葉酸代謝障礙遺傳檢測(cè).doc

_浙江殷欣生物技術(shù)有限公司葉酸代謝障礙遺傳檢測(cè)項(xiàng)目推薦書(shū)PCR+測(cè)序法精品資料1. 葉酸代謝障礙遺傳檢測(cè)項(xiàng)目簡(jiǎn)介1.1開(kāi)展葉酸代謝障礙遺傳檢測(cè)的必要性1.1.1 我國(guó)出生缺陷的嚴(yán)峻形勢(shì)出生缺陷已構(gòu)成嬰兒和兒童死亡的主要原因，成為全世界尤其是發(fā)展中國(guó)家在人口健康方面面臨的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。我國(guó)是一個(gè)出生缺陷高發(fā)國(guó)家。據(jù)2012年國(guó)家人口發(fā)展戰(zhàn)略研究報(bào)告，全國(guó)每年約有20-30萬(wàn)肉眼可見(jiàn)先天畸形兒出生，加上出生后逐漸顯現(xiàn)出來(lái)的缺陷，出生缺陷總數(shù)高達(dá)80-120萬(wàn)，約占每年出生人口總數(shù)的4%-6%。根據(jù)WHO和我國(guó)合作發(fā)表的出生缺陷疾病經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的評(píng)價(jià)，我國(guó)每年因新生兒缺陷造成的直接損失達(dá)10億元人民幣，僅神經(jīng)管缺陷一項(xiàng)的直接經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)2億。用于撫養(yǎng)殘疾兒的醫(yī)療費(fèi)用支出每年超過(guò)50億，而大部分存活下來(lái)的出生缺陷兒因殘疾給一個(gè)家庭造成長(zhǎng)達(dá)幾十年的心理負(fù)擔(dān)和精神痛苦更是無(wú)法用金錢衡量。由此可見(jiàn)，出生缺陷的現(xiàn)狀正嚴(yán)重威脅著我國(guó)的人口素質(zhì)和生命質(zhì)量，已經(jīng)不僅僅是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，而且成為影響經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民正常生活的社會(huì)問(wèn)題。1.1.2 葉酸代謝能力具有較大的個(gè)體差異性目前，全世界已經(jīng)公認(rèn)，婦女圍孕期增補(bǔ)葉酸可以預(yù)防胎兒神經(jīng)管缺陷(NTDs)的初發(fā)及再發(fā)。由于葉酸與DNA的合成密切相關(guān)，婦女圍孕期若攝入葉酸不足，則會(huì)導(dǎo)致同型半胱氨酸（HCY）向甲硫氨酸轉(zhuǎn)化出現(xiàn)障礙，導(dǎo)致高HCY血癥或低甲硫氨酸血癥。高HCY血癥可引起血管內(nèi)皮損傷、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增生，同時(shí)引起凝血和纖溶系統(tǒng)功能失調(diào)，使血液處于高凝狀態(tài)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，血漿中HCY水平升高與習(xí)慣性流產(chǎn)、胎盤早剝、胎兒生長(zhǎng)受限、胎兒畸形、死胎、早產(chǎn)、低體重兒等現(xiàn)象的發(fā)生密切相關(guān)。低甲硫氨酸血癥則會(huì)引起S-腺苷甲硫氨酸/S-腺苷同型半胱氨酸比值降低，抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性和DNA甲基化，造成染色體不分離現(xiàn)象，引起多種胎兒畸形，如神經(jīng)管缺陷、唇腭裂和各種染色體缺陷病等。此外，有研究證明婦女在懷孕的前6周內(nèi)如果攝入葉酸不足，則生育無(wú)腦兒和腦脊柱裂的畸形兒的可能性會(huì)增加4倍。葉酸在食物中分布很廣，它經(jīng)過(guò)人體腸道吸收后，經(jīng)葉酸還原酶作用，還原成具有生理活性的四氫葉酸，四氫葉酸作為細(xì)胞內(nèi)一碳單位的載體，參與嘌呤和嘧啶合成，為DNA、蛋白質(zhì)的甲基化提供甲基。葉酸代謝障礙是指由于葉酸代謝通路中的關(guān)鍵基因突變導(dǎo)致酶活性降低，使得已被機(jī)體吸收的葉酸不能正常發(fā)揮生理功能，一碳單位傳遞受阻，導(dǎo)致神經(jīng)管缺陷、流產(chǎn)、妊娠期高血壓疾病等發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高。在葉酸代謝過(guò)程中，多種酶參與了葉酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，其中包括5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）、甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR）。圖1. 葉酸在體內(nèi)的代謝途徑四氫葉酸甲基載體之一的5-甲基四氫葉酸是由5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）催化生成，是血液和細(xì)胞中存在的主要葉酸類型。5-甲基四氫葉酸參與的唯一已知反應(yīng)是作為甲基供體，在甲硫氨酸合成酶催化下，以維生素B12 為輔酶，促進(jìn)血液中同型半胱氨酸再次甲基化生成甲硫氨酸（蛋氨酸），以維持正常的血漿同型半胱氨酸水平。隨后，甲硫氨酸被ATP 磷酸化生成S-腺苷甲硫氨酸。S-腺苷甲硫氨酸參與機(jī)體內(nèi)的生物大分子（包括DNA、蛋白質(zhì)、脂類等）的甲基化，生成S-腺苷同型半胱氨酸。S-腺苷同型半胱氨酸再重新生成同型半胱氨酸，完成同型半胱氨酸代謝循環(huán)。因此，MTHFR 催化生成5-甲基四氫葉酸這步酶促反應(yīng)至關(guān)重要，是葉酸代謝通路中的限速步驟。5-甲基四氫葉酸的存在是同型半胱氨酸向甲硫氨酸轉(zhuǎn)變的必要條件，也是甲基傳遞的重要載體。在葉酸攝入量不變的情況下，5-甲基四氫葉酸的量受MTHFR 的控制，即MTHFR 酶活性高時(shí)5-甲基四氫葉酸的產(chǎn)量高，MTHFR 酶活性低時(shí)5-甲基四氫葉酸的產(chǎn)量低。足量的5-甲基四氫葉酸是維持血液中同型半胱氨酸水平的重要因素，也是確保體內(nèi)甲基化程度正常的保證。另外，維生素B12 非常容易被氧化失活，甲硫氨酸合成酶失去維生素B12 的幫助無(wú)法完成5-甲基四氫葉酸和同型半胱氨酸的反應(yīng)。甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR）具有甲基化還原維生素B12 的作用，從而可以確保甲硫氨酸合成酶功能的發(fā)揮。如果MTRR 基因突變?cè)斐擅富钚越档停敲醇琢虬彼岷铣擅富钚砸搽S之降低，同型半胱氨酸的轉(zhuǎn)化會(huì)受到影響，甲基傳遞也會(huì)出現(xiàn)障礙。1.1.3 MTHFR基因、MTRR基因與葉酸代謝障礙相關(guān)多態(tài)性位點(diǎn)MTHFR基因A1298C位點(diǎn)多態(tài)性A1298C是位于第一號(hào)染色體MTHFR 基因第八個(gè)外顯子上第1298（1337）核苷酸的一個(gè)A/C多態(tài)，引起MTHFR 基因編碼的蛋白第429個(gè)氨基酸由Glu變?yōu)锳la。在dbSNP 數(shù)據(jù)庫(kù)中，世界人群中的該多態(tài)的頻率分布，A占0.77，C占0.23 左右；中國(guó)人群中的分布A為0.81，C為0.19。研究發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)的多態(tài)性是影響該酶的活性的一個(gè)重要因素。攜帶MTHFR1298C等位基因的酶活性為野生型的68左右，因而阻礙了葉酸代謝，引起一系列疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加。MTHFR基因C677T位點(diǎn)多態(tài)性C677T是位于第一號(hào)染色體MTHFR 基因第五個(gè)外顯子上的716（677）位mRNA 上一個(gè)C/T 多態(tài)，引起MTHFR 基因編碼的蛋白第222 個(gè)氨基酸由Ala（A）變?yōu)閂al（V）。在dbSNP 數(shù)據(jù)庫(kù)中，世界人群中的該多態(tài)的頻率分布，C 占0.78，T 占0.22 左右；中國(guó)人群中的分布C為0.67，T為0.34。研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR 677 位點(diǎn)的多態(tài)性是影響該酶的活性的一個(gè)重要因素，導(dǎo)致酶活性和熱穩(wěn)定性下降。若以個(gè)體攜帶677CC 基因型時(shí)其MTHFR活性為100時(shí)，則攜帶CT基因型的活性為CC 的67，基因型為TT 的只有25。MTRR基因A66G位點(diǎn)多態(tài)性A66G是位于5p15.3-p15.2 之間的MTRR 基因第2個(gè)外顯子處的一個(gè)A/G 多態(tài)，引起MTRR 基因編碼的蛋白第22 個(gè)氨基酸由Ile 變?yōu)镸et（Ile22Met）。在dbSNP 數(shù)據(jù)庫(kù)中，世界人群中的該多態(tài)的頻率分布為，A占57.4，G占42.6左右；中國(guó)人群中的該多態(tài)的頻率分布為：A占76，G占24左右。該位點(diǎn)是MTRR上的主要突變，引起甲基維生素缺乏癥E型，并經(jīng)常用來(lái)研究與神經(jīng)管缺陷、脊柱裂、Down 綜合癥、白血病等疾病的關(guān)系。綜合以上研究證明，HCY代謝涉及十幾個(gè)酶，其中只有 MTHFR、MTRR和CBS基因突變和HCY密切相關(guān)。其中以 MTHFR 677C-T突變影響最大。MTHFR 1298A-C突變也使酶活性下降。尤其2個(gè)位點(diǎn)的雜合突變相互 影響，可以用來(lái)解釋常規(guī)劑量服用葉酸對(duì)預(yù)防NTD 35%50%的作用。有關(guān)MTHFR突變的meta分析結(jié)果顯示；MTHFR對(duì)NTD患兒的 OR值為1.7；對(duì)母親OR值為1.8；對(duì)父親的OR值為1.9；當(dāng)母親和孩子都是純合子，677C-T突變風(fēng)險(xiǎn)就增加了7倍。同時(shí)，有研究證明677C-T突變可能是先天性心臟病的高危因素之一，婦女妊娠期間補(bǔ)充葉酸 和多種維生素能有效降低胎兒先天性心臟病的患病風(fēng)險(xiǎn)。除此還見(jiàn)到與唐氏綜合征及唇腭裂有關(guān)的報(bào)道。圖2. MTHFR 677CT 和1298AC基因多態(tài)性和神經(jīng)管缺陷風(fēng)險(xiǎn)的Meta分析通過(guò)對(duì)體內(nèi)葉酸水平與不同基因型別的統(tǒng)計(jì)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，血中高濃度葉酸時(shí)，MTHFR的各基因型與個(gè)體體內(nèi)的HCY水平無(wú)差；而當(dāng)?shù)蜐舛热~酸水時(shí)，TT型個(gè)體體內(nèi)的HCY水平比TC、CC型明顯升高；在葉酸攝入量相同時(shí)，血清葉酸水平CC型為 6.19 ng/mL，CT型為6.20ng/mL，TT型為 5.17ng/mL，其中TT比TC、CC型個(gè)體的血清葉酸水平降低20.2%，TT基因型血清葉酸水平是其他基因型的0.65，因此比其他兩型攝入葉酸高1.4 倍才使其的葉酸水平基本一致。人群研究表明，婦女妊娠期間補(bǔ)充葉酸和多種維生素能有效降低胎兒 先天性心臟病的患病風(fēng)險(xiǎn)；對(duì)伴有高HCY血癥的成人口服葉酸10mg/d治療1年后，發(fā)現(xiàn)血漿葉酸 水平明顯上升、血漿HCY明顯下降、動(dòng)脈分支的血流調(diào)節(jié)性顯著上升。 長(zhǎng)期葉酸治療可以改善動(dòng)脈內(nèi)皮功能，可能阻止動(dòng)脈粥樣硬化；對(duì)高HCY血癥患者用葉酸（5mg/d）和維生素B6（250mg/d）進(jìn)行治療，6周后血漿HCY濃度全部恢復(fù)正常；每天補(bǔ)充葉酸500g/d以上，可以使第一次中風(fēng)的發(fā)生率降低18%。由此可見(jiàn)，由于MTHFR和MTRR基因位點(diǎn)多態(tài)性在不同種族、地域、民族中有不同的頻度分布，這就要求在制定圍孕期葉酸補(bǔ)服方案時(shí)不能使用統(tǒng)一模式、執(zhí)行統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。1.2 項(xiàng)目信息殷欣生物MTHFR和MTRR基因檢測(cè)項(xiàng)目，即葉酸代謝障礙遺傳檢測(cè)項(xiàng)目，用于定性檢測(cè)樣本中MTHFR基因C677T位點(diǎn)、A1298C位點(diǎn)和MTRR基因A66G位點(diǎn)。為臨床醫(yī)生評(píng)估個(gè)體葉酸遺傳代謝能力提供參考；在此基礎(chǔ)上，給予個(gè)體精準(zhǔn)的葉酸和維生素補(bǔ)服計(jì)劃，降低出生缺陷的發(fā)生以及由HCY增高引發(fā)各種疾病或并發(fā)癥。項(xiàng)目名稱：人MTHFR和MTRR基因檢測(cè)通用名稱：葉酸代謝障礙遺傳檢測(cè)英文名稱：Human MTHFR and MTRR Gene Detection預(yù)期用途：主要用于對(duì)育齡婦女孕期/圍產(chǎn)期的葉酸利用能力的遺傳風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估，評(píng)估的結(jié)果可用于指導(dǎo)受檢婦女進(jìn)行孕期營(yíng)養(yǎng)利用異常導(dǎo)致疾病的預(yù)防，并且有利于這些營(yíng)養(yǎng)利用能力異常所致疾病的病因?qū)W研究及患者臨床個(gè)性化治療的實(shí)施。適用科室以及人群如下表所示：科室人群應(yīng)用婦產(chǎn)科 孕前/圍孕期女性 孕期保健基礎(chǔ)篩查：出生缺陷(神經(jīng)管畸形、先心病、唐氏綜合征、唇腭裂等)、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、妊高癥的一級(jí)預(yù)防。生殖中心 不孕不育人群：女性不良孕產(chǎn)(畸胎/流產(chǎn)/胚停等)、男性少精癥/弱精癥 不孕不育、不良孕產(chǎn)的輔助性病因診斷。體檢中心 體檢人群 基因體檢：腦卒中、H型高血壓的一級(jí)預(yù)防。兒科 兒童 兒童保健篩查：促進(jìn)兒童營(yíng)養(yǎng)健康，預(yù)防巨幼細(xì)胞貧血、認(rèn)知能力障礙、孤獨(dú)癥等。項(xiàng)目申請(qǐng)報(bào)告：檢測(cè)原理: 根據(jù)國(guó)家生物基因檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用評(píng)估認(rèn)證中心頒布的中國(guó)人口健康服務(wù)基因位點(diǎn)認(rèn)證規(guī)程，對(duì)大量基因位點(diǎn)的支持文獻(xiàn)、分子生物學(xué)機(jī)理研究、中國(guó)人群適用性等進(jìn)行綜合分析評(píng)估，以下位點(diǎn)通過(guò)國(guó)家生物基因檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用評(píng)估認(rèn)證中心認(rèn)定，與葉酸利用能力有關(guān)：MTHFR C677 T、MTHFR A1298 C、MTRR A 66G。檢測(cè)方法采用PCR反應(yīng)結(jié)合探針技術(shù)，針對(duì)上述基因的3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物，一個(gè)反應(yīng)體系中通過(guò)兩種 不同通道檢測(cè)一個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性。利用儀器對(duì)PCR過(guò)程中相應(yīng)通道的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性分析。具體包括以下步驟。（1）檢測(cè)的樣品類型與采樣方法檢測(cè)的樣品類型為口腔粘膜上皮細(xì)胞，使用專用的口腔粘膜上皮細(xì)胞采樣方法和器材。采用此方法，具有無(wú)創(chuàng)、取材便捷、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。（2）基因組DNA的抽提方法采用可以特異性結(jié)合DNA的離心吸附柱和獨(dú)特的緩沖系統(tǒng)，可最大限度去除雜質(zhì)蛋白及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物。提取的DNA片段大、純度高，質(zhì)量穩(wěn)定可靠。（3）測(cè)序根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)，檢測(cè)目的基因有沒(méi)突變。 圖3. 項(xiàng)目檢測(cè)流程示意圖圖4. ABI3730測(cè)序儀測(cè)序結(jié)果示意圖項(xiàng)目特色：全面：涵蓋與葉酸代謝障礙相關(guān)的3個(gè)重要位點(diǎn)，本項(xiàng)目同時(shí)為國(guó)家婦幼保健中心推廣的公共實(shí)施項(xiàng)目中所推薦的3個(gè)位點(diǎn)。實(shí)用：能夠檢測(cè)幾乎所有臨床相關(guān)報(bào)道的缺失情況，充分滿足常規(guī)診斷需求。準(zhǔn)確：與位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果結(jié)果符合率100%。報(bào)告解讀： 圖5. 檢測(cè)結(jié)果報(bào)告示意圖結(jié)果示意：“遺傳檢測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估報(bào)告”是向醫(yī)生和檢測(cè)個(gè)體呈現(xiàn)的遺傳檢測(cè)結(jié)果，用以顯示受檢者各個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)的分型結(jié)果，并判斷檢測(cè)個(gè)體在該項(xiàng)目上的遺傳風(fēng)險(xiǎn)。報(bào)告總共分為四個(gè)部分：第一部分：記錄受檢者的個(gè)人基本信息、檢測(cè)單位、樣本相關(guān)信息等內(nèi)容。第二部分：用測(cè)序示意圖的形式直觀的反映出受檢者該遺傳檢測(cè)項(xiàng)目各個(gè)基因位點(diǎn)的分型結(jié)果，除去校驗(yàn)參考位點(diǎn)這些結(jié)果將直接用于個(gè)體遺傳風(fēng)險(xiǎn)判斷。第三部分：這一部分內(nèi)容銜接第二部分，進(jìn)一步說(shuō)明每個(gè)檢測(cè)基因位點(diǎn)的分型結(jié)果、該基因型在中國(guó)人群中的比例、單個(gè)基因型對(duì)疾病發(fā)生的影響，其中“”表示該基因型不會(huì)導(dǎo)致風(fēng)險(xiǎn)升高；“”則導(dǎo)致疾病患病風(fēng)險(xiǎn)上升。第四部分：闡述檢出的風(fēng)險(xiǎn)基因型如何對(duì)孕前/圍產(chǎn)期葉酸產(chǎn)生影響，進(jìn)而對(duì)營(yíng)養(yǎng)異常者進(jìn)行個(gè)性化健康指導(dǎo)。結(jié)果解讀：針對(duì)“孕前/圍產(chǎn)期營(yíng)養(yǎng)需求遺傳檢測(cè)信息報(bào)告”的分析如下：（1）基因位點(diǎn)分型結(jié)果信息孕前/圍產(chǎn)期葉酸利用能力遺傳檢測(cè)項(xiàng)目中包括的位點(diǎn)：MTHFR C 677T、MTHFR A1298 C、MTRR A66 G，參與評(píng)估的位點(diǎn)各個(gè)亞型種類、頻率數(shù)據(jù)及對(duì)疾病的影響如下表：（2）風(fēng)險(xiǎn)基因型對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展的影響根據(jù)受檢者的MTHFR基因 C677 T位點(diǎn)、MTHFR基因 A1298 C位點(diǎn)、MTRR 基因A 66G位點(diǎn)的分型結(jié)果進(jìn)行判讀。如果受檢者M(jìn)THFR基因 C 677T位點(diǎn)的基因型為CT或CC型和MTHFR基因 A1298 C位點(diǎn)的基因型為AA或AC和MTRR 基因A66 G位點(diǎn)的基因型為AA，即未檢出風(fēng)險(xiǎn)基因型，說(shuō)明受檢者的葉酸利用能力正常，進(jìn)行正常的孕前葉酸類營(yíng)養(yǎng)準(zhǔn)備即可。如果受檢者M(jìn)THFR基因 C677 T位點(diǎn)的基因型為TT和(或)MTHFR基因 A1298 C位點(diǎn)的基因型為CC和(或)MTRR 基因A66 G位點(diǎn)的基因型為AG、GG，即檢出風(fēng)險(xiǎn)基因型，提示受檢者具有葉酸利用能力缺陷，易引起葉酸缺乏。需進(jìn)行針對(duì)性補(bǔ)充。風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)干預(yù)1：增補(bǔ)干預(yù)2：生化監(jiān)測(cè)干預(yù)3：強(qiáng)化產(chǎn)前篩查和孕期管理未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)孕前3個(gè)月至孕早期3個(gè)月，每天增補(bǔ)0.4毫克葉酸；孕中、晚期注意食物補(bǔ)充葉酸低度風(fēng)險(xiǎn)孕前3個(gè)月至整個(gè)孕期： 每天增補(bǔ)葉酸0.8毫克孕早期、孕中期、孕晚期、產(chǎn)后42天各監(jiān)測(cè)1次紅細(xì)胞葉酸水平1. 加強(qiáng)對(duì)神經(jīng)管缺陷的產(chǎn)前篩查及診斷：1）AFP檢測(cè)：孕15周-20周，初步篩查胎兒是否患有開(kāi)放性神經(jīng)管畸形。2）B超檢查：無(wú)腦兒14-16周即可確診；脊柱裂17-18周診斷效果較好；腦脊膜膨出16-19周最佳時(shí)機(jī)，不僅要注意檢查顱骨環(huán)、脊柱排列等指征，還必須對(duì)胎兒進(jìn)行系統(tǒng)超聲掃描，對(duì)腹壁、四肢均應(yīng)檢查，以免漏診；唇腭裂20周以后可確診2. 加強(qiáng)對(duì)Down綜合征的產(chǎn)前篩查及診斷：孕 11-14周B超檢測(cè)胎兒鼻骨是否缺如；孕15-21周進(jìn)行血清標(biāo)記物三聯(lián)篩查；綜合其他高危因素確定是否羊水穿刺檢查細(xì)胞染色體。3. 加強(qiáng)對(duì)先天性心臟病產(chǎn)前篩查及診斷：注意用彩超進(jìn)行監(jiān)測(cè)，18-28周為胎兒超聲心動(dòng)圖探查的最佳時(shí)期。4. 加強(qiáng)自發(fā)性流產(chǎn)、妊娠期高血壓等疾病的孕期監(jiān)控。中度風(fēng)險(xiǎn)孕前3個(gè)月至整個(gè)孕期： 每天增補(bǔ)葉酸0.8毫克、2.6微克維生素B12 高度風(fēng)險(xiǎn)孕前3個(gè)月至整個(gè)孕期：每天增補(bǔ)葉酸0.8毫克。對(duì)于MTRR 66AG或GG的受檢者(報(bào)告中第3個(gè)箭頭向上)