新型抗IgE人源化單克隆抗體的結構與功能研究.doc

新型抗IgE人源化單克隆抗體的結構與功能研究錢衛(wèi)珠 【摘要】：研究目的:I型超敏反應又稱過敏反應,主要由特異性IgE抗體所介導,由于IgE處于變態(tài)反應炎癥級聯(lián)反應的最上游,在變態(tài)反應啟動和發(fā)生過程中發(fā)揮著關鍵作用。1987年,首次提出應用抗IgE抗體治療IgE介導的過敏性疾病,并描述了具有特異性結合能力的抗IgE單克隆抗體。1993年,Kolbinger等報道了一株鼠源性單抗(MaE11)的人源化過程,該抗體又稱為Omalizumab或Xolair,包括大約5%的鼠源和95%的人源序列。2003年6月,美國FDA批準Xolair上市。上市伊始,2004年在美國的銷售額即達到1.4億美元,顯示出良好的市場前景。然而Xolair抗體與IgE的親和常數(shù)則僅有26nM左右,當抗IgE抗體的治療濃度達到IgE基礎水平的100倍時,才可結合99%的IgE分子,從而充分抑制IgE分子與FcR相結合。在過敏性哮喘患者體內(nèi),游離IgE水平可升高數(shù)倍,Xolair抗體的臨床用量需要根據(jù)IgE的基礎水平進行調(diào)整,往往需要數(shù)百毫克才能達到治療效果。因此,Xolair的治療費用十分昂貴,即使在美國也受到醫(yī)療保險的限制,目前僅用于吸入激素無法控制的嚴重病例。國外也有其它醫(yī)藥公司研制了抗IgE的人源化抗體(瑞士Novartis、美國Tanox公司),但由于其臨床療效尚不及Xolair,均于1996年終止了臨床試驗。 本研究利用哺乳動物表達系統(tǒng),制備了含有關鍵的功能表位的IgE片段(Fc2-4),通過雜交瘤技術制備新型的高親和力抗IgE單克隆抗體,篩選具有競爭抑制IgE與其受體FcR結合功能的克隆。為降低鼠源單抗的免疫原性,對篩選獲得的抗體進行人源化改造,比較制備所獲抗體及Xolair與IgE結合的親和力及體外功能,以期從結構上闡明該抗體的作用機制。通過該課題的研究,以期獲得親和力更高的、可望用于過敏性疾病預防和治療的新型抗IgE人源化單克隆抗體。 研究方法:本課題采用小鼠雜交瘤技術,利用IgE Fc2-4作為免疫原,免疫獲得具有競爭抑制IgE與FcR結合功能的鼠源單克隆抗體。為進一步降低單抗的免疫原性,減輕用于人體時的HAMA反應,提高安全性,我們采用計算機輔助設計模擬抗體空間構象的方法,對鼠源抗體進行了人源化改造,對改造成功的人源化單克隆抗體體外功能進行了詳細分析,并與Omalizumab的體外功能進行比較。我們應用噬菌體隨機七肽庫對人源化單克隆抗體的抗原表位進行親和淘選,從而明確抗體識別的表位,通過分析IgE與其高親和力受體FcRI的復合物結晶,與抗IgE抗體所識別表位進行比較,從空間結構上解釋和闡明抗IgE人源化單克隆抗體的功能學基礎。 結果:獲得哺乳動物細胞表達的IgE Fc2-4以及FcRIA,通過雜交瘤技術篩選獲得具有競爭抑制IgE與FcR結合的鼠源抗IgE單克隆抗體7A5。利用計算機輔助設計的手段,改造獲得親和力和特異性均較好的人源化抗IgE體Hu7A5m18。體外功能分析結果表明:Hu7A5m18可抑制IgE與可溶性及細胞表面FcRI結合,而對結合于細胞表面FcRI的IgE則無影響,Hu7A5m18可以抑制IgE與細胞表面FcRI結合導致的脫顆粒反應。Hu7A5m18介導上述體外功能的EC50僅為Omalizumab的1/10左右。SPR技術檢測M7A5、Hu7A5m18及Omalizumab與IgE的親和力分別為1.9nM、1.7nM和23.8nM,因此Hu7A5m18人源化改造成功,而且該單抗的親和力明顯高于Omalizumab。 我們應用噬菌體隨機七肽庫對Hu7A5m18的抗原表位進行親和淘選,通過對陽性噬菌體序列的分析比對,發(fā)現(xiàn)一個非常保守的序列被高度擴增,而這個序列與IgE恒定區(qū)C3片段內(nèi)的391KQR393高度同源。通過分析IgE與其高親和力受體FcRI的復合物結晶,發(fā)現(xiàn)IgE恒定區(qū)C3片段內(nèi)的391KQR393序列在空間上臨近IgE高親和力受體FcRI在IgE分子上的結合位點,從而推論正是由于這種結合位點上的空間位置,使Hu7A5m18可以通過空間位阻抑制IgE分子同高親和力受體FcRI結合。我們前期的研究結果顯示,Omalizumab識別表位定位于IgE-Fc C3的424HLP426,該序列與高親和力IgE受體結合位點重疊。由于Hu7A5m18識別表位391KQR393在空間上與Omalizumab識別表位424HLP426也臨近,這也正是Hu7A5m18能夠與Omalizumab競爭結合IgE的結構原因。 結論:本研究制備的新型抗IgE人源化單克隆抗體,具有更好的親和力以及體外功能,可望解決目前臨床應用的IgE抗體活性不高,用量過大的瓶頸,成為過敏性疾病預防和治療的候選藥物。表位淘選獲得該抗體識別的新的功能性表位391KQR393,由于其與Omalizumab識別表位424HLP426在空間上的接近,因此Hu7A5m18可以更有效的抑制IgE與靶細胞的結合而導致的脫顆粒反應,從而減輕過敏反應。【關鍵詞】：IgE單克隆抗體表位噬菌體展示肽庫【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學【學位級別】：博士【學位授予年份】：2011【分類號】：R392【目錄】：摘要6-8 Abstract8-10 縮略詞表10-12 前言12-16 第一部分 抗IgE 單克隆抗體的制備16-51 一、材料16-17 （一） 細胞株、菌株、實驗動物16 （二） 試劑16-17 （三） 主要儀器設備17 二、方法17-25 （一） IgE Fc2-4 表達載體的構建17-18 （二） IgE Fc 高親和力受體FcRIA 胞外區(qū)表達載體的構建18 （三） 蛋白表達、純化和理化性質(zhì)鑒定18-20 （四） 雜交瘤制備20-21 （五） 抗IgE 單克隆抗體的人源化21-25 三、結果25-48 （一） IgE Fc2-4 及IgE FcRIA 的構建、表達及鑒定25-34 （二） 抗IgE Fc 單克隆抗體的制備、純化及鑒定34-36 （三） 抗IgE 鼠源單抗7A5 的人源化改造36-48 四、討論48-51 第二部分 抗IgE 人源化單抗Hu7A5m18 的功能研究51-70 一、材料51-52 （一） 重組蛋白、抗體及細胞系51 （二） 試劑51-52 （三） 主要儀器設備52 二、方法52-57 （一） Hu7A5m18 抑制IgE 與可溶性FcRI 的結合實驗52-54 （二） Hu7A5m18 抑制IgE 與細胞表面FcRI 的結合實驗54-55 （三） Hu7A5m18 與結合于細胞表面FcRI 的IgE 的結合實驗55-56 （四） Hu7A5m18 抑制IgE 引起脫顆粒的功能學實驗56-57 三、結果57-68 （一） Hu7A5m18 抑制IgE 與可溶性FcRI 結合57-62 （二） Hu7A5m18 抑制IgE 與細胞表面FcRI 結合62-66 （三） Hu7A5m18 不與結合于細胞表面FcRI 的IgE 的結合66-67 （四） Hu7A5m18 抑制IgE 導致的脫顆粒67-68 四、討論68-70 第三部分 抗IgE 人源化單抗Hu7A5m18 的結構研究70-85 一、材料70-72 （一） 菌株、噬菌體隨機文庫及抗體70 （二） 試劑配制70-72 （三） 實驗設備、器材72 二、方法72-76 （一） 噬菌體隨機肽庫篩選Hu7A5m18 抗原表位72-76 （二） Hu7A5m18 抗原表位的鑒定76 三、結果76-84 （一） 噬菌體隨機肽庫篩選Hu7A5m18 抗原表位76-80 （二） Hu7A5m18 抗原表位的鑒定80-84 四、討論84-85 參考文獻85-89 綜述89-109 參考文獻104-109 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況說明109-112 致謝112專家共識：外用中成藥在濕疹皮炎治療中的應用2012-12-21 14:59 來源：愛愛醫(yī)我要評論(熱)導讀中醫(yī)中藥作為我國傳統(tǒng)醫(yī)藥，深受患者歡迎，且常被認為能夠治本且不良反應少。外用中成藥在濕疹皮炎治療中應用非常廣泛，有成功經(jīng)驗，也存在一些爭議。 中醫(yī)中藥作為我國傳統(tǒng)醫(yī)藥，深受患者歡迎，且常被認為能夠治本且不良反應少。外用中成藥在濕疹皮炎治療中應用非常廣泛，有成功經(jīng)驗，也存在一些爭議。有鑒于此，以中國中西醫(yī)結合學會皮膚性病專業(yè)委員環(huán)境與職業(yè)性皮膚病學組部分專家為基礎，邀請部分知名中醫(yī)專家參加制定本共識，旨在幫助全國廣大皮膚科醫(yī)生了解我國外用中成藥在濕疹皮炎治療過程中的使用現(xiàn)狀，以便發(fā)現(xiàn)問題、總結經(jīng)驗，更好地發(fā)揮中醫(yī)藥在濕疹皮炎治療中的作用。 一、外用中成藥的定義和分類 中成藥是指在中醫(yī)藥理論的指導下，以中藥為原料，按規(guī)定的處方和標準制成具有一定規(guī)格的劑型，質(zhì)量穩(wěn)定、可控，經(jīng)國家批準依法生產(chǎn)的成方中藥制劑，可直接用于防治疾病。外用中成藥即專用于外治療法的中成藥。 外用中成藥可分為固體制劑如栓劑、膏劑、膜劑等；半固體劑型如乳膏、軟膏劑、凝膠劑、糊劑等；液體制劑如溶液劑、酒劑、酊劑、洗劑、油劑等；氣體劑型如氣霧劑。 二、中醫(yī)對濕疹皮炎的認識 濕疹皮炎歸屬中醫(yī)的“濕瘡”，其他也有“奶癬”、“旋耳瘡”、“繡球風”、“浸淫瘡”等等多種名稱。中醫(yī)學認為其乃因稟性不耐，風濕熱客于肌膚而成；或因脾失健運或營血不足，濕熱滯留，以致血虛風燥，肌膚失養(yǎng)所致。與現(xiàn)代醫(yī)學提出的遺傳性或獲得性皮膚屏障功能障礙，免疫學紊亂等內(nèi)在病因加上環(huán)境中的物理、化學、生物微生物和社會心理因素等造成的皮膚刺激、過敏、感染等外部因素的綜合作用而致病的理論一致。 三、外用中成藥在濕疹皮炎治療中的應用現(xiàn)狀 濕疹皮炎類皮膚病是皮膚科的常見病，由于病因非常復雜，許多患者不能明確病因，容易復發(fā)，因此長期維持治療是預防復發(fā)的重要手段，也是采用中醫(yī)治療的優(yōu)勢病種之一。國內(nèi)外研究均表明目前濕疹皮炎的預后較差。2008年李鄰峰等對559例皮炎濕疹的預后研究表明，3年復發(fā)率高達85%（1）。國外對慢性手部濕疹的預后研究也有類似結果（2）。但是當前治療濕疹的主要外用藥物，糖皮質(zhì)激素的常見不良反應使多數(shù)患者，尤其兒童和老年患者不能長期堅持用藥，外用中成藥是否可以代替糖皮質(zhì)激素，改善濕疹預后值得研究。 外用中成藥在臨床上應用很廣，2012年對南京、武漢、濟南三地187位皮膚科主治醫(yī)師以上人員進行的問卷調(diào)查表明：70%的醫(yī)師（西醫(yī)師43%，中醫(yī)及中西醫(yī)結合醫(yī)師100%）在日常工作中經(jīng)常開具中成藥。87%的醫(yī)師（西醫(yī)師76%，中醫(yī)及中西醫(yī)結合師100%）相信中藥可以有效治療皮炎濕疹。同時也發(fā)現(xiàn)72%的醫(yī)師（西醫(yī)師100%，中醫(yī)及中西醫(yī)結合師40%）認為中藥的療效也應按照現(xiàn)代醫(yī)學方法進行臨床驗證。有30%的醫(yī)師（西醫(yī)0，中醫(yī)及中西醫(yī)結合師64%）相信因為中藥是天然藥物，所以一定安全。 四、外用中成藥臨床使用原則 外用中成藥治療濕疹皮炎屬于中醫(yī)外治法，總的原則是對癥治療，同西藥一樣，應該針對不同皮損、病期、部位采用不同的外用中成藥。其中止癢，阻斷瘙癢搔抓瘙癢的惡性循環(huán)是關鍵。療程要足夠。 1常用治療濕疹皮炎的外用中成藥分類：根據(jù)劑型，也可以分為溶液類、洗劑類、軟膏類等。 2. 使用方法：可以單獨使用也可以與西藥聯(lián)合、序貫應用。急性期：治宜清熱除濕、收斂止癢。皮損表現(xiàn)為潮紅、紅斑、丘疹、斑丘疹，無滲出者，以清熱止癢類中藥洗劑外涂或濕敷，常用有止癢消炎水、復方爐甘石洗劑等；皮損表現(xiàn)為丘皰疹、水皰、糜爛，滲出者，以清熱燥濕止癢之溶液劑濕敷或冷濕敷，常用有皮膚康洗液、復方黃柏液、甘霖洗劑等。亞急性期：治宜除濕收斂、祛風止癢。皮損表現(xiàn)為少量滲出者，以清熱收斂止癢的洗劑外搽或濕敷，常用有舒樂搽劑、兒膚康搽劑。皮損表現(xiàn)為潮紅、鱗屑，無滲出者，以清熱除濕，祛風止癢的洗劑、軟膏先搽后涂，常用有舒樂搽劑、兒膚康搽劑、膚疾洗劑、青鵬軟膏、消炎癬濕藥膏、丹皮酚軟膏、冰黃膚樂軟膏等。慢性期：治宜清熱、活血化瘀，潤膚止癢。皮損表現(xiàn)為皮膚肥厚浸潤，苔蘚樣變者，以清熱、活血化瘀止癢的酊劑、軟膏外用或封包，常用青鵬軟膏、消炎癬濕藥膏、冰黃膚樂軟膏、蜈黛軟膏等；皮損表現(xiàn)為皮膚干燥粗糙、有鱗屑者，以清熱、潤膚止癢的軟膏外涂，常用有青鵬軟膏、冰黃膚樂軟膏、黑豆餾油軟膏等。 3特殊部位用藥：頭面部：有滲出者，常以溶液劑或洗劑濕敷或外搽，常用有皮膚康洗劑、甘霖洗劑等；無滲出者，以丹皮酚軟膏、冰黃膚樂軟膏等外涂。涂藥后，任其暴露，勿包扎；忌用刺激性強的藥物，并注意勿誤涂入口眼部。外陰部：以皮膚康洗液、復方黃柏液、甘霖洗劑等濕敷、坐?。蝗羝つw肥厚、瘙癢劇烈者，以羌月軟膏、冰黃膚樂軟膏等外涂。忌用刺激性強的藥物。有些藥物如皮膚康洗液，需稀釋后外用，切忌將原液直接涂抹于患處。肛門部：以百安洗液、甘霖洗劑等坐浴、熏洗，若皮膚干燥、皸裂者，以冰黃膚樂軟膏、除濕止癢軟膏等外涂。手足部：急性、亞急性者，常用皮膚康洗液、除濕止癢洗液、復方爐甘石洗劑等濕敷、溻漬、浸浴、外搽；慢性肥厚性者，以青鵬軟膏、丹皮酚軟膏、消炎癬濕藥膏等外涂。乳部：糜爛滲出瘙癢者，常用皮膚康洗液、復方黃柏液等濕敷，若肥厚、皸裂者，可以用消炎癬濕藥膏、冰黃膚樂軟膏、奇正青鵬軟膏、除濕止癢軟膏等外涂。 4使用中成藥注意事項：應交待外用藥物的用法、用量、濃度和療程。目前還缺乏外用中成藥療程的相關研究，但可以參照西藥的方法，在癥狀完全消失后在原皮損處再間斷外用（每周2天）3-6個月，以減少復發(fā)的可能。要考慮患者的部位、性別、年齡的差異，如頭面、乳房及外陰部位濕疹忌用刺激性強的外用藥物，兒童及老年患者忌用刺激性強的外用藥物。注意勿涂入口眼等粘膜處。應注意觀察藥物治療的不良反應，及時處置。如某些外用中藥含有冰片等，長期大面積應用可能會引起中毒；樟腦、薄荷腦、肉桂醇