PCR常見問題分析及對(duì)策.doc

PCR常見問題分析及對(duì)策(無擴(kuò)增產(chǎn)物、非特異性擴(kuò)增、拖尾、假陽性) 問題1：無擴(kuò)增產(chǎn)物 現(xiàn)象：正對(duì)照有條帶，而樣品則無 原因: 1.模板:含有抑制物，含量低 2.Buffer對(duì)樣品不合適 3.引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解 4.反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時(shí)間太短 對(duì)策: 1.純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量 2.更換Buffer或調(diào)整濃度 3.重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物 4.降低退火溫度、延長延伸時(shí)間 問題2：非特異性擴(kuò)增 現(xiàn)象：條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致或者非特異性擴(kuò)增帶 原因： 1.引物特異性差 2.模板或引物濃度過高 3.酶量過多 4.Mg2+濃度偏高 5.退火溫度偏低 6.循環(huán)次數(shù)過多 對(duì)策： 1.重新設(shè)計(jì)引物或者使用巢式PCR 2.適當(dāng)降低模板或引物濃度 3.適當(dāng)減少酶量 4.降低鎂離子濃度 5.適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法 6.減少循環(huán)次數(shù) 問題3：拖尾 現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。 原因： 1.模板不純 2.Buffer不合適 3.退火溫度偏低 4.酶量過多 5.dNTP、Mg 2+濃度偏高 6.循環(huán)次數(shù)過多 對(duì)策： 1.純化模板 2.更換Buffer 3.適當(dāng)提高退火溫度 4.適量用酶 5.適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度 6.減少循環(huán)次數(shù) 問題4：假陽性 現(xiàn)象：空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物 原因： 靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物 的交*污染 對(duì)策： 1.操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外； 2.除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管 及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。 3.各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存 PCR引物設(shè)計(jì)的黃金法則 （轉(zhuǎn)自tiangen） 1.引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)。 DNA序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件（比如DNAman）比對(duì)（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū) 2.引物長度一般在1530堿基之間。 引物長度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^長會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74，不適于Taq DNA 聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。 3.引物GC含量在40%60%之間，Tm值最好接近72。 GC含量（composition）過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm值510。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估計(jì)引物的Tm值，則有效引物的Tm為5580，其Tm值最好接近72以使復(fù)性條件最佳。 4.引物3端要避開密碼子的第3位。 如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率。 5.引物3端不能選擇A，最好選擇T。 引物3端錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T時(shí)，錯(cuò)配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯(cuò)配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3端最好選擇T。 6. 堿基要隨機(jī)分布。 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)（False priming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G或C，因這樣會(huì)使引物在GC富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。 7. 引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。 引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin）使引物本身復(fù)性。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。 兩引物之間也不應(yīng)具有互補(bǔ)性，尤其應(yīng)避免3 端的互補(bǔ)重疊以防止引物二聚體（Dimer與Cross dimer）的形成。引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話，應(yīng)盡量使其G值不要過高（應(yīng)小于4.5kcal/mol）。否則易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應(yīng)不能正常進(jìn)行。 8. 引物5 端和中間G值應(yīng)該相對(duì)較高，而3 端G值較低。 G值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性，G值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。應(yīng)當(dāng)選用5 端和中間G值相對(duì)較高，而3 端G值較低（絕對(duì)值不超過9）的引物。引物3 端的G 值過高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)。（不同位置的G值可以用Oligo 6軟件進(jìn)行分析） 9.引物的5端可以修飾，而3端不可修飾。 引物的5 端決定著PCR產(chǎn)物的長度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5 端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動(dòng)子序列等。 引物的延伸是從3 端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。3 端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能。 10. 擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。 某些引物無效的主要原因是擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)軟件（比如RNAstructure）可以預(yù)測估計(jì)mRNA的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能（G）小于58.6l kJ/mol時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時(shí)，用7-deaza-2-脫氧GTP取代dGTP對(duì)擴(kuò)增的成功是有幫助的。 11. 引物應(yīng)具有特異性。 引物設(shè)計(jì)完成以后，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補(bǔ)性，就可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)了。 值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR，因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對(duì)固定，引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。 做Real Time時(shí),用于SYBR Green I法時(shí)的一對(duì)引物與一般PCR的引物,在引物設(shè)計(jì)上所要求的參數(shù)是不同的。 引物設(shè)計(jì)的要求： 1)避免重復(fù)堿基，尤其是G. 2)Tm=58-60度。 3）GC=30-80%. 4)3端最后5個(gè)堿基內(nèi)不能有多于2個(gè)的G或C. 5)正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。 6)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度： 引物的產(chǎn)物大小不要太大，一般在80-250bp之間都可；80150 bp最為合適（可以延長至300 bp）。 7)引物的退火溫度要高，一般要在60度以上； 要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的存在。 而且引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力，即引物應(yīng)該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。 至于設(shè)計(jì)軟件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS都應(yīng)該可以的。 做染料法最關(guān)鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預(yù)防工作。對(duì)于引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個(gè)能用的引物的思想準(zhǔn)備-尋找