醫(yī)學(xué)博士科研計(jì)劃書.doc

LncRNA-ANCR基因表達(dá)對(duì)大鼠退行性脊柱側(cè)凸影響的實(shí)驗(yàn)研究退行性脊柱側(cè)凸(degenerative scoliosis，DS)通常指機(jī)體骨骼成熟后出現(xiàn)的脊柱腰段的側(cè)凸，冠狀面Cobb?角大于10，同時(shí)可以存在矢狀面失衡和/或脊椎的旋轉(zhuǎn)異常。隨著全球人口老齡化及老年人生活方式轉(zhuǎn)變，DS已成為導(dǎo)致脊柱畸形、影響生活質(zhì)量的一種腰椎退行性疾病。由于DS的具體病因還未明確解釋，當(dāng)前關(guān)于DS的研究絕大多數(shù)是針對(duì)治療，涉及病因?qū)W方面的基礎(chǔ)研究很少。因此，進(jìn)一步研究DS的病因及發(fā)病機(jī)制具有非常重要的意義。長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)是長度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA。研究表明，LncRNA在調(diào)控表觀遺傳、細(xì)胞周期和細(xì)胞分化等細(xì)胞分化和個(gè)體發(fā)育的生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，并與人類疾病的發(fā)生密切相關(guān)，其中包括癌癥、退行性疾病在內(nèi)的多種嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病，成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。其中，ANCR（anti-differentiation ncRNA，抗分化ncRNA）為一個(gè)855 bp lncRNA，在細(xì)胞分化期間下調(diào)。ANCR在包含祖細(xì)胞群體中的減少，沒有任何其他刺激，導(dǎo)致快速分化基因誘導(dǎo)。本研究正是選擇LncRNA-ANCR這一基因，旨在通過研究該基因和大鼠DS之間作用關(guān)系，為進(jìn)一步從分子生物學(xué)水平研究DS的發(fā)病機(jī)理，希望從發(fā)病的初始關(guān)鍵環(huán)節(jié)上預(yù)防該類型疾病發(fā)生。參考文獻(xiàn)（1）Dalle-Carbonare L，Innamorati G，Valanti MTTranscription factor Runx2 and its application to bone tissue engineeringJStem Cell Rev，2012，8(3)：891897.（2）Liu TM，IR EH Transcriptional regulatory cascades in Runx2 dependent bone developmentJTissue Eng Part B Rev，2013，19(3)：254263.（3）Lin Zhu，Pei-Cheng Xu，Downregulated LncRNA-ANCR promotes osteoblast differentiation by targeting EZH2 and regulating Runx2 expressionJ，Biochemical and Biophysical Research Communications 432 (2013) 612617.（4）Glass DA. Canonical Wnt signaling in differentiated osteoblasts controls osteoclast differentiationJDev Cell，2010，104(9)：1670216707.（5）劉錫梅，馬越鳴，丁伯平等，大鼠兩種骨質(zhì)疏松模型的建立J.皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001,20(1)：4-5.（6）劉曉陽，邱貴興，翁習(xí)生等，長鏈非編碼RNA在青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸中的表達(dá)研究J.中國骨與關(guān)節(jié)外科，2014,3（7）:235-240.（7）Daffner SD，Vaccaro AR. Adult degene rative lumbarscoliosis.Am J Orthop, 2003,32(2):77-82.（8）Kretz M , Webster DE , Flockhart RJ?etc, Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCRJ, Genes Dev.2012，26 (4) ：338343.（9）李慧章，葉君健。骨形態(tài)發(fā)生蛋白在椎間盤退變中的研究J. 福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005,39（1）：53-55.（10）Cui M;Wan Y;Anderson DG. Mouse growth and differentiation factor-5 protein and DNA therapy potentiates intervertebral disc cell aggregation and chondrogenic gene expressionJ. Spine Journal，2008，8（2）:287-295.創(chuàng)新點(diǎn)：LncRNA是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，在癌癥方面研究相對(duì)較多，本研究借此熱點(diǎn)探討LncRNA-ANCR在大鼠DS發(fā)生發(fā)展過程中的作用。若探明LncRNA-ANCR和DS之間的作用關(guān)系，從而人為地調(diào)控LncRNA-ANCR的作用機(jī)制，從早期防治DS，為防治DS開辟一個(gè)新思路。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與技術(shù)路線：1重組LncRNA-ANCR腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定（1）根據(jù)LncRNA-ANCR前體序列應(yīng)用Primer premier 5 軟件設(shè)計(jì)引物。（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出LncRNA-ANCR前體的DNA序列。（3）LncRNA-ANCR前體的DNA序列重組入腺病毒miRNA表達(dá)載體。（4）應(yīng)用Lipofeetamine 2000將重組LncRNA-ANCR腺病毒表達(dá)載體與輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染如293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝。（5）收集、濃縮、純化和滴定重組LncRNA-ANCR腺病毒。2. 重組LncRNA-ANCR腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs的細(xì)胞學(xué)研究（1）大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的分離、培養(yǎng)選取2月齡大鼠，無菌條件下獲取自體骨髓，用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液梯度離心法進(jìn)行分離、培養(yǎng)，獲得自體原代骨髓干細(xì)胞，傳代培養(yǎng)。應(yīng)用CD45、CD34、CD29、CD105單克隆抗體，F(xiàn)ACS（流式細(xì)胞儀）檢測BMSCs表面抗原表達(dá)。細(xì)胞分組：基因組：LncRNA-ANCR載體轉(zhuǎn)染的BMSCs無關(guān)序列組：無關(guān)序列載體轉(zhuǎn)染的BMSCs空載體組：空載體的BMSCs空白對(duì)照組：無特殊處理的BMSCs（3）檢測BMSCs分化指標(biāo)TaqMan RT-PCR和Western-blot方法分別檢測各組BMSCs內(nèi)BMP7 mRNA、Runx2 mRNA和GDF5 mRNA 以及相應(yīng)蛋白表達(dá)3. 重組LncRNA-ANCR腺病毒表達(dá)載體對(duì)大鼠DS的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：剛斷乳的SD大鼠50只，分5組，每組10只。（2）實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組：無特殊處理模型組：僅雙上肢截肢空載體組：雙上肢截肢+注射空載體轉(zhuǎn)染的BMSCs無關(guān)序列組：雙上肢截肢+注射無關(guān)序列載體轉(zhuǎn)染的BMSCs基因組：雙上肢截肢+注射LncRNA-ANCR載體轉(zhuǎn)染的BMSCs（3）影像學(xué)觀察測量大鼠脊柱形態(tài)變化（4）病理學(xué)：觀察椎體和椎間盤病理變化（5）基因表達(dá)：TaqMan RT-PCR檢測BMP7 mRNA、Runx2 mRNA和GDF5 mRNA表達(dá)（6）蛋白表達(dá)：Westernblot檢測BMP7、Runx2和GDF5蛋白表達(dá)預(yù)期目標(biāo)和意義：成功構(gòu)建和鑒定重組LncRNA-ANCR腺病毒載體。將重組LncRNA-ANCR腺病毒載體轉(zhuǎn)染到BMSCs細(xì)胞中，阻斷或