(gòu)自m o l e c u l a rp r o b e s e u g e n e o r u s a d a p i 購(gòu)自r o c h e s h a n g h a i c h i n a f l u o r e s c e i nd i a c e t a t e f d a 和t r y p a nb l u e 購(gòu)自s i g m a s i g m a a l d r i c h c h i n a t h ea p o p t a gp l u sf l u o r e s c e i ni ns i t ua p o p t o s i sd e t e c t i o nk i t 購(gòu)自c h e m i c o n c a l i f o r n i a u s a c e l l u l a s er 1 0 和m a c e r o z y m er 1 0 購(gòu)自北京 普博欣新生物技術(shù)發(fā)展有限公司 y a k u l t j a p a n 進(jìn)口分裝 t a qd n a 聚合酶購(gòu)自 t a k a r a 公司 c d n a 一鏈反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購(gòu)自f e r m a n t a s 公司 r n a 提取試劑t r i z o l 購(gòu)自i n v i t r o g e n 活性碳 a c t i v a t e dc a r b o n a c 購(gòu)白天津市福晨化學(xué)試劑廠 其他 常用試劑均為廣州化學(xué)試劑廠分析純?cè)噭?試劑配制 5m g n l lf l u o r e s c e i nd i a c e t a t e f d a i na c e t o n e 1m g r n id a p i i nd d h 2 0 1 0 0 mc m h 2 d c f d a i nd m s o 5 0m mm o p s i nh 2 0 1 2 中山大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 0m m c e c h i n5 0n 1 mm o p s 0 1mc b s i n d h 2 0 p h 7 4 5m m p p i x i n d m s o 5 0m m c 2 c e r a m i d e i ne t h a n 0 1 s w c n b 配制方法 稱取適量s w c n t s 加入w 5 培養(yǎng)液配制成1m g n 1 l 的母液 e l m a s o n i cs 3 0 h 超聲清洗器超聲處理3 0 秒獲得分散