實(shí)驗(yàn)四原子吸收分光光度法測(cè)定金屬元素含量.doc

蘭 州 理 工 大 學(xué)現(xiàn)代生物儀器分析實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)（四年制生物工程、食品科學(xué)與工程專(zhuān)業(yè)）王永剛 編寫(xiě)生命科學(xué)與工程學(xué)院二零一二年十月 目 錄實(shí)驗(yàn)一、紫外吸收光譜法同時(shí)測(cè)定Vc和VE3實(shí)驗(yàn)二 氣相色譜法測(cè)定酒或酊中C2H5OH含量5實(shí)驗(yàn)三 高效液相色譜法測(cè)定維生素B1含量7實(shí)驗(yàn)四 原子吸收分光光度法測(cè)定金屬元素含量10實(shí)驗(yàn)一、紫外吸收光譜法同時(shí)測(cè)定Vc和VE一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 掌握Cary 50紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)的使用；2 學(xué)會(huì)用解聯(lián)立方程組的方法，定量測(cè)定吸收曲線相互重疊的二元混合物。二、方法原理 維生素C（抗壞血酸）和維生素E（ 生育酚）起抗氧劑作用，即它們?cè)谝欢〞r(shí)間內(nèi)能防止油酯變酪。兩者結(jié)合在一起比單獨(dú)使用的效果更佳，因?yàn)樗鼈冊(cè)诳寡鮿┬阅芊矫媸恰皡f(xié)同的”。因此，它們作為一種有用的組合試劑用于各種食品中。 抗壞血酸是水溶性的， 生育酚是酯溶性的，但它們都能溶于無(wú)水乙醇，因此，能用在同一溶液中測(cè)定雙組分的原理來(lái)測(cè)定它們。根據(jù)朗伯比爾定律，用紫外可見(jiàn)分光光度法很容易定量測(cè)定在此光譜區(qū)內(nèi)有吸收的單一成分。由兩種組分組成的混合物中，若彼此都不影響另一種物質(zhì)的光吸收性質(zhì)，可根據(jù)相互間光譜重疊的程度，采用相對(duì)應(yīng)的方法來(lái)進(jìn)行定量測(cè)定。如：當(dāng)兩組分吸收峰部分重疊時(shí)，選擇適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)，仍可按測(cè)定單一組分的方法處理；當(dāng)兩組分吸收峰大部分重疊時(shí)，則宜采用解聯(lián)立方程組或雙波長(zhǎng)法等方法進(jìn)行測(cè)定。解聯(lián)立方程組的方法是以朗伯比爾定律及吸光度的加合性為基礎(chǔ)，同時(shí)測(cè)定吸收光譜曲線相互重疊的二元組分的一種方法。從圖中可以看出，混合組分在1的吸收A組分和B組分分別在1的吸光度之和A1A+B，即A1A+B=1AbcA+1BbcB同理，混合組分在2的吸光度之和A2A+B應(yīng)為A2A+B=2AbcA+2BbcB若首先用A，B組分的標(biāo)樣，分別測(cè)得A，B兩組分在1和2處的摩爾吸收系數(shù)1A，2A和1B，2B，當(dāng)測(cè)得未知試樣在1和2的吸光度A1和A2后，解下列二元一次方程組：A1 =1AbcA+1BbcBA2 =2AbcA+2BbcB即可求得A，B兩組分各自的濃度cA和cB。一般來(lái)說(shuō)，為了提高檢測(cè)的靈敏度，1和2宜分別選擇在A，B兩組分最大吸收峰處或其附近。三、儀器和試劑儀器： Cary 50紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：美國(guó)瓦里安中國(guó)有限公司； 石英比色皿2只；50mL容量瓶9只，；10mL吸量管2只。試劑：抗壞血酸：稱(chēng)3mg抗壞血酸，溶于無(wú)水乙醇中，并用無(wú)水乙醇定容于100mL； 生育酚：稱(chēng)8mg 生育酚溶于無(wú)水乙醇中，并用無(wú)水乙醇定容于100mL四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液 （1）分別取抗壞血酸貯備液1.00、1.50、2.00、2.50mL于4只10mL比色管中，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻。（2）分別取生育酚貯備液1.00、1.50、2.00、2.50mL于4只10mL比色管中，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻。2. 繪制吸收光譜以無(wú)水乙醇為參比，在320220nm范圍測(cè)繪出抗壞血酸和生育酚的吸收光譜，并確定和。3. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以無(wú)水乙醇為參比，在波長(zhǎng)和，分別測(cè)定步驟1配制的8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。4. 未知液的測(cè)定取未知液5.00mL于50mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻。在和分別測(cè)其吸光度。五、數(shù)據(jù)處理1. 繪制抗壞血酸和生育酚的吸收光譜，確定和。2. 分別繪制抗壞血酸和生育酚在和時(shí)的4條標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出4條直線的斜率，即、和。3. 計(jì)算未知液中抗壞血酸和生育酚的濃度。六、問(wèn)題討論1 今有吸收光譜曲線相互重疊的三元體系混合物，能否用解聯(lián)立方程組的方法測(cè)定它們各自的含量？2設(shè)計(jì)一個(gè)用雙波長(zhǎng)法測(cè)定本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的實(shí)驗(yàn)方案。七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求Vc、VE紫外掃描圖，四條標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 （要求編輯成WORD文檔打印，并作標(biāo)注）結(jié)果計(jì)算報(bào)告實(shí)驗(yàn)二 氣相色譜法測(cè)定酒或酊中C2H5OH含量一、目的要求1學(xué)習(xí)氣相色譜法測(cè)定含水樣品中的C2H5OH含量。2學(xué)習(xí)和熟悉氫火焰檢測(cè)器的調(diào)試及使用方法。3學(xué)習(xí)和掌握色譜內(nèi)標(biāo)定量方法。二、實(shí)驗(yàn)原理內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確而應(yīng)用廣泛的定量分析方法，操作條件和進(jìn)樣量不必嚴(yán)格控制，限制條件較少。當(dāng)樣品中組分不能全部流出色譜柱，某些組分在檢測(cè)器上無(wú)信號(hào)或只需測(cè)定樣品中的個(gè)別組分時(shí)，可采用內(nèi)標(biāo)法。內(nèi)標(biāo)法就是將準(zhǔn)確稱(chēng)量的純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物，加入到準(zhǔn)確稱(chēng)取的樣品中，根據(jù)內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量m 。與樣品的質(zhì)量m 及相應(yīng)的峰面積A 求出待測(cè)組分的含量。待測(cè)組分質(zhì)量mi與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量ms 之比等于相應(yīng)的峰面積之比。式中：fi 、fs 為i 組分和內(nèi)標(biāo)物的相對(duì)質(zhì)量校正因子；Ai 、As 為i 組分和內(nèi)標(biāo)物的峰面積。三、實(shí)驗(yàn)用品1儀器Varian CP3800毛細(xì)管氣相色譜儀 氫火焰檢測(cè)器（FID） 石英毛細(xì)管色譜柱（30m0.32mm，涂層厚0.25mm） 微量注射器 容量瓶（50mL） 吸量管（2mL 、5mL )2藥品： C2H5OH 無(wú)水 AR; n-C3H7OH 無(wú)水 AR 3 其它：食用酒 酊劑檢品四、操作步驟1色譜操作條件柱溫升溫程序：60 1min，10/min升至200，并維持5min.進(jìn)樣溫度200 ，檢測(cè)器溫度300 ，N2（載氣）流速1.0mLmin-1，分流比20：1， H2流速為30mLmin-1，空氣流速300mLmin-1，尾吹氣25ml/min.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定準(zhǔn)確移取2.50 mL 無(wú)水C2H5OH 和2.50 mL 無(wú)水n-C3H7OH于50 mL 容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。用微量注射器吸取0.2L 標(biāo)準(zhǔn)溶液，注入色譜儀內(nèi)，記錄各峰的保留時(shí)間tR，測(cè)量各峰的峰面積，求以n-C3H7OH為標(biāo)準(zhǔn)的相對(duì)校正因子。3 樣品溶液的測(cè)定準(zhǔn)確移取5.00 mL 酒樣及2.50 mL 內(nèi)標(biāo)物無(wú)水n-C3H7OH于50 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。用微量注射器吸取0.2 L 樣品溶液注入色譜儀內(nèi)，記錄各峰的保留時(shí)間tR，以標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品溶液的tR對(duì)照，定性樣品中的醇，測(cè)定C2H5OH 、n-C3H7OH的峰高及半峰寬，求樣品中C2H5OH的含量。五、數(shù)據(jù)處理本實(shí)驗(yàn)C2H5OH的含量按下列公式計(jì)算：式中：iC2H5OH 的質(zhì)量濃度（單位為g mL-1) ;mi樣品中C2H5OH質(zhì)量（單位為g ) ; V樣品溶液體積（單位為mL ) ; 10稀釋倍數(shù)；Ai / As 樣品溶液中C2H5OH與n-C3H7OH的峰面積比；Ai/ A s標(biāo)準(zhǔn)溶液中純C2H5OH 與n-C3H7OH的峰面積比；mi標(biāo)準(zhǔn)溶液中純C2H5OH的質(zhì)量，它等于體積V 乘密度 。六、思考題1. 內(nèi)標(biāo)物的選擇應(yīng)符合哪些條件？用內(nèi)標(biāo)法定量有何優(yōu)缺點(diǎn)？2. 熱導(dǎo)檢測(cè)器和氫火焰檢側(cè)器各有什么特點(diǎn)？七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求附標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液色譜圖 （要求編輯成WORD文檔打印，并作標(biāo)注）結(jié)果計(jì)算報(bào)告 （注意：計(jì)算需要無(wú)水C2H5OH和無(wú)水n-C3H7OH密度，實(shí)驗(yàn)中根據(jù)標(biāo)簽記錄）實(shí)驗(yàn)三 高效液相色譜法測(cè)定維生素B1含量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 學(xué)習(xí)和掌握含維生素樣品的處理和HPLC檢測(cè)方法。2. 進(jìn)一步了解高效液相色譜儀的使用操作性能。3. 掌握標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的建立、數(shù)據(jù)的處理及定量分析。二、實(shí)驗(yàn)原理果蔬及其制品、各種飲料制品中的主要維生素B1可用高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定。樣品經(jīng)過(guò)酸水解處理、離心及超濾，用C-18反相柱和甲醇-庚烷磺酸鈉溶液作流動(dòng)相，在紫外280nm處定量測(cè)定。本法可同時(shí)測(cè)定維生素B2、B3、B6、B12及煙酰胺等多種維生素含量。三、材料與儀器材料：果汁。儀器：100ml量筒、燒杯、移液管、高效液相色譜儀、分析天平、0.45m濾膜、溶劑過(guò)濾器、樣品過(guò)濾器，微量進(jìn)樣器等。4、 試劑 冰醋酸、三乙胺、庚烷磺酸鈉為分析純；甲醇為色譜純；維生素B1標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于98%）。流動(dòng)相的制備：0.005mol/L庚烷磺酸鈉（0.05%三乙胺和0.5%冰醋酸）-甲醇 （72:28）用0.45m膜過(guò)濾，置超聲波振蕩儀上脫氣1h，待用。維生素B1標(biāo)準(zhǔn)母液配制（1mg/mL）：稱(chēng)取維生素B1 100mg，加適量水，置65水浴中振搖15分鐘，冷卻至室溫，定容至100mL。五、操作步驟（一）樣品制備取5 mL果汁至燒杯中，用流動(dòng)相定容至100mL容量瓶中，再用0.45m微孔濾膜過(guò)濾，作為待測(cè)液。（二）色譜條件色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠填料Octadecylsilyl，簡(jiǎn)稱(chēng)ODS C-18柱（4.6mm250mm， 5m）；流動(dòng)相：0.005mol/L庚烷磺酸鈉（0.05%三乙胺和0.5%冰醋酸）-甲醇 （72:28）流速：1.0 ml/min檢測(cè)波長(zhǎng)：UV 280nm 柱溫：30進(jìn)樣量：20l（三）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取維生素B1標(biāo)準(zhǔn)液，用倍比稀釋法稀釋成0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/ml濃度，進(jìn)樣量為20l，進(jìn)行分離，并以各種維生素B1的濃度對(duì)峰高（或峰面積）分別制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)進(jìn)行樣品中各種維生素B1含量的測(cè)定。（四）樣品測(cè)定取樣品處理液20l 進(jìn)行色譜分析，以標(biāo)準(zhǔn)色譜圖進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)保留時(shí)間確定樣品中的維生素B1，并計(jì)算含量。六、計(jì)算按下列公式計(jì)算樣品中維生素B1的含量（C） C=N*（H/Hm）*F.50.（V/W）.（1000/1000） 式中：C各種維生素的含量，以mg/kg（L）表示 N20l維生素含量 g/20l H樣品中某種維生素的峰高（mm） Hm標(biāo)準(zhǔn)溶液中某種維生素的峰高（mm） F稀釋倍數(shù) V樣品的定容體積（100ml） W樣品的稱(chēng)取量（g或ml） 七、注意事項(xiàng)上機(jī)之前對(duì)各樣品及標(biāo)樣用0.45m膜過(guò)濾2ml左右，并用剩余的樣品測(cè) pH值，pH小于2.5不能上機(jī)。手動(dòng)進(jìn)樣時(shí)必需用力均勻，水平注入，避免進(jìn)樣引起誤差。八、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求 1、各濃度標(biāo)準(zhǔn)維生素的洗脫圖 2、樣品洗脫圖。（要求編輯成WORD文檔打?。?3、繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線（在EXCEL中進(jìn)行打印）。 4、結(jié)果計(jì)算報(bào)告思考題1、維生素B1的測(cè)定HPLC法中樣品峰的定性依據(jù)是什么？2、通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)要想得到分離效果較好的樣品洗脫圖譜的工作條件主要取決于哪些？3、HPLC法測(cè)定維生素B1與其它方法比較有哪些優(yōu)點(diǎn)？實(shí)驗(yàn)四 原子吸收分光光度法測(cè)定金屬元素含量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 掌握原子吸收分光光度法的特點(diǎn)及應(yīng)用； 2 了解原子吸收分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)及其使用方法。二、原子吸收光譜法的基本原理 原子吸收光譜分析是基于從光源中輻射出的待測(cè)元素的特征光波通過(guò)樣品的原子蒸氣 時(shí)，被蒸氣中待測(cè)元素的基態(tài)原子所吸收，使通過(guò)的光波強(qiáng)度減弱，根據(jù)光波強(qiáng)度減弱的程 度，可以求出樣品中待測(cè)元素的含量。 利用銳線光源在低濃度的條件下， 基態(tài)原子蒸氣對(duì)共振線的吸收符合朗伯比爾定律式中，A 為吸光度，I0 為入射光強(qiáng)度，Iv 為經(jīng)原子蒸氣吸收后的透射光強(qiáng)度，K 為吸光系數(shù)，l 為輻射光穿過(guò)原子蒸氣的光程長(zhǎng)度，N為基態(tài)原子密度。 當(dāng)試樣原子化，火焰的絕對(duì)溫度低于 3000 K 時(shí)，可以認(rèn)為原子蒸氣中基態(tài)原子的數(shù)目 實(shí)際上接近原子總數(shù)。在固定的實(shí)驗(yàn)條件下，原子總數(shù)與試樣濃度 c 的比例是恒定的，則等 式（1）可記為： A=Kc 是原子吸收分光光度法定量分析的基本關(guān)系式。常用標(biāo)準(zhǔn)曲線法、標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行定量分析。三、儀器設(shè)備1）原子吸收分光光度計(jì)2）50mL容量瓶3）250mL容量瓶4）分析天平5）銅、鈣、鉛等的空心陰極燈四、試劑1標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1000ug/mL）2標(biāo)準(zhǔn)使用液（100ug/mL）準(zhǔn)確吸取10mL上述標(biāo)準(zhǔn)貯備液于100mL容量瓶中，用水稀釋至刻度線，搖勻備用。五、試驗(yàn)步驟1. 樣品前處理樣品消化或灰化。2. 配制標(biāo)準(zhǔn)工作液3. 配制樣品溶液準(zhǔn)確吸取適量樣液置于25mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，使測(cè)定結(jié)果落在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。4. 測(cè)定開(kāi)機(jī)前先檢查水封是否有水，乙炔管道有無(wú)泄漏（空氣中有無(wú)乙炔氣味）, 打開(kāi)抽風(fēng)機(jī) 打開(kāi)電腦以及原子吸收分光光度計(jì)電源開(kāi)關(guān)。分析方法設(shè)計(jì) 進(jìn)入軟件點(diǎn)文件選擇新建選擇分析方法（火焰法、石墨法、氫化物法等） 分析任務(wù)選擇（Cu、Pb、Ca 等）填寫(xiě)數(shù)據(jù)表（批數(shù)、個(gè)數(shù)、測(cè)量次數(shù)、稀釋倍數(shù)） 展開(kāi)完成儀器控制點(diǎn)擊自動(dòng)波長(zhǎng)精調(diào)完成檢測(cè)（準(zhǔn)備兩杯水，一杯 調(diào)零，另一杯洗樣管） 將元素?zé)纛A(yù)熱 30min 打開(kāi)空壓機(jī)，將壓力調(diào)到 0.3Mpa 打開(kāi)乙炔鋼瓶閥，將出氣閥壓力調(diào)到 0.050.06Mpa 之間 調(diào)整燃燒器高度，對(duì)好光路 旋開(kāi)儀器上的乙炔伐，按點(diǎn)火開(kāi)關(guān)，點(diǎn)火，調(diào)節(jié)火焰大小.依次檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)空白（純水）、標(biāo)液 14標(biāo)液，未知樣品。 檢測(cè)完畢后，保存數(shù)據(jù)吸去離子水 10min，關(guān)乙炔，使管道中氣體燒完再關(guān)儀器、電腦、空壓機(jī)。六、數(shù)據(jù)及處理1. 記錄實(shí)驗(yàn)條件（1）儀器型號(hào)（2）吸收線波長(zhǎng)（nm）（3）空心陰極燈電流（mA）（4）狹縫寬度（mm）（5）燃燒器高度（mm）（6）乙炔流量（L/min）（7）空氣流量（L/min）列表記錄