WB方法經(jīng)驗(yàn)總結(jié).doc

WB經(jīng)驗(yàn)總結(jié)來(lái)源于丁香園論壇，由張慧慧（長(zhǎng)沙 湘雅附二）推薦來(lái)dxy好多年了，這些年陸陸續(xù)續(xù)回復(fù)了一些帖子，可是回來(lái)回去，發(fā)現(xiàn)大家提的問(wèn)題，還是那么幾個(gè)，沒(méi)有從根本上有所提高，確實(shí)出乎意料?？催^(guò)很多總結(jié)經(jīng)驗(yàn)的帖子，不知道該如何評(píng)價(jià)，要么抄書(shū)本，要么人云亦云，缺乏自己的東西，新手參考這些當(dāng)然難獲進(jìn)益。實(shí)在受不了，這些混淆視聽(tīng)的東西，本人把這么多年的回復(fù)，略作整理完善拼湊成WB實(shí)戰(zhàn)指南，歡迎行家批評(píng)指正。首先，擺擺自己的經(jīng)驗(yàn)。鄙人做WB有8、9年了，平均下來(lái)兩天跑一張多的蛋白膠；文章嘛，湊數(shù)的單篇有上24+，一作單篇15+（系國(guó)內(nèi)完成；注：當(dāng)年的IF，現(xiàn)在逐年遞減沒(méi)個(gè)標(biāo)準(zhǔn)）。其次，由于一些機(jī)緣的因素，在實(shí)驗(yàn)室WB體系完善的過(guò)程中，很多靠自己摸索；說(shuō)實(shí)話，碰了一鼻子灰，差不多能碰到的問(wèn)題都經(jīng)歷了，因此我敢寫(xiě)這樣一個(gè)咚咚給大家分享。再次，我再?gòu)?qiáng)調(diào)一點(diǎn)，對(duì)我們這類人來(lái)說(shuō)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠、漂亮已經(jīng)不算一個(gè)要求；如何縮短操作時(shí)間，使實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的更有效率也是我們所追求的，因此本文會(huì)針對(duì)兩個(gè)普遍采用的卻可以看成浪費(fèi)時(shí)間的操作，Bradford法蛋白定量和立春紅染膜做專門(mén)批判，這在以前的WB操作指南是絕無(wú)的，甚至叛離被視為經(jīng)典的分子克隆。可是，請(qǐng)記住，經(jīng)典是人定的。話不多廢，開(kāi)始：樣品制備：變性條件SDS LB直接裂解：用常溫或者高溫預(yù)熱過(guò)（預(yù)熱更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但容易遺忘，LB久煮某些性質(zhì)會(huì)改變）的1*SDS LB（或者略高1.5*）直接加到細(xì)胞或者組織上并煮樣。通常6孔板細(xì)胞80%以上密度，需200ul，其他按平板面積比類推。通常條件下，SDS LB都是過(guò)量的（因此不一定要嚴(yán)格參考SDS LB稀釋比）；如果SDS LB不夠，樣品核酸、蛋白濃度過(guò)高時(shí)，煮樣后會(huì)發(fā)現(xiàn)tip吸不上來(lái)，非常粘、一砣一砣的，很容易堵住tip。這時(shí)候常規(guī)做法有兩種，1. 再煮5min。常規(guī)煮樣時(shí)間3-5min，樣品過(guò)濃時(shí)就煮10min；2.如果10min煮樣后，仍然吸不起來(lái)，才適當(dāng)增加SDS LB，繼續(xù)煮；也可以對(duì)樣品進(jìn)行超聲。煮樣時(shí)間若過(guò)長(zhǎng)，蛋白會(huì)凝固，此時(shí)以失去繼續(xù)WB的意義，請(qǐng)丟棄（判斷標(biāo)準(zhǔn)：出現(xiàn)明顯的蛋白沉淀和水分層）此方法的缺點(diǎn)，SDS LB煮過(guò)的樣品如果用來(lái)做IP，需要特殊方法，因此，這種制備方法制備的樣品有使用局限。非變性裂解法（不討論諸如核抽提、亞細(xì)胞器分離等等了，其實(shí)類似）裂解細(xì)胞請(qǐng)盡量冰上操作，減緩酶解作用。俺前boss nature文章上的裂解液配方是：20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors (20g/ml leupeptin, 10g/ml pepstatin A and 10 g/ml aprotinin)（此裂解液可用于抽提核蛋白），其中蛋白酶抑制劑很復(fù)雜也很貴，其實(shí)用0.5mM PMSF替代這三種就好了；如果還要做磷酸化蛋白，加1mM Na3VO4（現(xiàn)加現(xiàn)用），10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 50 mM beta-GP。此方法的優(yōu)點(diǎn)：NaCl濃度略低于生理狀態(tài)，保證裂解細(xì)胞的方式較為溫和，便于隨后的IP等試驗(yàn)。其他Na鹽濃度的細(xì)胞裂解液也很常見(jiàn)，諸如0.15M（生理鹽濃度）、0.3M、0.6M（高鹽系列，裂解細(xì)胞時(shí)染色體會(huì)析出，細(xì)胞碎片和沉淀非常粘稠）及0.8-1.2M；0.3M及以下適合IP試驗(yàn)，0.6M及以上適合純化蛋白，尤其相互作用較強(qiáng)的復(fù)合體，要得到純化的一些復(fù)合體的組成蛋白一般采用極端的高鹽裂解細(xì)胞。用于核蛋白的裂解的原因是0.5% NP-40，用于破壞核膜結(jié)構(gòu)；可用到1%，但此時(shí)染色體會(huì)析出，沉淀粘稠。組織塊裂解：組織塊較大用勻漿的方法最合適，現(xiàn)在有不少轉(zhuǎn)頭很小的勻漿器。當(dāng)組織超微量的時(shí)候，比如50mg新鮮癌組織，我采用的方法是1. 低溫（剪）攪碎，成肉糜狀。2. 錫箔紙包裹好，放入少量液氮，快速敲擊（控制力量，盡量避免弄破錫箔紙），進(jìn)一步破碎；反復(fù)多次。3. 用上述細(xì)胞裂解液回收。分泌型蛋白富集：用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，收集上清液用于WB檢測(cè)；如果含量過(guò)低，需要用TCA沉淀富集。理論上，從普通培養(yǎng)基中收集分泌蛋白，此時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)條件的影響最小，是最佳的實(shí)驗(yàn)條件；但是這存在隱憂。因?yàn)楹宓呐囵B(yǎng)基中含有非常豐富的BSA（牛血清白蛋白）之類的蛋白質(zhì)，除非你進(jìn)一步分離純化，否則直接用這種樣品去WB會(huì)有非常大的麻煩，尤其當(dāng)你的蛋白在60-46 kDa之間的時(shí)候；用“任何”抗體去檢測(cè)這一區(qū)間的蛋白，會(huì)有一片非常強(qiáng)的信號(hào)。因?yàn)榇藚^(qū)間蛋白（主要是BSA）濃度過(guò)于富*非特異性粘附“任意”抗體，從而最終被識(shí)別。同理，采用SDS LB裂解細(xì)胞制備樣品前，通常要用PBS洗滌，其目的之一是去除培養(yǎng)基中的BSA。采用無(wú)血清培養(yǎng)基收集細(xì)胞上清除了改變細(xì)胞的生理狀態(tài)外（可能激活未知信號(hào)途徑，諸如AKT等），還會(huì)出現(xiàn)的問(wèn)題是：1. 即使采用了無(wú)血清收集上清，仍然有大量雜蛋白，但相對(duì)好很多。2. 選用了上清，由于蛋白濃度太稀，通常要采用TCA沉淀富集，再重新溶解。a. TCA沉淀對(duì)半定量操作要求非常高，因?yàn)楹苋菀壮恋聿怀浞只蛘唠x心操作丟失，尤其在離心過(guò)程，離心管的擺放非常講究，要180度翻轉(zhuǎn)離心兩次。b。重新溶解時(shí)，由于蛋白需要在一定的鹽離子條件下才能重新溶解，你要摸索充分溶解的條件，相對(duì)麻煩。實(shí)際上，如果你不是非常強(qiáng)調(diào)蛋白的分泌有什么生理功能，一般不建議檢測(cè)上清，尤其半定量的WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同樣品間的差異。這里面有實(shí)驗(yàn)操作細(xì)節(jié)的麻煩經(jīng)驗(yàn)之談，我曾經(jīng)參與的cancer cell文章所研究的蛋白就是分泌型蛋白，但90%的數(shù)據(jù)是cell lysis；偶爾用到上清，也只是作為富集純化該蛋白的原料，為進(jìn)一步分析做準(zhǔn)備。樣品制備完，應(yīng)立即低溫保存（-20度短期（幾天）；-80度長(zhǎng)期；例外，IP用樣品應(yīng)直接進(jìn)行IP，避免凍融破壞蛋白質(zhì)間弱的相互作用）。SDS LB煮沸過(guò)的樣品凍融會(huì)存在另一個(gè)問(wèn)題，SDS沉淀；SDS 4度就會(huì)沉淀，何況-80度。上樣前應(yīng)加熱充分溶解，否則從加樣口向下拖帶（SDS LB不夠，樣品未充分溶解也會(huì)出現(xiàn)類似拖尾；上樣過(guò)大也會(huì)）。在樣品制備過(guò)程中，另一個(gè)需要注意的問(wèn)題是，從樣品制備的起始階段就要注意定量問(wèn)題；WB本身系統(tǒng)誤差有20%，太細(xì)微的差別經(jīng)常忽略不計(jì)。細(xì)胞樣品可以先計(jì)數(shù)再接種，短時(shí)間內(nèi)即使細(xì)胞生長(zhǎng)有差異也不會(huì)對(duì)WB結(jié)果影響太多。組織樣品，從腫瘤組織的大?。ǚQ重）開(kāi)始，裂解液的體積都是精確定量的，操作過(guò)程也盡量避免蛋白損失。有人會(huì)說(shuō)可以電泳前蛋白定量，我將下一節(jié)討論蛋白定量的不科學(xué)性，以及裂解液成分對(duì)定量的干擾?！狙a(bǔ)充1】：細(xì)胞有凋亡或生長(zhǎng)速率差異時(shí)，有一個(gè)最直接的辦法針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，實(shí)際上將細(xì)胞收集下來(lái)以后，經(jīng)過(guò)離心，去除PBS，這時(shí)候你可以拿出事先準(zhǔn)備好的標(biāo)準(zhǔn)體積去比對(duì)，誤差小于50ul的（因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)品差值可以設(shè)定為50ul),所以基本上肉眼偏差至多只有10ul（細(xì)胞體積），這種小差別在WB結(jié)果中可以忽略不計(jì)。其實(shí)標(biāo)準(zhǔn)品有多種好處，平時(shí)可以用于離心時(shí)平衡；可以廢物利用一些用過(guò)的effendorf管。最好不要用純水做標(biāo)準(zhǔn)品，我喜歡稀釋一些SDS LB做標(biāo)準(zhǔn)品，因?yàn)橛兴{(lán)黑色對(duì)比下，可以更精確估計(jì)體積。這相對(duì)比測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，再一一讀值還是快很多；蛋白電泳：電泳膠的制備、配方、緩沖液配方，請(qǐng)參考分子克隆。經(jīng)驗(yàn)之談，8%膠最底邊約36KDa，10%最底邊約25KDa，12%最底部約12KDa。8%膠可以跑300KDa-36KDa之間的任意蛋白，轉(zhuǎn)膜效率對(duì)WB結(jié)果的的影響都問(wèn)題不大。12%，180KDa左右，轉(zhuǎn)膜效率對(duì)WB結(jié)果的影響都問(wèn)題不大（300KDa蛋白如何，沒(méi)有嘗試過(guò)）。電泳一般采用恒流，45mA-55mA（應(yīng)根據(jù)電泳儀器適當(dāng)調(diào)整，要注意儀器最高限壓；此條件適合gibco model V16型，膠寬20cm）。采用恒流的優(yōu)點(diǎn)，保證最快速度完成電泳（電壓會(huì)逐漸增大），省時(shí)且減少擴(kuò)散；但是由于電泳速度過(guò)快時(shí)會(huì)發(fā)熱而溶膠，所以你必須想辦法散熱。散熱不好，條帶出現(xiàn)波浪狀。注意事項(xiàng)：1聚丙烯酰胺的30%母液會(huì)降解，要4度避光保存。2APS會(huì)失效，10%APS一般保質(zhì)期才一個(gè)月左右。-20度分裝長(zhǎng)期保存。3注意Tris buff的PH值，以及平時(shí)所用的水的PH值。PH值改變會(huì)使帶型非常怪異，所有蛋白和溴酚藍(lán)壓成一條細(xì)線（即便在分離膠中），如果溴酚藍(lán)前有紅色染料，那么此染料彗星式拖尾從溴酚藍(lán)一直延伸到膠底部（溴酚藍(lán)此時(shí)涌動(dòng)極緩慢，位于膠中上部）4上下層式電泳裝置若漏液，哪邊漏液，電泳條帶往哪邊傾斜。內(nèi)外式電泳裝置漏液，則裝置處于短路狀態(tài)，液體會(huì)過(guò)熱。SDS-PAGE膠可能局部自溶，條帶扭曲、變形。5配膠用玻璃板和邊條應(yīng)及時(shí)洗凈。玻板未洗凈的壞處很多。盡管玻璃看似平滑，但是一些細(xì)微的凹陷處會(huì)凝結(jié)肉眼無(wú)法分辨的膠顆粒（摸上去疙疙瘩瘩），其壞處是，在該部位極易導(dǎo)致不均勻的膠塊，樣品經(jīng)過(guò)該處或電泳散熱不好，條帶變形。如果是RNA的超薄膠，膠板的顆粒會(huì)導(dǎo)致局部巨大氣泡，非常難于清除；蛋白膠也會(huì)導(dǎo)致一些小氣泡的產(chǎn)生。玻板沒(méi)洗凈的另一個(gè)壞處是，由中學(xué)物理知識(shí)可知，玻璃表面越光滑粘附越牢，未洗凈的玻板會(huì)削弱和膠體間的粘附力，拔梳子或邊條時(shí)會(huì)產(chǎn)生微小的錯(cuò)動(dòng)，膠體下部出現(xiàn)大量氣泡（夾在玻板和膠之間，這個(gè)關(guān)系不大）；嚴(yán)重的錯(cuò)動(dòng)會(huì)使上樣時(shí)，樣品從膠和玻璃之間的間隙漏光，或者甚至膠和玻板分開(kāi)。為避免拔梳子時(shí)的錯(cuò)動(dòng)，可在電泳緩沖液中拔梳子（比水更好，有SDS潤(rùn)滑）。判斷玻板是否洗干凈，用手摸一下有沒(méi)有疙疙瘩瘩的；最好用洗潔精之類，洗衣粉、肥皂都不好用。6上樣時(shí)，不要把tip深入膠孔過(guò)深（或者采用細(xì)的尖端拉長(zhǎng)的專用上樣槍頭），可能會(huì)錯(cuò)開(kāi)膠和玻板，樣品會(huì)泄露。7未加樣的孔應(yīng)添加高濃度SDS LB平衡，否則最外側(cè)條帶會(huì)拉寬變形。通常20ul樣品（含5ul 4*SDS LB），可用8-8.5ul 4*SDS LB平衡。同理，點(diǎn)marker的lane也要加入同樣體積的LB。LB若在室溫放置太久和新鮮的在比重上會(huì)有差異，在新舊LB靠近的地方，條帶會(huì)拉寬或擠壓變形。因此，同一塊膠上，煮樣及填空白所用LB應(yīng)一致。LB應(yīng)-20度保存。8增加上樣量不一定會(huì)提高熒光信號(hào)強(qiáng)度。增加上樣量的后果通常只能是讓你的內(nèi)參粘連，所有的蛋白條帶都扭曲變形。因?yàn)樵黾由蠘恿孔疃嘀荒芴岣邘妆叮鳺B靈敏度是以10的幾次冪量級(jí)的，所有目的蛋白信號(hào)的唯一方案就是IP富集（可特異提高目的蛋白濃度數(shù)百數(shù)千倍，并去除其它雜蛋白干擾）。增加上樣量的另一個(gè)壞處是，本來(lái)高表達(dá)的蛋白，諸如內(nèi)參，在同樣WB條件下，可能出現(xiàn)熒光灼燒式粹滅（一晃而滅）或者條帶中空。仍以6孔板80%以上匯合度為例，細(xì)胞裂解液和SDS LB通常都是投入200ul（最少80ul，這樣面積的培養(yǎng)板如果裂解液投入太少，回收時(shí)的損失就太大，上樣就很難做到一致），而這種濃度條件下制備的樣品，電泳時(shí)上樣量要控制在5-6ul，最少2.5ul，最多10ul，10ul時(shí)內(nèi)參基本已經(jīng)開(kāi)始粘連成一條線，帶型出現(xiàn)波浪紋；當(dāng)然并非不可以多上樣，再多對(duì)WB結(jié)果影響不大（沒(méi)有的仍然沒(méi)有），且條帶都很丑。9. 不同樣品上樣時(shí)，可考慮將樣品體積調(diào)成一致或類似。如果一組IP樣品和一組細(xì)胞裂解液樣品，前者通常洗脫體積為15ul，剛好+5ul 4*SDS LB達(dá)到常規(guī)20ul上樣體積；后者第8點(diǎn)提到只上5ul，同樣+5ul SDS LB（比重同，不會(huì)互相擠壓），最好補(bǔ)加10ul DDW使總體積一致。通常這樣不同條件獲得的樣品，中間最好用“空白”泳道隔開(kāi)（空白僅指無(wú)蛋白，仍應(yīng)加入8-8.5ul 4*SDS LB），這樣才能確保每條帶都很美觀。10. SDS PAGE膠配好暫時(shí)不用時(shí)，需用電泳緩沖液灌滿空間（拔去梳子和底邊邊條后的間隙），用保鮮膜包裹防止液體蒸發(fā)，短期室溫或稍長(zhǎng)期4度保存。個(gè)人習(xí)慣為，灌好分離膠用飽和的正丁醇灌滿上層，保鮮膜包裹，次日再灌堆積膠。兩種方案都可以。所以如果預(yù)計(jì)次日工作量較大，可以提前灌好SDS PAGE。樣品是否一定需要定量再上樣？不是的，這是浪費(fèi)時(shí)間的一個(gè)操作。我們首先來(lái)討論一下蛋白定量的科學(xué)性。蛋白定量首先需要一個(gè)參照系（標(biāo)準(zhǔn)蛋白），參照蛋白通常選擇BSA，也就是說(shuō)你所謂的定量是對(duì)應(yīng)于BSA的濃度的一個(gè)參照值。這里面存在一個(gè)問(wèn)題，即忽略了蛋白折疊和空間構(gòu)象對(duì)光吸收、折射的影響；不同的蛋白折疊和構(gòu)象還會(huì)影響顏料分子的嵌入。因此你其實(shí)默認(rèn)將所有的蛋白等同于BSA在溶液中的折疊狀態(tài)、光吸收情況下，然后做出的一個(gè)相對(duì)判斷，這就存在一個(gè)“系統(tǒng)誤差”還不算上測(cè)量誤差等等，就已經(jīng)很不準(zhǔn)確了。其次，裂解組織或細(xì)胞的時(shí)候，那些裂解液中，某些溶劑本身會(huì)使Coomassie G250或者Bradford法（實(shí)際也是Coomassie染色）顯色，尤其是去污劑之類；例如NP40，就會(huì)使Coomassie顯藍(lán)色，可以完全覆蓋掉蛋白與Coomassie作用產(chǎn)生的藍(lán)色。因此，如果你的裂解液里面含有這類物質(zhì)，所謂的蛋白定量實(shí)際是NP40顏色和蛋白染色的疊加，根本不會(huì)符合標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線的線性規(guī)律，自然定不準(zhǔn)?！拘枰f(shuō)明：我目前只知道NP40會(huì)這樣，因?yàn)槲覀儚膩?lái)不去定量，沒(méi)有做過(guò)更深入的研究?！繉?shí)際上保證你的內(nèi)參一致，是從樣品制備開(kāi)始的，上節(jié)末尾有提到，不贅述。如果你從制備樣品時(shí)就注意過(guò)定量問(wèn)題，實(shí)際上通常內(nèi)參差別不會(huì)太大。如果真的有差別，通常我們會(huì)先跑少量的樣品，目的是讓Actin或tubulin更清晰、不會(huì)粘連、不會(huì)過(guò)曝光。從而在第二輪跑正式結(jié)果前，根據(jù)第一輪的內(nèi)參的熒光信號(hào)做微調(diào)，大致能做到相當(dāng)；最多可能需要第三輪。以上的試驗(yàn)可以精確到0.1ul差異（我很多體外生化試驗(yàn)之前的調(diào)整酶量就是這樣進(jìn)行，此時(shí)根本不可能有足夠的蛋白讓你去定量）。當(dāng)然憑曝光強(qiáng)弱調(diào)整上樣量的前提是，你的WB技術(shù)很穩(wěn)定，很可靠，這是需要相當(dāng)多的經(jīng)驗(yàn)積累，如果你一時(shí)掌握不了，可以讓經(jīng)驗(yàn)更豐富的師兄師姐或者導(dǎo)師幫忙。順便提到，有人問(wèn)過(guò)用Quantity One等定量軟件對(duì)光密度定量后計(jì)算差別從而調(diào)整上樣體積是否可以？不可以。 因?yàn)閃B結(jié)果經(jīng)過(guò)多重放大，精確計(jì)量只代表相對(duì)于對(duì)照組的相對(duì)比值，與實(shí)際比值還是有誤差，所以按計(jì)算值更改上樣量仍會(huì)出現(xiàn)偏差。如果非要做定量的話，要注意你的裂解液配方，把每種溶劑都先加入到顯色液中嘗試一下，避免那些本身會(huì)顯色的物質(zhì)出現(xiàn)在你的裂解液中；當(dāng)然，某些物質(zhì)的去除可能影響對(duì)組織蛋白的提取。所以這是一個(gè)兩難的問(wèn)題。轉(zhuǎn)印轉(zhuǎn)印效率對(duì)WB結(jié)果的影響并不如書(shū)本和網(wǎng)絡(luò)上宣揚(yáng)的那么大！首先必須澄清的是，很多時(shí)候新手會(huì)把WB結(jié)果無(wú)信號(hào)歸咎于轉(zhuǎn)膜不夠充分，實(shí)際上轉(zhuǎn)膜效率對(duì)最終結(jié)果的影響所占比重并不高，真正取決定性因素的是抗體識(shí)別能力的強(qiáng)弱，以及如何正確使用抗體，這個(gè)問(wèn)題下節(jié)討論。有一個(gè)簡(jiǎn)單的例證，Biorad提供的3mm厚濾紙初次使用時(shí)，通常轉(zhuǎn)膜效果不理想（從預(yù)染的marker深淺可知），但對(duì)多數(shù)一般豐度的蛋白的檢測(cè)沒(méi)有任何影響（建議少用這種新濾紙做那種含量特別稀少或者轉(zhuǎn)膜非常困難的蛋白）。沒(méi)有很好的策略可以解決這個(gè)新濾紙的問(wèn)題；嘗試過(guò)浸泡（會(huì)泡爛的）、預(yù)電泳（會(huì)稍微好點(diǎn)）等等，效果均不理想。通常，最初一兩次的使用就是用于轉(zhuǎn)一般蛋白。每次用完后清水稍微沖洗一下表面鹽分（要控制水流；水流太大，紙張會(huì)爛掉的），晾干再用；只要沒(méi)沖爛可以一直反復(fù)使用。其次，盡管轉(zhuǎn)膜效率不起決定性作用，但由于WB的流程相對(duì)較長(zhǎng)，所以每個(gè)步驟的疊加作用會(huì)被級(jí)數(shù)放大，因此在試驗(yàn)的每個(gè)步驟我們?nèi)詴?huì)力求更好，因此以下仍會(huì)深入探討如何提高轉(zhuǎn)膜效率。針對(duì)提高轉(zhuǎn)膜的效率，個(gè)人認(rèn)為最先應(yīng)該考慮到的是儀器的選用。這里不是歧視“made in China”，國(guó)內(nèi)的廠家很少注重不斷提高自己產(chǎn)品的品質(zhì)，走低端策略，對(duì)于電泳儀這種技術(shù)含量不高的儀器倒可以湊合；但說(shuō)到轉(zhuǎn)膜儀，能把一個(gè)簡(jiǎn)單的勻場(chǎng)電極做好的還真不多（就我道聽(tīng)途說(shuō)的，國(guó)外廠家為了使電極之間場(chǎng)強(qiáng)更加均勻，那種大塊金屬板表面是鍍過(guò)極薄的白金層）；因此轉(zhuǎn)膜效率和均勻方面孰優(yōu)孰劣不言而喻。目前，個(gè)人使用過(guò)的國(guó)產(chǎn)電轉(zhuǎn)槽（濕轉(zhuǎn)）唯Tanon仿Biorad的還可以（算替它們免費(fèi)打個(gè)廣告吧，Tanon仿biorad mini3型電泳儀，在某些方面（主要是操作）上還優(yōu)于Biorad原裝；目前我認(rèn)為“中國(guó)制造”的靈魂就是仿造并超越前者）；半干轉(zhuǎn)儀一律進(jìn)口，用過(guò)Biorad、amersham和英國(guó)公司的scieplas。PS：批評(píng)一下Biorad。Biorad的半干轉(zhuǎn)儀，其硬質(zhì)塑料外殼會(huì)莫名其妙的碎裂（絕非摔裂、磕碰，因?yàn)榈酌嬉话惴旁谧郎虾蟪ㄆ谛枰逑慈コ龤埩酐}漬，基本不會(huì)移動(dòng)；即便如此它自然就會(huì)碎裂），以致于其核心組件未壞的情況下，因外殼碎裂不得不報(bào)廢該儀器（其外殼里包裹電源線，外殼碎裂，電源則無(wú)法接通，導(dǎo)致儀器報(bào)廢我們先后買(mǎi)過(guò)3臺(tái)都是這樣的毛病，其間間隔了3年，不能肯定近來(lái)Biorad有沒(méi)有改進(jìn)這個(gè)問(wèn)題；如果沒(méi)有，我想市場(chǎng)遲早會(huì)被其他公司所取代）對(duì)這三款產(chǎn)品，Biorad的外殼有明顯的質(zhì)量缺陷，容易過(guò)早報(bào)廢；amersham獨(dú)特的蜂窩式設(shè)計(jì)確實(shí)對(duì)轉(zhuǎn)膜效率有所提高，但蜂窩式使得與“三明治”的接觸面減少，電轉(zhuǎn)時(shí)散熱不太好，做大蛋白（半干轉(zhuǎn)儀也可以做大蛋白轉(zhuǎn)膜，效率確實(shí)不如濕轉(zhuǎn)，但抗體好、蛋白豐度一般時(shí)仍可采用）長(zhǎng)時(shí)程（3hrs）轉(zhuǎn)膜需要在4度冰柜或cold room進(jìn)行；英國(guó)的產(chǎn)品，價(jià)格較高，公司不太出名國(guó)內(nèi)不一定有代理，但質(zhì)量和散熱都非常好。這里談到了半干轉(zhuǎn)和濕轉(zhuǎn)。這兩種轉(zhuǎn)印方法各有優(yōu)劣。濕轉(zhuǎn)適合所有的蛋白，轉(zhuǎn)膜效率最佳，但靡費(fèi)試劑、溶液，對(duì)普通分子量大小的蛋白轉(zhuǎn)染操作時(shí)間長(zhǎng)于半干轉(zhuǎn)（下文會(huì)具體給出條件）；半干轉(zhuǎn)適合分子量較小的蛋白，省時(shí)、省試劑。蛋白分子大小如何界定呢？習(xí)慣上認(rèn)為150KDa以上為大蛋白，其他均屬于小蛋白，當(dāng)然這只是一個(gè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)。因此，通常對(duì)大蛋白的轉(zhuǎn)印多數(shù)人會(huì)選擇長(zhǎng)時(shí)程的濕轉(zhuǎn)，那么剛才提到的amersham半干轉(zhuǎn)儀的缺陷實(shí)際上沒(méi)太多實(shí)質(zhì)意義，何況還可以外加條件彌補(bǔ)；而且用半干轉(zhuǎn)做大蛋白轉(zhuǎn)印本來(lái)就是高手在懸崖上跳舞，此時(shí)轉(zhuǎn)膜效率是否更高已經(jīng)沒(méi)有任何意義我說(shuō)過(guò)轉(zhuǎn)印效率對(duì)WB結(jié)果不起決定因素。濕轉(zhuǎn)、半干轉(zhuǎn)緩沖液配方請(qǐng)參考分子克隆，有必要指出的是，實(shí)際上用半干轉(zhuǎn)緩沖液進(jìn)行濕轉(zhuǎn)效果也非常理想，通常這種緩沖液可以反復(fù)使用多次（30V，35V附近的時(shí)候，保險(xiǎn)會(huì)自動(dòng)跳掉、切斷電轉(zhuǎn)儀電源。至于UK的，即使整張大板膠室溫電轉(zhuǎn)3hr以后，最大電壓仍為18V（因此足見(jiàn)其散熱性能的優(yōu)良）。注明：以上半干轉(zhuǎn)儀時(shí)間的要求是針對(duì)PVDF膜的，這里面有一個(gè)很有趣的問(wèn)題。盡管廠家一再表明PVDF膜比NC膜對(duì)蛋白的截留更高（但NC帶負(fù)電性，理論上它的吸附量應(yīng)該更高，所以通常同樣使用TBST這種低鹽洗液背景比PVDF膜高），但PVDF膜對(duì)小分子的截留明顯不如NC膜，因此交聯(lián)在預(yù)染marker上的顏料小分子很容易穿過(guò)PVDF膜，造成轉(zhuǎn)膜過(guò)度的假象（除可考慮提升甲醇濃度至25%外，也可以考慮增加marker的上樣量）；NC膜沒(méi)有這種問(wèn)題，所以通常它的轉(zhuǎn)膜時(shí)間也是小蛋白1hr、大蛋白3hrs，電流控制在200-300mA（16cm*9cm大膠300mA，如果膠面積小很多可以考慮降低，實(shí)際上相當(dāng)于2.5-3mA/cm2左右）。NC膜唯一不如PVDF膜的地方，在我看來(lái)是它的強(qiáng)度：干燥的膜易碎。當(dāng)然目前某些廠家為解決這個(gè)問(wèn)題，將NC成分涂在另一種介質(zhì)的表面，這種膜的支持強(qiáng)度和PVDF膜類似，但轉(zhuǎn)膜效率稍差于純NC膜，且有明顯的正反面；因此制作轉(zhuǎn)印三明治的時(shí)候要特別注意正反面。此外，20KDa以下的蛋白宜采用0.22uM孔徑的轉(zhuǎn)印膜，但也不是一定必須。對(duì)于大蛋白轉(zhuǎn)印，很多書(shū)本建議采用低濃度膠，如6% SDS-PAGE。但實(shí)際操作發(fā)現(xiàn)，6%太軟，制作轉(zhuǎn)印三明治的操作非常麻煩；且內(nèi)參如Actin、tubulin都在45KDa附近，而6%膠底邊溴酚藍(lán)指示60KDa左右，除非采用壇子上有人提過(guò)的灌不同濃度的膠或者梯度膠，否則需要同時(shí)跑兩塊膠，因此也不是很推薦。個(gè)人經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為300KDa以下8%膠（底邊36KDa）都可以勝任，可以適當(dāng)調(diào)整選擇7-8%膠可以兼顧內(nèi)參和大蛋白。轉(zhuǎn)膜最好在低溫進(jìn)行（高溫會(huì)局部溶膠或降低轉(zhuǎn)膜效率），盡管很多半干轉(zhuǎn)儀沒(méi)有具體要求，但用預(yù)冷過(guò)的電轉(zhuǎn)液濕濾紙比未預(yù)冷的轉(zhuǎn)印效率更高。因此，有條件建議濕轉(zhuǎn)、半干轉(zhuǎn)均在低溫（4度）進(jìn)行。此外，濕轉(zhuǎn)緩沖液可以考慮轉(zhuǎn)印前-20度預(yù)冷，時(shí)間不能長(zhǎng)于2hrs，否則電泳液凍結(jié)；mini3型有內(nèi)置冰槽的，冰槽置-80度預(yù)冷。制作轉(zhuǎn)膜三明治的過(guò)程中，書(shū)中強(qiáng)調(diào)過(guò)濾紙、膠、膜的大小最好一致，否則沒(méi)有膠、膜隔開(kāi)部分的濾紙會(huì)因?yàn)橹苯咏佑|而產(chǎn)生局部短路，降低內(nèi)阻增加電（壓）流，造成升溫過(guò)快。但進(jìn)口儀器隨廠原包裝附帶的濾紙有限，如果每次都切割新濾紙，消耗過(guò)快、初次使用的膜轉(zhuǎn)膜效率不高，且增加額外的操作。因此，實(shí)際上濾紙大一些也不太要緊，但是我會(huì)選擇已經(jīng)切割好的和膠面積最接近的濾紙；通常膜的大小會(huì)嚴(yán)格控制在與膠面積一致或略小一點(diǎn)點(diǎn)。操作時(shí)在保證每一層均無(wú)氣泡的前提下，疊好后再碾壓幾個(gè)來(lái)回，力道要均勻、恰好；力量過(guò)大，膠會(huì)被拉伸，條帶會(huì)扭曲、變形。碾壓的目的不是為了驅(qū)趕氣泡（完全可以做到疊加的時(shí)候每一層都無(wú)任何氣泡；諸如采用多層薄濾紙時(shí)可以一張張的疊加），更重要的作用是讓膜和膠貼得更緊密?？梢岳斫獾氖牵瑢?duì)于蛋白分子的大小而言，膠和膜之間的間距是數(shù)十萬(wàn)倍計(jì)的，因此更緊密的接觸無(wú)疑是轉(zhuǎn)膜成敗的關(guān)鍵。膠和膜需不需要泡呢？不少公司實(shí)驗(yàn)講座時(shí)提出泡膠、泡膜，實(shí)際操作中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)泡和不泡的轉(zhuǎn)膜效率有多大差別。實(shí)際上，膠只需要在電轉(zhuǎn)液中浸一下即可（可以減少與濾紙或者膜之間的氣泡）；而膜也只要濕掉沾上電轉(zhuǎn)液即可，同樣多沾些緩沖液會(huì)有利于減少氣泡（PVDF要先用甲醇濕潤(rùn)再投入緩沖液；NC直接進(jìn)緩沖液）。如何監(jiān)控轉(zhuǎn)膜的效率呢？在早期，鄙人亦依據(jù)分子克隆的介紹，采用立春紅染膜。只是后來(lái)發(fā)現(xiàn)此操作不僅增加額外的操作時(shí)間，而且不能說(shuō)明任何問(wèn)題，于是拋棄之。首先，立春紅（也包括考染膠）的靈敏度和HRP-ECL體系的靈敏度相差太遠(yuǎn)，即使立春紅染膜無(wú)顏色，也無(wú)法提示W(wǎng)B結(jié)果會(huì)不會(huì)失敗（考染膠無(wú)顏色也不能說(shuō)明轉(zhuǎn)膜充分了，除非你銀染），你仍然得繼續(xù)后面的操作；相反靶蛋白區(qū)域有顏色，亦無(wú)法提示靶蛋白就轉(zhuǎn)膜完全了，也許只是另外一個(gè)分子量大小相近的蛋白。因此，無(wú)論立春紅染膜失敗或成功，你都必須進(jìn)行后續(xù)的操作。而立春紅染膠不僅增加額外的操作時(shí)間，而且增加一輪漂洗的操作，對(duì)膜和膜上的蛋白都不好。那么為什么不采用更直觀的預(yù)染marker做轉(zhuǎn)膜監(jiān)控的依據(jù)呢？理論上，同時(shí)轉(zhuǎn)膜、顏色是交聯(lián)到蛋白上的，因此顏色有多深表明有多少蛋白轉(zhuǎn)印到膜上，非常直觀、不會(huì)增加任何額外的操作（固定marker的上樣量非常必要）。當(dāng)然上面提到針對(duì)PVDF膜，由于對(duì)小分子截留的局限，顏料分子會(huì)在高強(qiáng)度的轉(zhuǎn)印過(guò)程中從交聯(lián)的蛋白上脫落并穿過(guò)膜（顏料與蛋白交聯(lián)得過(guò)深會(huì)使整個(gè)lane糊掉；太緊（多）可改變蛋白構(gòu)象使遷移率改變。所以多數(shù)情況下顏料和蛋白之間是一種不穩(wěn)定的交聯(lián)，這意味著在某些條件下，顏料會(huì)從交聯(lián)的蛋白上脫落，又因?yàn)槟し肿涌讖揭约澳?duì)不同物質(zhì)吸附能力的差異，顏料小分子會(huì)輕易穿過(guò)膜到濾紙背面，而蛋白則被牢固的截留在膜上），造成轉(zhuǎn)膜過(guò)度的假象?，F(xiàn)在你知道有這種局限，要么更換NC膜；要么采用上面提到的非常穩(wěn)定的轉(zhuǎn)膜條件、注意必要的細(xì)節(jié)，就可從根本上忽略掉其對(duì)轉(zhuǎn)膜效率的指示，而把預(yù)染的marker僅僅作為一個(gè)分子量大小的指針，當(dāng)然同時(shí)可確認(rèn)之前的轉(zhuǎn)膜操作無(wú)誤（沒(méi)有插反電極，放反膜），也可為后續(xù)抗體孵育操作時(shí)膜的正反面做必要的提示。不同公司預(yù)染的marker效果不太相同，一般NEB和invitrogen的常規(guī)分子量預(yù)染marker要上8-10ul，MBI的只要5ul（膠大小2030cm），Bioradmini3型（8.27.4cm)MBI最低2.5ul轉(zhuǎn)膜后就足夠清晰?？贵w孵育WB真正的難點(diǎn)：抗體的使用是一種藝術(shù)，一種抗體一個(gè)脾氣。對(duì)WB結(jié)果有決定性影響的因素是抗體的效價(jià)和如果正確使用手中的抗體。無(wú)論你如何提高自己的轉(zhuǎn)膜技術(shù)，高效和低效之間往往只有數(shù)倍的差異，而抗體的效價(jià)可以差數(shù)千倍以上；同樣，正確使用抗體可以保證抗體效價(jià)不被過(guò)分的拮抗，謀求特異性和非特異性背景之間差異的最大化。封閉最短可以縮減到5min：很多人把高背景或者黑板，認(rèn)定為封閉不充分，其實(shí)這也是沒(méi)有吃透WB（說(shuō)實(shí)話，經(jīng)常看到壇子上很多人這樣給人答疑，非常的無(wú)語(yǔ)）；實(shí)際上封閉（極端點(diǎn)）也是個(gè)可有可無(wú)的步驟，真正對(duì)降低背景起核心作用的是抗體稀釋液中的組分。當(dāng)你的抗體使用次數(shù)較多時(shí)，基本不用封閉也可以有較低的背景；如果抗體很新，其實(shí)封閉最短可以縮減到5min（沒(méi)試過(guò)更短的，不一定不可以）。那什么導(dǎo)致高背景甚至黑板呢？抗體的質(zhì)量不太好（主因），或者抗體稀釋液的配方有問(wèn)題（增大抗體稀釋比略微有所改善）。封閉液的配方可以和抗體稀釋液相同，也可以不同；通常封閉液是最簡(jiǎn)單（單方）的抗體稀釋液，而抗體稀釋液可能是復(fù)方。封閉很少出狀況。不過(guò)在milk做封閉劑的封閉液中，milk顆粒未完全溶解時(shí)，微小的顆粒會(huì)粘附在膜上增加星點(diǎn)狀背景。緊接封閉操作的是抗體孵育，之間不要用TBST漂洗。抗體孵育成敗的關(guān)鍵首要在抗體本身的質(zhì)量，包括抗體的效價(jià)和背景的強(qiáng)弱，然而歷來(lái)商品化的抗體質(zhì)量參差不齊。各家生產(chǎn)的抗體中質(zhì)量問(wèn)題最嚴(yán)重的是scbt的抗體，但它們的價(jià)格卻是最便宜的。其實(shí)，scbt在美國(guó)的售后服務(wù)還是相當(dāng)不錯(cuò)的，只要按他們的要求操作仍然能舉證抗體的質(zhì)量問(wèn)題，可以更換、交換（你指定的他們銷售的另外一種抗體），有時(shí)候還會(huì)附送一些ProA beads之類的，所以不奇怪它的普及率；也正因?yàn)榇?，如果你參考文獻(xiàn)的話很容易找到這家公司的。可惜，在國(guó)內(nèi)代理商不可能提供相應(yīng)的服務(wù)，因此購(gòu)買(mǎi)他們的商品存在不小的風(fēng)險(xiǎn)。所以，通常我更推薦sigma和Abcom、R&D等。諸如Sigma公司銷售的Actin，cat. A5316，clone AC-74，Mab更是作為新手練習(xí)專用的抗體；它的背景很低，效價(jià)很高，可以1：30,000稀釋（是普通一抗效價(jià)的30倍）。此外，盡管cell signaling是做磷酸化抗體起家的公司，但它們的抗體的質(zhì)量總體感覺(jué)也不好，所以有其它公司可以選擇時(shí)，我們會(huì)刻意避免購(gòu)買(mǎi)cell signaling的產(chǎn)品，諸如Akt總抗和Ser473（這兩種抗體R&D的產(chǎn)品效價(jià)不錯(cuò)）。（特別注明：前幾年CST的AKT抗體識(shí)別的條帶在55KDa左右，而其他公司均認(rèn)定為60KDa；最近還有戰(zhàn)友提問(wèn)這個(gè)抗體，重新檢索了一下，應(yīng)該是原AKT抗體（包括磷酸化）已經(jīng)被CST自己下架了，從目前的幾個(gè)抗體示意圖看，大小也已與其他公司一致；因此，要不要買(mǎi)取決你自己）抗體公司在出售抗體的時(shí)候，在廣告上會(huì)玩很多花樣。A.不給整張膜標(biāo)記的圖示。很多抗體質(zhì)量不好，背景高雜帶多，如果靶蛋白區(qū)域較干凈時(shí)，他們通常只給很窄的一條靶蛋白區(qū)域的圖例。B.不給內(nèi)源性蛋白標(biāo)記的圖示，用IP的樣品取代。通過(guò)IP可以富集抗原，減少雜蛋白，通常很容易拿到背景很干凈，信號(hào)很強(qiáng)的圖例。C.用制備抗體時(shí)高表達(dá)的多肽做陽(yáng)性樣品，不給全長(zhǎng)蛋白的圖例。由于多肽可以IP富集，且不存在空間折疊的問(wèn)題（通常裸露在外），因此很容易標(biāo)記。除以上花樣外，不少抗體用途上還有局限，因此挑選抗體時(shí)要睜大眼睛。此外，有一點(diǎn)值得注意的是，scbt銷售的抗體表面上很多（通常1ml，而別的公司通常是200ul或者100ul），然而實(shí)際上它的濃度也僅為0.2，所以實(shí)際上他們抗體的質(zhì)量也和其他公司的沒(méi)區(qū)別都是200ug（常規(guī)）。所以在早期，我一直強(qiáng)調(diào)如果固定即用型一抗的濃度（稀釋的一抗）為1ug/ml時(shí)，scbt的抗體最佳稀釋比為1：200。不過(guò)近來(lái)發(fā)現(xiàn)，實(shí)際上他們的抗體1:2K稀釋效價(jià)也不錯(cuò)，因此也許其他公司的一抗可以進(jìn)一步提高稀釋比?，F(xiàn)在判斷當(dāng)時(shí)scbt抗體之所以采用1:200稀釋，實(shí)際上是因?yàn)樽灾频腅CL不夠靈敏，所以建議用靈敏性更好的ECL，這樣可以減少抗體的消耗量，進(jìn)一步降低實(shí)驗(yàn)成本。一抗通常4度過(guò)夜，效率較常溫1-1.5hrs高；二抗通常1:5K稀釋，室溫0.5-1hr（過(guò)久并不會(huì)明顯提高信號(hào)強(qiáng)度甚至?xí)p弱（相當(dāng)于洗膜），同時(shí)造成高背景進(jìn)一步影響特異與非特異熒光信號(hào)強(qiáng)度間的對(duì)比。孵育時(shí)間過(guò)久還會(huì)迫使你延長(zhǎng)TBST的時(shí)間，這對(duì)抗原識(shí)別能力較弱的抗體更致命）。洗膜通常用TBST，也可以考慮高鹽洗膜液（NaCl 0.5M）；洗膜時(shí)間一般10min*3或者5min*4?？贵w孵育和洗膜時(shí)，搖床速度不能過(guò)快也不宜過(guò)慢，需要簡(jiǎn)單摸索一下。聊完以上那些淺顯的基本常識(shí)，接下來(lái)談我認(rèn)為最麻煩的：首先，抗原抗體識(shí)別原理的物理學(xué)解釋，抗體孵育過(guò)程實(shí)際上就是一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。由于抗原和抗體特異性結(jié)合的效率是非特異性結(jié)合的數(shù)百萬(wàn)數(shù)十億倍，所以當(dāng)特異性抗體與非特異性抗體（不好描述，指添加在抗體稀釋液中的封閉蛋白，我們可以把它們看成非特異性的一抗）競(jìng)爭(zhēng)時(shí)，盡管抗體稀釋液中封閉蛋白的濃度是一抗?jié)舛?0K：1以上，在碰撞幾率相同的條件下，由于時(shí)間的積累加孵育過(guò)程中反復(fù)漂洗（孵育抗體要搖晃，對(duì)吧），特異性一抗積累了識(shí)別、結(jié)合優(yōu)勢(shì)。同樣在TBST等漂洗的情況下，由于親和力等原因，使得一抗很牢靠并進(jìn)一步增加對(duì)比優(yōu)勢(shì)，再經(jīng)過(guò)2抗特異性積累和ECL的最終放大形成特異性條帶和非特異性背景之間熒光信號(hào)的巨大差異。由以上碰撞結(jié)合、親和力差異這些基本現(xiàn)象，我們可以解釋W(xué)B中出現(xiàn)的現(xiàn)象。1.在樣品制備章節(jié)中，我強(qiáng)調(diào)PBS漂洗去培養(yǎng)基中BSA的作用。當(dāng)時(shí)只描述了不漂洗的后果，是在BSA位置任何抗體都可以非特異性的結(jié)合從而顯影。用碰撞的原理去解釋：當(dāng)雜帶很濃的時(shí)候，抗體的特異性已經(jīng)毫無(wú)意義，它只符合物理定律中的碰撞幾率原理；因?yàn)槟愕碾s帶濃，碰撞幾率大，粘附一抗的機(jī)會(huì)多，因此它就會(huì)顯出來(lái)，但切記這是雜帶。當(dāng)雜蛋白含量高到一定程度，“任何”一種一抗都可以在該位置顯出條帶。因此，用條帶的深淺去判斷是否是靶蛋白，這是非常不科學(xué)的。在默認(rèn)抗體有效的情況下，如果抗原靠近區(qū)域沒(méi)有雜帶，背景干凈，依據(jù)分子量大小可以初步確認(rèn)靶蛋白的位置；如果有雜帶，并不一定是特異性條帶就比雜帶亮，也許雜帶蛋白濃度大，非特異性粘附的一抗更多。目前判斷雜帶和靶蛋白的唯一標(biāo)準(zhǔn)是分子量；而當(dāng)分子量大小類似時(shí)，只有通過(guò)增加過(guò)表達(dá)或IP純化的樣品做陽(yáng)性對(duì)照，或者KD該蛋白的樣品做陰性對(duì)照一起電泳轉(zhuǎn)膜，才能準(zhǔn)確區(qū)分靶蛋白和雜質(zhì)。（用IP或KD樣品也是驗(yàn)證商品化抗體是否有效的可靠方案）【補(bǔ)充2】：如何確定靶蛋白分子量？由1的解釋可知，雜帶比靶蛋白熒光信號(hào)強(qiáng)且干凈一點(diǎn)也不意外，而經(jīng)常不同的公司對(duì)同一靶蛋白給出不同的分子量，那么如何確定新上手不熟悉的靶蛋白的分子量呢？A. 用“過(guò)表達(dá)或IP純化的樣品做陽(yáng)性對(duì)照”，這是最靠譜的方案。B. 沒(méi)有純化蛋白做對(duì)照時(shí)，對(duì)一個(gè)蛋白的分子量判斷一般有這樣幾步：a.根據(jù)氨基酸長(zhǎng)度自己預(yù)測(cè)，如300aa，分子量應(yīng)為33KDa；以這個(gè)分子量為基準(zhǔn)進(jìn)行第二步。b.去抗體公司網(wǎng)站search說(shuō)明書(shū)。一般先不要有偏向性，google abcam、Sigma，R&D以及millipore或者其他的scbt，benthyl等等等等吧，很快你至少可以發(fā)現(xiàn)3家是一致或接近的（諸如52KDa，有的寫(xiě)54KDa，有的51KDa，這些都可以算作一樣，因?yàn)楸碛^分子量也是對(duì)應(yīng)marker的相對(duì)估算，會(huì)有一點(diǎn)點(diǎn)差異；尤其當(dāng)不同公司給的marker在靶蛋白區(qū)域上下差別很大時(shí)，比如，你的蛋白100KDa，有的公司在此區(qū)間的marker是180KDa直接jump到80KDa，有的可能中間多一條120KDa，那么這兩種marker估算的表觀分子量可能差10KDa以上尤其蛋白較大時(shí)，膠濃度又不低，分離會(huì)不太好，一些距離的細(xì)微差異，在軟件估算表觀分子量時(shí)偏差可能很大；其他蛋白這類問(wèn)題不多，因?yàn)橥ǔＩ唐坊膍arker在120KDa以下指示條帶較為密集，而且一般濃度的膠對(duì)這些區(qū)段分離都很好，所以估算的表觀分子量差別不大，如上述52KDa例子），那么最終的表觀分子量基本就是你檢索到的。如果和1中一致，那么完全不用懷疑；如果不一致，有條件再用純化的含標(biāo)簽的蛋白做驗(yàn)證，沒(méi)有基本也可以follow多數(shù)意見(jiàn)必須指出，很多抗體公司在具體到每一種抗體的說(shuō)明書(shū)時(shí)常見(jiàn)虛假?gòu)V告的嫌疑，“恁把雜帶當(dāng)靶蛋白”（最搞的情況是同一公司同一靶蛋白，可能有用不同區(qū)段制備的靶蛋白的抗體，而這幾種抗體識(shí)別的靶蛋白分子量還很不一致），所以請(qǐng)follow多數(shù)意見(jiàn)。C. 蛋白一般只可能因?yàn)樾揎椣蛏线w移，所以表觀分子量比根據(jù)氨基酸長(zhǎng)度計(jì)算值高常見(jiàn)；反過(guò)來(lái)，如果表觀分子量比計(jì)算值還低，多半就是雜帶；除非你的蛋白會(huì)降解，或者有的蛋白在ORF里面還有一個(gè)翻譯起始位點(diǎn)。經(jīng)驗(yàn)之談，對(duì)于不熟悉的蛋白，通常都要小心求證，尤其在開(kāi)始階段；有條件的話，換個(gè)抗其他區(qū)段的同一蛋白的抗體或者其他來(lái)源（Rab、Gab、Mab）同一蛋白的抗體標(biāo)記試試，兩種抗體能識(shí)別同一雜帶的概率還是很小的，尤其不同來(lái)源的，因?yàn)榇藭r(shí)二抗也要相應(yīng)更換，幾率更小。 2.WB結(jié)果白板（無(wú)信號(hào)）和黑板（高背景）。從抗體孵育角度解釋白板和黑板問(wèn)題（當(dāng)然也可能與ECL顯影有關(guān)，此點(diǎn)下一節(jié)有闡述），白板主要是可能是抗體本身效價(jià)不高，或者抗體稀釋液中封閉蛋白過(guò)多，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合時(shí)封閉蛋白完全擠掉了特異性的一抗，特異性條帶和非特異性背景同樣結(jié)合強(qiáng)度無(wú)信號(hào)。黑板，也主要是因?yàn)榭贵w效價(jià)不高，而抗體稀釋液中封閉蛋白的拮抗作用又沒(méi)有完全發(fā)揮，此時(shí)無(wú)法有效識(shí)別抗原的一抗會(huì)等效的粘附轉(zhuǎn)印膜的任何位置，顯影后整張膜全黑。有時(shí)候膜接近全黑，但可以若有如無(wú)的觀察到靶蛋白，出現(xiàn)問(wèn)題的原因雖然仍是抗體效價(jià)不高，封閉蛋白不能完全起到作用，不過(guò)此時(shí)可以通過(guò)改變抗體稀釋液的配方，提高特異性和非特異性結(jié)合的信號(hào)差異，降低背景。“這點(diǎn)非常重要”當(dāng)你的抗體標(biāo)不到抗原時(shí)（白板），先弄出條帶（黑板），再解決黑板（高背景）問(wèn)題。第一步應(yīng)該是通過(guò)倍比降低一抗的稀釋比（從1:1K降到1:500到1:250到。；注：二抗稀釋比不要輕易改變，增加二抗?jié)舛葘?duì)WB結(jié)果不會(huì)有太明顯的改變），摸索到一個(gè)可以標(biāo)出信號(hào)的條件。此時(shí)，由于一抗?jié)舛冗^(guò)高，背景可能非常高，但背景的問(wèn)題可以再調(diào)整，有沒(méi)有特異性條帶卻沒(méi)辦法改變；實(shí)在沒(méi)有靶蛋白的信號(hào)，只能更換別的公司生產(chǎn)的抗體。那么如何通過(guò)改變抗體稀釋液的配方，尋求抗體孵育的最佳條件呢？首先要認(rèn)清，抗體稀釋液沒(méi)有一個(gè)絕對(duì)通用的配方；一種抗體一個(gè)脾氣。其次，抗體稀釋液的配方要兼顧與特異性抗體競(jìng)爭(zhēng)抗原的強(qiáng)度，以及對(duì)其他區(qū)域的封閉強(qiáng)度兩方面的平衡。目前，抗體稀釋液中可以充當(dāng)封閉蛋白的主要有milk，BSA和gelatin，似乎很少的樣子 ?？墒牵阌袥](méi)有考慮過(guò)“復(fù)方”？這下配方無(wú)限多了吧。1. 采用milk，BSA和gelatin的單方。3% milk，5% BSA，=0.4%的gelatin，并根據(jù)實(shí)際情況改變（若出現(xiàn)白板，請(qǐng)降低封閉劑濃度。；黑板多加）。gelatin大家可能比較陌生，不過(guò)如果你翻翻抗體公司賣給你的原裝抗體里面液體的配方，你會(huì)發(fā)現(xiàn)很多抗體溶液里都有它。2.很多情況下單方的濃度很高了，背景問(wèn)題仍不能解決。那么請(qǐng)嘗試兩兩或者三種不同比例混合。不過(guò)有些細(xì)節(jié)還是要自己摸索的，比如gelatinBSA時(shí)，gelatin濃度不能無(wú)限提高（會(huì)完全競(jìng)爭(zhēng)掉抗原抗體特異性結(jié)合，導(dǎo)致白板），BSA的濃度較隨意。3.抗體稀釋液可用低鹽濃度的TBST，也可用高鹽濃度的緩沖液（NaCl 0.5M）以降低背景；但是切記，有的抗體對(duì)鹽濃度敏感，包括構(gòu)象和溶解度，因此需要嘗試。如果以上策略仍然無(wú)法解決高背景，可將稀釋好的一抗先跟平時(shí)實(shí)驗(yàn)剪切下來(lái)的membrane的邊角料（新的）放在一起孵育個(gè)把小時(shí)再用。如果還不行，徹底無(wú)解，結(jié)論抗體太差；請(qǐng)更換別的公司或者抗別的區(qū)段的同種抗體。這三種封閉蛋白的差異：milk和gelatin封閉效果不錯(cuò)且價(jià)格便宜，但milk容易發(fā)霉變質(zhì)，且國(guó)產(chǎn)milk脫脂不充分亦增加背景、拮抗抗原抗體結(jié)合（拮抗與抗原結(jié)合尤其突出；更不知道三聚氰胺會(huì)不會(huì)影響抗原抗體結(jié)合或者ECL??？）；BSA封閉效果不佳，且價(jià)格較昂貴。個(gè)人推薦gelatin，gelatin主要成分是骨膠原，蛋白很大，但可以通過(guò)加熱打斷成小蛋白，從而實(shí)現(xiàn)封閉各種分子量大小的蛋白。通常，我會(huì)將gelatin加到TBST中后直接滅菌，滅菌過(guò)程中，不溶的gelatin會(huì)逐漸溶解；由于gelatin可以滅菌（milk不可以），所以同樣條件下，gelatin的存放時(shí)間明顯長(zhǎng)于milk。實(shí)際上，抗體可以反復(fù)用很久（通常一般的抗體常規(guī)稀釋比，可以連續(xù)用一個(gè)月以上；對(duì)于老手用過(guò)2、3次的舊抗體更prefer，因此背景降到很低而效價(jià)正是最高的時(shí)候），通常抗體最后失效的原因不是因?yàn)槭褂么螖?shù)過(guò)多，而是染菌；比較舊的抗體都會(huì)有很多的沉淀在底部，更長(zhǎng)時(shí)間還會(huì)有異味。稀釋的一抗靠添加NaN3并于4度保存延長(zhǎng)使用時(shí)間；二抗不能加NaN3，但放在-20度反復(fù)凍融延長(zhǎng)使用壽命（抗體并非絕對(duì)不可以凍融；只是高濃度的原始管抗體的凍融對(duì)效價(jià)會(huì)有較大影響）。抗體稀釋液（一抗、二抗稀釋液也可同也可不同）和封閉液可以相同，可以不同，因?yàn)榭贵w稀釋液可以采用復(fù)方的，所以即使混合了少許，不會(huì)對(duì)抗體的使用產(chǎn)生較大的影響。不過(guò)封閉液用milk時(shí)，gelatin稀釋的一抗混入少許milk會(huì)影響其使用壽命。由于以上諸多可變因素，實(shí)在無(wú)法總結(jié)出一種萬(wàn)金油式的抗體稀釋液（只能是多數(shù)通用），因此對(duì)待具體問(wèn)題時(shí)，請(qǐng)具體對(duì)待（多花點(diǎn)心思摸索吧）。原裝抗體的保存：1. 分裝。每次一管，但是可能太多占地方，而且還會(huì)有粘壁的損失，不是很推薦。2. 1：1加甘油，凍于-20度，可長(zhǎng)期保存，此方法實(shí)際上也被很多國(guó)內(nèi)的試劑公司廣泛采用，諸如博士得，中杉，它們小包裝的進(jìn)口抗體通常都是1：1添加甘油保存于-20（不信去查查 ）。值得注意的是：不是所有的抗體都可以1：1添加甘油，要以抗體說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)，如果說(shuō)明書(shū)中本身存在甘油，或特殊注明外，通?？梢圆捎?。顯影淬滅的禍因當(dāng)抗體孵育、TBST漂洗結(jié)束后，進(jìn)入ECL顯影步驟。當(dāng)然，目前國(guó)內(nèi)一些實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)換用儀器掃描熒光信號(hào)，而我們更是二抗直接連熒光蛋白連ECL和常規(guī)的底片顯影都省略了，因此以下所討論的某些細(xì)節(jié)問(wèn)題可能不再出現(xiàn)。首先壇子上還有少數(shù)實(shí)驗(yàn)室處于DAB顯色時(shí)代，奉勸一句，都走到最后一步了就不要節(jié)省了；DAB顯色的靈敏性是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。目前較為流行的仍是化學(xué)發(fā)光法，下面簡(jiǎn)述一下其原理：交聯(lián)在二抗上的HRP酶能夠特異水解過(guò)氧化物產(chǎn)生化學(xué)能；ECL中主要包含兩種成分，催化劑和中間遞質(zhì)（白色瓶子主要是過(guò)氧化物如雙氧水）。催化劑的作用不用廢話了，其中間遞質(zhì)主要是吸收化學(xué)能并將其傳遞到luminol之類的化合物上產(chǎn)生電子躍遷從而激發(fā)熒光。因此催化劑的效率和中間遞質(zhì)的傳遞效率直接影響熒光的強(qiáng)弱。本人曾自制過(guò)ECL并嘗試改良，其間發(fā)現(xiàn)很多化合物、金屬離子如Fe、Cu等能催化并高效傳遞能量，且不依賴于HRP濃度，熒光信號(hào)能瞬間曝強(qiáng)；這其實(shí)與下文提到的一些粹滅原因有聯(lián)系。當(dāng)初我自制的ECL最大的毛病在于穩(wěn)定性不好，同理，商品化的ECL同樣也有保質(zhì)期的問(wèn)題，往往最先失效的組分就是過(guò)氧化物，盡管他們必然添加過(guò)抗還原劑。其實(shí)，檢驗(yàn)ECL是否失效的方法很簡(jiǎn)單，取稀釋的即用型二抗1-2ul加至ECL混和液中觀察熒光強(qiáng)度，即可知道ECL是否失效。商品化的ECL價(jià)格并不便宜，因此ECL孵育的最佳方案是：將ECL滴加在保鮮膜上或干凈的支持物上，如廢棄的舊底片、塑料盒，有機(jī)玻璃盒等等（注意，國(guó)產(chǎn)的保鮮膜很多質(zhì)量不過(guò)關(guān)，有兩種潛在的問(wèn)題，下面詳述），然后倒扣膜于保鮮膜上，夾住一個(gè)角來(lái)回拖動(dòng)數(shù)次至ECL均勻（有的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)要求孵育1min）。另外平鋪一張干凈的保鮮膜，將膜揭下控干ECL、倒扣包好，然后顯影。mini3型膠整張膜孵育，ECL總體積0.7-1ml足矣。哪些因素會(huì)影響熒光信號(hào)的強(qiáng)弱呢？（這部分實(shí)際上與導(dǎo)致熒光淬滅的因素部分重合）1.保鮮膜的質(zhì)量。a.國(guó)產(chǎn)的保鮮膜，很多廠家偷工減料打價(jià)格戰(zhàn)，造成保鮮膜很薄亦破損。ECL滴加到保鮮膜上容易從肉眼不易分辯的小孔泄露，一方面ECL反應(yīng)不充分，另一方面ECL所含液體會(huì)溶解試驗(yàn)臺(tái)上殘留未知的化學(xué)藥品顆粒（也許你或其他人曾經(jīng)不小心打翻過(guò)某種化合物）、灰塵等等，造成熒光淬滅。在簡(jiǎn)述原理時(shí)，我曾經(jīng)提到過(guò)很多化合物、金屬離子能直接催化過(guò)氧化物水解，在極短的時(shí)間內(nèi)消耗掉所有的HRP酶，熒光轉(zhuǎn)瞬即逝。b. 保鮮膜的化工原料或拉制過(guò)程中，殘留未知的化學(xué)試劑，引起熒光淬滅；廉價(jià)的保鮮膜問(wèn)題尤多。目前，國(guó)產(chǎn)的就“妙潔”比較過(guò)關(guān)，保鮮膜厚度和化學(xué)物殘留都不影響ECL顯影。如果買(mǎi)不到合格的保鮮膜，也可以用其他物品替代；但要特別注意這些支持物表面的干凈，最好不要有任何化學(xué)試劑殘留，包括風(fēng)干的TBST鹽結(jié)晶顆粒。2.ECL孵育結(jié)束后膜需要控干。中學(xué)物理學(xué)過(guò)水會(huì)吸收光譜，因此任何液體包括ECL溶液本身都會(huì)干擾熒光強(qiáng)度，所以ECL孵育結(jié)束時(shí)需要控干。一般夾起膜，讓膜的一角或一邊接觸吸水紙；但是請(qǐng)注意不能讓膜完全干掉。某些信號(hào)較弱的ECL，膜徹底干掉后熒光會(huì)消失；較好的試劑盒，熒光相對(duì)穩(wěn)定，但完全吸干以后，背景熒光也會(huì)升高，而且會(huì)嚴(yán)重影響重新標(biāo)記新抗體時(shí)的背景。因此，按照我的方法，讓自由流下的多余的ECL被吸走就好。3.控干的膜要仔細(xì)用保鮮膜包被，防止接觸外界異物造成熒光淬滅；同時(shí)，包裹保鮮膜時(shí)要細(xì)心，盡量不讓正面保鮮膜和膜之間出現(xiàn)皺褶。皺褶的地方會(huì)堆積多余的ECL，要么形成一條熒光的亮線；要么由于液體吸收熒光或者局部區(qū)域HRP過(guò)度消耗，呈線條狀淬滅。4.在膜放入壓片夾之前，最好肉眼觀察一下熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，這有利于判斷實(shí)驗(yàn)可能出現(xiàn)的問(wèn)題。很多人提問(wèn)看見(jiàn)很強(qiáng)的熒光了，但怎么壓片都沒(méi)有信號(hào)，那么就是快速淬滅（閃滅，再怎么快速操作也拿不到這種情況下的熒光信號(hào)）造成的；有這個(gè)觀察至少能夠判斷ECL孵育之前實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)該問(wèn)題不大，而問(wèn)題主要是淬滅。如果你省略這個(gè)步驟，那問(wèn)題就非常復(fù)雜了，因?yàn)橹叭魏尾僮鞫伎赡軐?dǎo)致白板，根本無(wú)法判斷。除上述的問(wèn)題以外，還有哪些因素會(huì)導(dǎo)致熒光淬滅呢？1. 抗原濃度太高，熒光信號(hào)過(guò)強(qiáng)，快速淬滅。在電泳的章節(jié)就曾提過(guò)，如果上樣量太大，不僅條帶會(huì)粘連、彎曲，更可能導(dǎo)致淬滅。因?yàn)榫植繀^(qū)域過(guò)多的HRP酶會(huì)快速消耗底物呈富氧態(tài)，條帶出現(xiàn)燒灼樣（取出膜會(huì)發(fā)現(xiàn)一條明顯的暗黃色的帶），熒光信號(hào)會(huì)閃滅或者條帶空心（條帶灰黑不實(shí)，則可能是顯影液接