林業(yè)生物技術(shù) 總復(fù)習(xí)資料.doc

第一章 緒論根據(jù)生物學(xué)研究與應(yīng)用技術(shù)可以劃分為細(xì)胞工程 基因工程 發(fā)酵工程 酶工程 蛋白質(zhì)工程基因工程定義：將來源于不同生物的DNA在體外經(jīng)過酶切、連接，構(gòu)成重組的DNA分子，然后轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，使外源基因在受體細(xì)胞中得到表達(dá)的過程。細(xì)胞工程定義：指在細(xì)胞水平上的遺傳操作，即通過細(xì)胞融合、核質(zhì)移植、染色體或基因移植以及組織和細(xì)胞培養(yǎng)等方法，創(chuàng)建新的種質(zhì)、改良品種、改進(jìn)繁殖方法及大規(guī)模生產(chǎn)生物產(chǎn)品的技術(shù)酶工程定義：酶學(xué)原理與化工技術(shù)相結(jié)合而形成的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，它是在一定的反應(yīng)裝置里，利用酶的催化作用，將相應(yīng)的原料轉(zhuǎn)化為有關(guān)物質(zhì)的技術(shù)。 發(fā)酵工程定義：將微生物、生物化學(xué)和化學(xué)工程學(xué)的基本原理有機(jī)地結(jié)合起來，利用微生物（工程菌）的生長和代謝活動(dòng)來生產(chǎn)各種有用物質(zhì)的工程技術(shù)。 蛋白質(zhì)工程定義：又稱第二代基因工程，是利用基因工程等技術(shù)改良天然蛋白質(zhì)的學(xué)科，它需要蛋白質(zhì)化學(xué)、蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)、計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)等學(xué)科的配合，通過對天然編碼蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行修飾，以獲取比天然蛋白質(zhì)更理想的新型蛋白質(zhì)。 生物技術(shù)現(xiàn)狀及展望美國：1999年政府投資高達(dá)180億美元。 美國現(xiàn)有1300多家專業(yè)生物技術(shù)公司和15.3萬多從業(yè)者，其生物技術(shù)產(chǎn)品銷售額在1998年就達(dá)到了134億美元，到2008年達(dá)到362億美元。1996-2010年，生物技術(shù)為發(fā)展中和發(fā)達(dá)國家?guī)砹送瑯拥睦鄯e經(jīng)濟(jì)效益（均為390億）在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)方面：集中在大豆、玉米和棉花上。第一階段：抗病蟲和耐除草劑；第二階段：提高作物的品質(zhì)。比如：全球第一例轉(zhuǎn)基因食品calgene公司的延熟番茄（1993）；抗玉米螟的轉(zhuǎn)基因玉米，抗棉鈴蟲的棉花、耐除草劑的大豆等。在美國，經(jīng)GM修飾或改造的作物或食品，1999年已達(dá)7000萬英畝，目前大約有50大豆、33棉花、大量的玉米、少量的馬鈴薯、油菜和南瓜均是GM。中國：1986年啟動(dòng)“863”高技術(shù)規(guī)劃的提出，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)列為優(yōu)先發(fā)展項(xiàng)目。（植物組織培養(yǎng)技術(shù)，特別是莖尖脫毒快繁技術(shù)）1995年，掌握了轉(zhuǎn)基因植物的全套技術(shù)，包括目標(biāo)基因的分離、克隆、Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的表達(dá)載體的構(gòu)建及目標(biāo)基因表達(dá)的檢測。由于基礎(chǔ)研究較弱，加上投資強(qiáng)度較低（35億人民幣/5年）,“七五”、“八五”、“863”計(jì)劃中的相關(guān)部分的主市調(diào)只能是：跟蹤、模仿和引進(jìn)。展望1. 關(guān)于植物的繁殖（方式、速度等）； 2.關(guān)于動(dòng)物的繁殖與性別控制（數(shù)量、性別）； 3.動(dòng)物克?。嚎寺【d羊Dolly（英國羅林斯研究所），克隆印度野牛（瀕危物種 ）；4.生物反應(yīng)器研究：美國開發(fā)了可生產(chǎn)人凝血酶原III的轉(zhuǎn)基因羊；我國自行研制表達(dá)人凝血因子的轉(zhuǎn)基因山羊（治療血友?。?；英國PPL制藥公司也培育出可制造人胰蛋白酶抑制劑基因的克隆羊，在羊奶中能產(chǎn)生胰蛋白酶抑制劑，可用于治療人類的哮喘病和肺氣腫；荷蘭制藥公司制備了可大量生產(chǎn)人乳鐵蛋白和促紅細(xì)胞生成素（EPO）的轉(zhuǎn)基因牛。5.動(dòng)物或人體器官的復(fù)制（用于器官移植）： 目前人造皮膚和人造耳朵已經(jīng)成功，都是利用皮膚細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)得到的。人類角膜、心臟肺瓣、血管、耳、胰臟、肌肉、乳房組織替代物等工程化組織均已能在實(shí)驗(yàn)室里生長。植物生物技術(shù)的發(fā)展簡史1838-1839年，德國科學(xué)家Schleide 和Schwann發(fā)表了細(xì)胞學(xué)說，奠定了組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)。1902年，德國植物學(xué)家Haberlandt的早期嘗試。 在論文中描述了培養(yǎng)細(xì)胞的生長情況，但沒有觀察到細(xì)胞的分裂增值。1904年，Hanning進(jìn)行幼胚培養(yǎng)獲得小苗（蘿卜，辣根）；1922年，Kotte和Robbins（Haberlandt的學(xué)生），培養(yǎng)豌豆和玉米的莖尖培養(yǎng)，形成根和缺綠的葉片，可進(jìn)行有限的生長（部分成功）；1933年，李繼侗發(fā)現(xiàn)胚乳對胚培養(yǎng)的促進(jìn)作用（銀杏） ；1934年，Gautheret培養(yǎng)形成層，獲得愈傷組織（山毛櫸、黑楊）；同年，White培養(yǎng)番茄的根尖細(xì)胞，建立了第一個(gè)能夠活躍分裂的單細(xì)胞無性系（28年，1600代），系統(tǒng)研究了光照、溫度、pH、培養(yǎng)基組成對培養(yǎng)物的影響；1937年，White發(fā)明了第一個(gè)人工合成培養(yǎng)基；1937-1939年，愈傷組織的繼代培養(yǎng)獲得成功（胡蘿卜，煙草）；1943年，White重新提出“植物細(xì)胞全能性”學(xué)說，出版了植物組織培養(yǎng)手冊，標(biāo)志著植物組培技術(shù)的建立，被譽(yù)為“植物組織培養(yǎng)之父”；1948年，Skoog和崔澂發(fā)現(xiàn)腺嘌呤對煙草莖段培養(yǎng)物的芽的形成有誘導(dǎo)作用（腺嘌呤/IAA）；70年代以后，原生質(zhì)體培養(yǎng)、原生質(zhì)體融合的研究形成熱潮80年代以后，基因克隆、遺傳轉(zhuǎn)化的研究更是如火如荼，在許多方面取得了令人矚目的成果1973年，重組DNA技術(shù)誕生，植物基因工程始于20世紀(jì)80年代（Monsanto公司） 。Fraley1984年在Science 發(fā)表“利用農(nóng)桿菌來轉(zhuǎn)移外源DNA至白花丹葉煙草原生質(zhì)體中”。表明：定向改造植物成為可能。在農(nóng)林產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用農(nóng)業(yè)科學(xué)A、 良種繁育及脫毒苗木。B、種質(zhì)資源的保存。C、育種上的應(yīng)用。分子育種細(xì)胞育種 第二章 細(xì)胞工程原理細(xì)胞工程: 指在細(xì)胞整體水平或細(xì)胞器水平上研究開發(fā)、利用各類細(xì)胞的工程，即人們根據(jù)科學(xué)設(shè)計(jì)，改變細(xì)胞的遺傳基礎(chǔ)，通過無菌操作、細(xì)胞融合、核質(zhì)移植、染色體或基因移植以及組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)等方法，改變細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)以快速繁殖和培養(yǎng)出人們所需要的新物種的技術(shù)。細(xì)胞工程的研究內(nèi)容:動(dòng)、植物細(xì)胞與組織培養(yǎng)、細(xì)胞融合、染色體工程、胚胎工程、細(xì)胞遺傳工程植物細(xì)胞工程：是指通過細(xì)胞培養(yǎng)、融合等細(xì)胞水平的操作，以及包含有多細(xì)胞的植物結(jié)構(gòu)離體培養(yǎng)或操作，實(shí)現(xiàn)以細(xì)胞全能性為基礎(chǔ)的改良種質(zhì)或生產(chǎn)生物產(chǎn)品為目的的技術(shù)體系。植物活細(xì)胞的生命特征:新陳代謝 應(yīng)激性 自體復(fù)制離體細(xì)胞的生命特征:培養(yǎng)細(xì)胞具備新陳代謝特性 、培養(yǎng)細(xì)胞具備應(yīng)激性、培養(yǎng)細(xì)胞可以展現(xiàn)自體復(fù)制特性培養(yǎng)基提供的營養(yǎng)物質(zhì)包括碳水化合物、無機(jī)氮和有機(jī)氮、其他礦物營養(yǎng)、維生素等。水無機(jī)營養(yǎng)物（無機(jī)鹽）碳源維生素生長調(diào)節(jié)物質(zhì)有機(jī)附加物瓊脂活性炭抗生素水：培養(yǎng)基中大部分是水它使細(xì)胞質(zhì)呈膠體狀態(tài)，活化狀態(tài)也是細(xì)胞中各種生理、生化反應(yīng)的介質(zhì)起著維持細(xì)胞一定滲透壓與膨壓的作用并為植物機(jī)體提供氫、氧元素配制培養(yǎng)基時(shí)，一般用蒸餾水或去離子水，使水中少含或不含某些離子。無機(jī)營養(yǎng)物包括大量元素和微量元素。大量元素是指氮(N)、磷(P)、鉀(K)、硫(S)、鈣(Ca)、氯(Cl)和鎂(Mg)。它們是植物細(xì)胞中構(gòu)成核酸、蛋白質(zhì)、酶系統(tǒng)、葉綠體以及生物膜所必不可少的元素。微量元素是指鐵(Fe)、硼(B)、錳(Mn)、鋅(Zn)、鈷(Co)、鉬(Mo)、銅(Cu)等，其需要量很少，大多為10-510-7mol/L，稍多則產(chǎn)生毒害。碳源：外植體光合作用的能力低，需要在培養(yǎng)基中添加一些碳水化合物作為生長發(fā)育的能源一般是添加蔗糖、葡萄糖和果糖，其中以蔗糖最常用，效果也最好糖類在培養(yǎng)基中除了作為碳源和能源外，還具有維持培養(yǎng)基一定滲透壓的作用大多數(shù)植物細(xì)胞對蔗糖的需求范圍是1-5(可維持的滲透壓范圍在-152至-415kPa蔗糖作為碳源和滲透劑的比例約為3:1-3:2，約有1/4至2/5的蔗糖用于保持培養(yǎng)基的滲透壓維生素類與植物體內(nèi)各種酶的形成有關(guān)維生素類的種類很多，在植物組織培養(yǎng)中通常以B族維生素為主使用濃度一般為0.1-1.0mg/L，其中以維生素鹽酸硫胺素(Vit.B1)、鹽酸吡哆素(Vit.B6)、煙酸（Vit. B3)、Vit.B12、泛酸鈣(Vit.B5)、生物素(Vit.H)及維生素C最常用。肌醇(環(huán)己六醇)本身不促進(jìn)外植體生長，但可能有助于活性物質(zhì)發(fā)揮作用；培養(yǎng)基中的肌醇用量為50-100 mg/L。培養(yǎng)基中重要的有機(jī)氮源甘氨酸(Gly)、 絲氨酸(Ser)、 酪氨酸(Tyr)、 谷氨酰胺(Gln)、 天冬酰胺(Asn)等甘氨酸能促進(jìn)離體根的生長，對植物組織培養(yǎng)物的生長也有良好的促進(jìn)效果絲氨酸和谷氨酰胺有利于花藥胚狀體或不定芽的分化水解酪蛋白(CH)和水解乳蛋白(LH)也是多種氨基酸的混合物，對胚狀體或不定芽或多胚的分化有良好的促進(jìn)作用酪氨酸可不同程度地替代水解酪蛋白或水解乳蛋白的作用生長素主要作用：誘導(dǎo)愈傷組織的形成、胚狀體的產(chǎn)生以及試管苗的生根，更重要的是配合一定比例的細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)腋芽及不定芽的產(chǎn)生常用：2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、NAA(萘乙酸)、IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚丁酸)作用強(qiáng)弱順序?yàn)椋?,4-DNAAIBAIAA有不同的適宜濃度細(xì)胞分裂素：主要作用：促進(jìn)細(xì)胞的分裂和器官分化、延緩組織的衰老、增強(qiáng)蛋白質(zhì)的合成、抑制頂端優(yōu)勢、促進(jìn)側(cè)芽的生長及顯著改變其他的激素作用。常用：激動(dòng)素(KT)、6-芐基腺嘌吟(6-BA)、玉米素(ZT)、2-異戊烯腺嘌呤(2-iP)、吡效隆(4PU，CPPU)和噻重氮苯基脲(TDZ)。強(qiáng)弱順序?yàn)椋篢DZ4PUZT2-iP6-BAKT瓊脂：瓊脂是從海藻中提取的一種高分子碳水化合物，它的主要作用是使培養(yǎng)基在常溫下凝固，同時(shí)不參與代謝在植物細(xì)胞與組織培養(yǎng)中一直被作為首選固體培養(yǎng)基質(zhì)而廣泛應(yīng)用用量一般在0.61.0當(dāng)培養(yǎng)基pH值偏酸時(shí)，則瓊脂用量要增加滅菌時(shí)間過長、溫度過高均會影響其凝固活性炭：主要目的是利用其吸附能力，減少一些有害物質(zhì)的影響可以防止酚類物質(zhì)引起的組織褐化死亡，這在蘭花組織培養(yǎng)中效果更明顯活性炭使培養(yǎng)基變黑，有利于植物生根活性炭對形態(tài)發(fā)生和器官形成有良好的效應(yīng)既吸附有害物質(zhì)，也吸附有利物質(zhì)，如植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、培養(yǎng)基成分降低培養(yǎng)基的pH值，使瓊脂不易凝固不宜過濃，以0.1-0.5為宜抗生素：主要目的：防止外植體內(nèi)生菌造成的污染。 常用的抗生素：青霉素、鏈霉素、土霉素、四環(huán)素、氯霉素、利福平、卡那霉素和慶大霉素等，用量一般為520mg/L。大部分抗生素要求過濾滅菌?？傮w來說，在高等植物離體培養(yǎng)中，特別是在商業(yè)性快速繁殖中，應(yīng)當(dāng)盡量避免使用抗生素!培養(yǎng)細(xì)胞的分化與形態(tài)發(fā)生脫分化：是指離體培養(yǎng)條件下生長的細(xì)胞、組織或器官經(jīng)過細(xì)胞分裂或不分裂逐漸失去原來的結(jié)構(gòu)和功能而恢復(fù)分生狀態(tài)，形成無組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織或成為未分化細(xì)胞特性的細(xì)胞的過程。啟動(dòng)階段：細(xì)胞質(zhì)增生，并開始向細(xì)胞中央伸出細(xì)胞質(zhì)絲，液泡蛋白體出現(xiàn)。 演變階段：細(xì)胞核開始向中央移動(dòng)，質(zhì)體演變成原質(zhì)體。脫分化終結(jié)期：回復(fù)到分生細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞分裂即將開始。 影響脫分化的因素：機(jī)械損傷、培養(yǎng)細(xì)胞的異質(zhì)性、生長調(diào)節(jié)劑、光線再分化：離體培養(yǎng)的植物細(xì)胞和組織可以由脫分化狀態(tài)重新進(jìn)行分化，形成另一種或幾種類型的細(xì)胞、組織、器官，甚至形成完整植株，這個(gè)過程（現(xiàn)象）稱為再分化。導(dǎo)管分化及其影響因素：離體條件下，導(dǎo)管分子由愈傷組織薄壁細(xì)胞分化形成，是愈傷組織細(xì)胞分化器官的前提。 生長調(diào)節(jié)劑。 生長素對維管組織分化過程有顯著影響。 細(xì)胞分裂素對木質(zhì)部分化的影響，主要表現(xiàn)在對生長素起協(xié)調(diào)和增效的作用。 生長素對維管組織分化所起的作用，很大程度下取決于糖的存在。低濃度生長素條件下，愈傷組織形成木質(zhì)分子和韌皮分子的相對量，隨蔗糖濃度變化而變化。細(xì)胞分化過程及其機(jī)理：極性：指植物的器官、組織，甚至單個(gè)細(xì)胞在不同軸向上存在某種形態(tài)結(jié)構(gòu)以及生理生化上的梯度差異。極性是植物細(xì)胞分化中的一個(gè)基本現(xiàn)象。導(dǎo)管分化的一個(gè)重要環(huán)節(jié)是細(xì)胞壁的形成。生長調(diào)節(jié)劑是導(dǎo)管分化的啟動(dòng)者，通過它和糖等其他因子的協(xié)同配合，誘使細(xì)胞內(nèi)部的RNA和蛋白質(zhì)物質(zhì)代謝發(fā)生變化，PAL酶活性增強(qiáng)，導(dǎo)致木質(zhì)素的沉積。木質(zhì)素沉積的過程中，細(xì)胞壁加厚，原生質(zhì)自溶，細(xì)胞核和細(xì)胞器消失，細(xì)胞骨架呈網(wǎng)狀螺旋排列，整個(gè)細(xì)胞變成管狀細(xì)胞。在整個(gè)植物體內(nèi)或愈傷組織中，此時(shí)導(dǎo)管細(xì)胞長軸兩端穿孔與另一細(xì)胞連通，進(jìn)一步形成完整的輸導(dǎo)組織，完成導(dǎo)管分子的分化。擬分生組織：又稱分生組織結(jié)節(jié)，是指培養(yǎng)物中出現(xiàn)的類似分生組織的細(xì)胞群，它是由脫分化后的培養(yǎng)物發(fā)生一系列細(xì)胞分裂而產(chǎn)生的一團(tuán)細(xì)胞組成的。這些細(xì)胞體積小、薄壁、液泡小、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色較深，它們具分化上的可塑性。器官分化：培養(yǎng)條件下的組織或細(xì)胞團(tuán)分化形成不定根、不定芽等器官的過程。離體條件下，器官分化是在人工輔助調(diào)節(jié)下完成的。器官分化過程不通過愈傷組織：外植體已存在器官原基，進(jìn)一步形成組織器官植株或外植體某些部位的細(xì)胞，重新分裂后直接形成分生細(xì)胞團(tuán)，然后由分生細(xì)胞團(tuán)形成器官原基完整植株的形成：胚胎發(fā)生和器官發(fā)生 植物的體細(xì)胞胚胎發(fā)生是指雙或單倍體的體細(xì)胞在特定條件下，未經(jīng)性細(xì)胞融合而通過與合子胚胎發(fā)生類似的途徑發(fā)育出新個(gè)體的形態(tài)發(fā)生過程。體細(xì)胞胚胎的發(fā)生來源外植體直接發(fā)生二倍體胚、愈傷組織產(chǎn)生胚狀體、懸浮細(xì)胞產(chǎn)生胚、單倍體胚胎發(fā)生原生質(zhì)體發(fā)生胚狀體培養(yǎng)細(xì)胞變異的遺傳機(jī)理：細(xì)胞異常有絲分裂、染色體斷裂、DNA核內(nèi)重復(fù)復(fù)制、核基因突變、轉(zhuǎn)座子的活化 第三章原生質(zhì)體技術(shù)原生質(zhì)體：指除去細(xì)胞壁的細(xì)胞或是說一個(gè)被質(zhì)膜所包圍的裸露細(xì)胞。核質(zhì)體：由原生質(zhì)膜和薄層細(xì)胞質(zhì)包圍細(xì)胞核形成的小原生質(zhì)體。也稱為微小原生質(zhì)體胞質(zhì)體：含細(xì)胞核而僅含有部分細(xì)胞質(zhì)的原生質(zhì)體。原生質(zhì)體的研究進(jìn)展1、1863年，Hanstein首次起用原生質(zhì)體(protoplast)一詞。2、1892年，Klercker用刀片細(xì)切植物組織機(jī)械分離出原生質(zhì)體。3、1960年，Cocking首次應(yīng)用酶法制備番茄根原生質(zhì)體獲得成功。4、1971年，Takebe et al.首次得到煙草葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)的再生植株。5、1985年，F(xiàn)ujimura et al.第一例禾谷類作物水稻原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株。6、1986年，Spangenberg et al.單個(gè)原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株在甘藍(lán)型油菜上獲得成功。 葉片經(jīng)典材料。 自從1971年Takebe等利用煙草葉肉組織成功分離出原生質(zhì)體并使其再生植株以來，利用葉片分離原生質(zhì)體已被廣泛應(yīng)用。 一般可能認(rèn)為選取細(xì)胞分裂旺盛的生長點(diǎn)附近的嫩葉較為合適，但是，許多試驗(yàn)結(jié)果表明，選用充分展開的成熟葉片或生理活性稍稍衰退的過熟葉片，有利于原生質(zhì)體的分離及其后的培養(yǎng)。處理：在葉片取材之前，通常先對供體植株進(jìn)行適當(dāng)?shù)母珊堤幚硎蛊涮幱谳p度的萎蔫狀態(tài)。也可以對離體葉片的切塊先進(jìn)行質(zhì)壁分離，這樣分離原生質(zhì)體的效果更好。 材料預(yù)處理對于某些植物非常重要。 分離得到的原生質(zhì)體，其活力和分裂頻率高低是影響原生質(zhì)體培養(yǎng)成功的2個(gè)決定性的因素。 在游離原生質(zhì)體前對供體材料進(jìn)行預(yù)處理及預(yù)培養(yǎng)，可以提高某些材料原生質(zhì)體的活力和分裂頻率。 用黑暗處理、低溫處理和不同光質(zhì)照射等方法，可提高某些材料原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。不同植物及材料類型預(yù)處理方法不同。 例如 龍膽試管苗的葉片只有用4低溫處理，甘蔗植株必須先在黑暗條件下培養(yǎng)12h后分離的原生質(zhì)體才能分裂。 原生質(zhì)體的收集與純化概念：酶解液中，有完整的原生質(zhì)體、破碎的原生質(zhì)體、未去壁的細(xì)胞、細(xì)胞器及其它碎片。同時(shí)，還含有酶及其它不利于原生質(zhì)體培養(yǎng)、再生的試劑。 這些在原生質(zhì)體培養(yǎng)中會引起干擾作用，必須清除，這一過程稱為純化。即從酶解液中獲得純凈原生質(zhì)體的過程。方法：先濾除組織碎片和殘?jiān)僖孕碌臐B透壓穩(wěn)定劑或原生質(zhì)體培養(yǎng)基離心洗滌2-4次。主要方法： 漂浮法、界面法和沉降法等。原理：采用比原生質(zhì)體比重大的高滲溶液，使原生質(zhì)體漂浮在溶液表面。1、將含有原生質(zhì)體的酶液混勻，通過孔徑44-169 m的篩網(wǎng)過濾（孔徑大小因植物種類而異），除去組織碎片和殘?jiān)?、將濾液與高滲溶液混合，在900-4500r/min下離心，棄上層碎片溶液，小心吸取中層原生質(zhì)體。重復(fù)2-3次。優(yōu)點(diǎn)：可得到較為純凈、完整的原生質(zhì)體。缺點(diǎn)：由于高滲溶液對原生質(zhì)體常有破壞，因而完好的原生質(zhì)體少。原生質(zhì)體活力測定目測法：在顯微鏡下觀察，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、流動(dòng)性確定原生質(zhì)體活力。FDA法：FDA（二乙酸熒光素）是一種非極性物質(zhì)，不能自由地穿越細(xì)胞質(zhì)膜，在活細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)DA被酯酶裂解即發(fā)熒光（熒光素），由于熒光素不能自由通過質(zhì)膜，因而可以在熒光顯微鏡下通過具熒光的細(xì)胞的觀察確定細(xì)胞活性。伊凡藍(lán)法：伊凡藍(lán)不能穿過質(zhì)膜，只有質(zhì)膜受到嚴(yán)重?fù)p壞使，細(xì)胞才能被染色，因而可以通過細(xì)胞被染色與否確定活性。 影響原生質(zhì)體活力的因素分離材料的生理狀態(tài)酶解條件：酶活力和純度濃度、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶溶液的滲透壓分離條件：純化方法、離心次數(shù)、離心速度、分離持續(xù)時(shí)間環(huán)境條件：操作環(huán)境的溫度、分離用具的影響 原生質(zhì)體培養(yǎng)基：無機(jī)鹽、大量元素濃度；MS或B5中NO3和NH4+的比例，應(yīng)適當(dāng)降低。Ca2+濃度高濃度有利于原生質(zhì)體或再生細(xì)胞的分裂。 有機(jī)成分維生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。 激素 常用的激素：NAA、IAA、BA與2,4-D 滲透壓常用的滲透壓調(diào)節(jié)劑：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。原生質(zhì)體的滲透壓原則：培養(yǎng)基滲透壓與細(xì)胞滲透壓等滲。 液體淺層培養(yǎng) 將含有原生質(zhì)體的培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿底部鋪一薄層，封口后進(jìn)行培養(yǎng)。 優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，對原生質(zhì)體的損傷小，且易于添加新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物。 缺點(diǎn)：是原生質(zhì)體分布不均勻，常常發(fā)生原生質(zhì)體之間的粘連現(xiàn)象而影響其進(jìn)一步的生長和發(fā)育。此外，難以跟蹤觀察某一個(gè)細(xì)胞的發(fā)育情況。 固體平板培養(yǎng)固體培養(yǎng)也就是瓊脂糖包埋培養(yǎng)。低融點(diǎn)的瓊脂糖可在30C左右融化與原生質(zhì)體混合而不影響原生質(zhì)體的生命活動(dòng)?；旌虾蟮暮性|(zhì)體的培養(yǎng)基鋪于培養(yǎng)皿底部，封口后進(jìn)行培養(yǎng)。 優(yōu)點(diǎn)：可以跟蹤觀察單個(gè)原生質(zhì)體的發(fā)育情況，易于統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體分裂頻率。 缺點(diǎn)：是操作要求嚴(yán)格，尤其是混合時(shí)的溫度掌握必需合適，溫度偏高則影響原生質(zhì)體的活力，溫度偏低則瓊脂糖凝固太快原生質(zhì)體不易混合均勻。影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素 基因型 通過番茄與秘魯番茄有性雜交后對性狀分離的遺傳分析，證明其愈傷組織的再生能力是2個(gè)顯性基因所決定的。Cheng和Veilleux(1991)對芙薯(S. Phureja)原生質(zhì)體的培養(yǎng)能力也做過遺傳分析，并證明從原生質(zhì)體培養(yǎng)到形成愈傷組織是受2個(gè)獨(dú)立位點(diǎn)的顯性基因所控制(Cheng et al., 1991)。培養(yǎng)成份Ca2+ , NH4+滲透穩(wěn)定劑培養(yǎng)密度：105個(gè)/ml。低密度條件下，細(xì)胞代謝產(chǎn)物擴(kuò)增到培養(yǎng)基中影響細(xì)胞內(nèi)濃度。PEG融合： PEG的作用機(jī)理： Kao等認(rèn)為，由于PEG(聚乙二醇)分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵，從而在原生質(zhì)體之間形成分子橋，其結(jié)果是使原生質(zhì)體發(fā)生粘連，進(jìn)而促使原生質(zhì)體的融合；另外，PEG能增加類脂膜的流動(dòng)性，也使原生質(zhì)體的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。 PEG 誘導(dǎo)融合的特點(diǎn)：其優(yōu)點(diǎn)是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。 缺點(diǎn)：融合過程繁瑣，PEG可能對細(xì)胞有毒害。電融合法： 原理：當(dāng)原生質(zhì)體以適當(dāng)?shù)娜芤簯腋』旌虾螅迦腚姌O，接通一定的交變電場。在電場中，原生質(zhì)體極化后順著電場緊密接觸成珍珠串狀。此時(shí)瞬間施以適當(dāng)強(qiáng)度的電脈沖，則使原生質(zhì)體膜被擊穿而發(fā)生融合。 與PEG融合比較，電融合有三大優(yōu)點(diǎn)： 不使用有毒害的試劑，作用條件溫和，不存在對細(xì)胞的毒害問題、 融合基本上是同步發(fā)生，融合效率高、融合技術(shù)操作簡便。原生質(zhì)體的融合過程膜的融合、 細(xì)胞質(zhì)融合: 發(fā)生膜融合后的數(shù)小時(shí) 、核融合:融合可能發(fā)生在細(xì)胞間期，也可能發(fā)生在第一次同步分裂過程中 。影響原生質(zhì)體的融合因素融合方法融合參數(shù)：包括各種融合液都應(yīng)選擇適當(dāng)以及電壓和電流等。原生質(zhì)體質(zhì)量：對細(xì)胞的融合起著至關(guān)重要的作用，高質(zhì)量的原生質(zhì)體是細(xì)胞融合的先決條件。細(xì)胞雜種的選擇方法有： 外觀選擇：質(zhì)體、細(xì)胞體積等 互補(bǔ)選擇：抗生素、營養(yǎng)缺陷型等 熒光標(biāo)記選擇：親本標(biāo)記不同熒光 體細(xì)胞雜種植株的鑒定形態(tài)鑒定：根據(jù)雙親的形態(tài)學(xué)性狀觀察進(jìn)行鑒定。 細(xì)胞學(xué)鑒定：細(xì)胞器鑒定、染色體鑒定、染色體原位雜交生化鑒定：同功酶鑒定。分子鑒定：RFLP鑒定、RAPD標(biāo)記鑒定。 第四章 基因工程原理1，基因的表達(dá)：基因mRNA 肽鏈蛋白質(zhì)性狀,基因：一個(gè)具有遺傳功能的特定核苷酸序列的DNA片段。 基因工程：“在細(xì)胞外，把目的核酸分子與載體核酸分子組合成新的遺傳物質(zhì)，再把它導(dǎo)入原本沒有這種物質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)，并使這種重組遺傳物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)無性繁殖獲得成功”的工作內(nèi)容。2基因工程理論依 ：不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)?；蚴强梢苑蛛x的?；蚴强梢赞D(zhuǎn)移的。多肽和基因之間存在對應(yīng)關(guān)系。遺傳密碼是通用的?；蚩梢酝ㄟ^復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代。3基因與DNA的關(guān)系：具有遺傳效應(yīng)的片段。基因功能：決定生物性狀的基本單位基因與染色體的關(guān)系：在染色體上呈直線排列。染色體是基因的主要載體。4基因的傳遞規(guī)律：1，核基因遺傳:基因分離定律、基因自由組合定律；質(zhì)基因遺傳：細(xì)胞質(zhì)遺傳，2核基因變異:基因突變、基因重組；質(zhì)基因變異：基因突變5麥克林托克，1951年提出了可移動(dòng)的遺傳基因（即“跳躍基因”）學(xué)說基因可從染色體的一個(gè)位置跳躍到另一個(gè)位置、甚至從一條染色體跳躍到另一條染色體，為研究遺傳信息的表達(dá)與調(diào)控、生物進(jìn)化與癌變提供了線索。18561864年，奧地利遺傳學(xué)家孟德爾（G.Mendel）“豌豆試驗(yàn)”，提出遺傳因子概念，獨(dú)立分配率。1910年，美國遺傳學(xué)家摩爾根（T.H.Morgan）“果蠅試驗(yàn)”，遺傳性狀的連鎖定律、互換定律，創(chuàng)立了遺傳的染色體理論二、基因工程的準(zhǔn)備階段1、理論上的三大發(fā)現(xiàn)生命的遺傳物質(zhì)是DNA（細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)；噬菌體感染實(shí)驗(yàn)）DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機(jī)理遺傳信息的傳遞方式（中心法則）2、基因工程研究簡史技術(shù)上的三大發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)。（標(biāo)志著DNA重組時(shí)代的開始）載體的使用。1970年，逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)。3、DNA重組 是根據(jù)人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)密的設(shè)計(jì)，在生物體外通過人為的DNA片段化和重新連接，產(chǎn)生新的重組DNA分子，使遺傳信息發(fā)生變化，達(dá)到基因重組等預(yù)期目標(biāo)。4、一般來講，基因工程研究應(yīng)包括6個(gè)主要內(nèi)容或步驟：（1）分離：從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴(kuò)增等方法，分離帶有目的基因的DNA片段。（2）連接：在體外，將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制，并帶有選擇標(biāo)記的載體分子上，形成重組DNA分子。（3）轉(zhuǎn)化：通過細(xì)胞轉(zhuǎn)化手段將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞。（4）增殖：培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，獲得大量的細(xì)胞繁殖群體。（5）檢測：篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆，并從這些篩選出來的受體細(xì)胞克隆中提取已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因，做序列分析等鑒定。（6）表達(dá)：將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)。三、基礎(chǔ)研究克隆載體：原核生物克隆載體，Ti質(zhì)粒，動(dòng)物病毒克隆載體克隆載體：通過不同途徑能將承載的外源DNA片段（基因）帶入受體細(xì)胞，并在其中得以維持的DNA分子。受體系統(tǒng)：原核生物（大腸桿菌、藍(lán)藻）和真核生物（酵母菌、植物、生殖細(xì)胞、人的體細(xì)胞）受體系統(tǒng)：是克隆載體的寄主，是外源目的基因表達(dá)的場所人類基因組計(jì)劃： 23對染色體、3109核苷酸對、編碼至少10萬個(gè)基因。 1990年，人類基因組計(jì)劃在美國正式啟動(dòng)。 1999年，中國獲準(zhǔn)加入人類基因組計(jì)劃，承擔(dān)1%的測序任務(wù)，成為參與這一計(jì)劃的惟一發(fā)展中國家。 2003年4月14日，中、美、日、德、法、英等6國科學(xué)家宣布人類基因組序列圖繪制成功，人類基因組計(jì)劃的所有目標(biāo)全部實(shí)現(xiàn)。 1985年穆利斯發(fā)明了高效復(fù)制DNA片段的“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)”技術(shù)，利用該技術(shù)可從極其微量的樣品中大量生產(chǎn)DNA分子，使基因工程獲得了革命性發(fā)展。二、應(yīng)用研究 基因工程藥物：基因工程活性肽、基因工程疫苗、DNA藥物 轉(zhuǎn)基因植物：抗病蟲害、抗除草劑、抗逆性、改善植物品質(zhì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：改良家畜、家禽和魚的經(jīng)濟(jì)性狀、通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)某些藥物和蛋白質(zhì) 其他：酶制劑、食品、化學(xué)與能源、環(huán)境保護(hù) 第五章 基因重組及表達(dá)調(diào)控一、基因與基因組1、DNA的結(jié)構(gòu) 堿基組成：A T C G 堿基互補(bǔ)原則 結(jié)構(gòu)：雙螺旋結(jié)構(gòu)表示方法：單鏈5-3 DNA的變性、復(fù)性 DNA的存在形式：線性、環(huán)狀、開環(huán)2、DNA的功能（1）DNA分子能在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制：半保留復(fù)制，復(fù)制起始點(diǎn)，復(fù)制子 ，原核生物是單復(fù)制子，真核生物是多復(fù)制子（同一代細(xì)胞的增殖，生殖） （2）攜帶遺傳信息：發(fā)育3 、基因的結(jié)構(gòu)A、原核生物的基因結(jié)構(gòu)：RNA聚合酶能夠識別調(diào)控序列中的結(jié)合位點(diǎn)，并與其結(jié)合。轉(zhuǎn)錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動(dòng)，并與DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。轉(zhuǎn)錄完畢后，RNA鏈釋放出來，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來。非編碼區(qū)：不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì) 。編碼區(qū): 能夠轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的信使RNA，進(jìn)而指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成，也就是說能夠編碼蛋白質(zhì) 。B、原核生物結(jié)構(gòu)基因組成 轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、基因編碼區(qū)、轉(zhuǎn)錄終止子。 啟動(dòng)子：DNA上RNA聚合酶識別、結(jié)合和促使轉(zhuǎn)錄的一段核苷酸序列。 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)：轉(zhuǎn)錄mRNA的第一個(gè)堿基，多數(shù)是A，以此作為序列的1，其上游核苷酸序列為“一”，下游核苷酸序列為“”。 基因編碼區(qū)：包括起譯碼ATG、開讀框和休止碼TAA（TAG、TGA）。 終止子：提供轉(zhuǎn)錄停止信息的核苷酸序列。C、真核生物的基因結(jié)構(gòu)外顯子：能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子。 內(nèi)含子：不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子，內(nèi)含子不能轉(zhuǎn)錄為成熟的信使RNA。D、真核生物結(jié)構(gòu)基因組成 基因單獨(dú)存在，兩個(gè)基因之間有很長的間隔序列區(qū)。內(nèi)含子、外顯子。 轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子有3個(gè)保守序列區(qū)：20-30：TATA框，DNA在此處開始解鏈； 70：CAAT框，RNA聚合酶結(jié)合。 更上游：GC框，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合。 終止子下游有一保守的AATAAA提供轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的釋放信號。 不具SD序列區(qū)，核糖體與轉(zhuǎn)錄的mRNA結(jié)合靠mRNA5端添加的“帽”結(jié)構(gòu)。4、基因組 基因組(genome)：一特定生物體的整套(單倍體)遺傳物質(zhì)的總和。 基因組的大小用全部DNA的堿基對總數(shù)表示。 人基因組3109(30億bp)，共編碼約10萬個(gè)基因原核生物基因組與真核生物基因組（1）基因組DNA分子量小。主體為單個(gè)環(huán)狀染色體，僅一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。重復(fù)序列少。不編碼的DNA序列少。廣泛存在操縱子結(jié)構(gòu)。（2）真核生物具有真正的核結(jié)構(gòu)核一定數(shù)目的染色體。真核生物基因組遠(yuǎn)大于原核生物，具多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。大部分基因具有內(nèi)含子。非編碼序列量多于編碼序列。存在大量重復(fù)DNA序列。未發(fā)現(xiàn)原核生物的操縱子結(jié)構(gòu)5、染色體結(jié)構(gòu) 染色體包括：DNA和蛋白質(zhì)二、基因的轉(zhuǎn)移和重組1 、基因的轉(zhuǎn)移 ：細(xì)菌的接合 細(xì)菌的轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)導(dǎo) 轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)座 細(xì)菌轉(zhuǎn)化：一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來自另一種細(xì)菌菌株的DNA，而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳性改變的生命過程。 轉(zhuǎn)化因子本質(zhì)是DNA。 感受態(tài)：細(xì)菌生長過程中，只有某一階段的細(xì)菌才能成為轉(zhuǎn)化的受體的生理狀態(tài)。一般細(xì)菌的感受態(tài)都出現(xiàn)在對數(shù)生長的后期。 轉(zhuǎn)化因子整合相關(guān)因素：受體細(xì)胞的感受態(tài)、受體與供體DNA的同源性、受體細(xì)菌的酶系統(tǒng)、線狀供體DNA較環(huán)狀DNA易轉(zhuǎn)化。 轉(zhuǎn)導(dǎo)：以噬菌體等為媒介把細(xì)菌的基因從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞的過程。 烈性噬菌體由于不發(fā)生整合所以不會發(fā)生轉(zhuǎn)導(dǎo)。 轉(zhuǎn)導(dǎo)分為普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)染：噬菌體侵入細(xì)菌或外源DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程 轉(zhuǎn)座因子：又叫跳躍基因或移動(dòng)基因，是一種可以在染色體基因組上移動(dòng)，甚至在不同染色體之間或是染色體、噬菌體及質(zhì)粒DNA之間躍遷的DNA短片段。2、同源重組和非同源重組（1）同源染色體交換 1964年，哈利臺（R.Holliday）提出的鏈斷裂重接模型，解釋了部分雜合雙鏈的產(chǎn)生。步驟：鏈斷裂：同源聯(lián)會的兩個(gè)DNA分子中任意一個(gè)出現(xiàn)單鏈切口，切口由DNA內(nèi)切酶完成。 兩個(gè)單鏈對接，形成半交叉。 半交叉位置移動(dòng)。 Holliday中間體的變構(gòu)和拆分。 （2） 非同源重組 非同源重組是指發(fā)生重組的兩個(gè)DNA分子之間沒有或較少有序列同源性且不依賴重組蛋白RecA，這樣轉(zhuǎn)座、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、噬菌體、動(dòng)物病毒的整合均屬于非同源重組。非同源重組又分為復(fù)制性重組（重組后原來位置結(jié)構(gòu)不消失）和保守性重組（原來位置結(jié)構(gòu)消失）。三、基因的表達(dá)調(diào)控1、基因表達(dá)：指基因所編碼的遺傳信息被轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)產(chǎn)物?；虮磉_(dá)的主要過程包括基因的轉(zhuǎn)錄和mRNA的翻譯?；虮磉_(dá)的調(diào)節(jié)控制，簡稱基因表達(dá)調(diào)控，是指各種生物對其攜帶的遺傳信息表達(dá)的精密控制。在原核基因的表達(dá)過程中，轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯是偶聯(lián)發(fā)生的；在真核基因表達(dá)過程中，轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯在空間和時(shí)間上都是分開進(jìn)行的。 2、乳糖操縱子結(jié)構(gòu)基因：在乳糖操縱子中，與乳糖利用有關(guān)的三個(gè)酶半乳糖苷酶、半乳糖苷透性酶、半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶的基因。 在結(jié)構(gòu)基因上游為共同的調(diào)節(jié)基因（i）、啟動(dòng)子（p）和（o）操作子。 抑制因子：在沒有乳糖的情況下，調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的阻遏蛋白，以四聚體的活性形式與操作子結(jié)合色氨酸操縱子弱化作用：是指轉(zhuǎn)錄在沒有進(jìn)入第一結(jié)構(gòu)基因時(shí)便終止。3.2 真核生物的基因表達(dá)調(diào)控 DNA水平的調(diào)控：染色質(zhì)丟失，基因擴(kuò)增，基因重排 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與基因表達(dá)的關(guān)系 轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控：順式作用成分，反式作用因子 轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控 翻譯調(diào)控：蛋白質(zhì)翻譯起始的調(diào)節(jié)作用，mRNA壽命與翻譯調(diào)節(jié) 翻譯后的調(diào)控：蛋白質(zhì)產(chǎn)物的切割加工，蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾 第六章 基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)1. 酶的主要用途： 限制性核酸內(nèi)切酶識別DNA特定序列，切割DNA分子DNA連接酶連接兩個(gè)DNA分子或片段大腸桿菌DNA聚合酶 或Klenow酶1 制作DNA探針；2 合成cDNA第二鏈；3 填補(bǔ)雙鏈DNA 3凹端；4 DNA測序。Taq DNA 聚合酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）多核苷酸激酶多核苷酸5-OH磷酸化，制末端標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶使3-末端加同聚物尾S1核酸酶降解單鏈DNA或RNADNA酶在雙鏈DNA上產(chǎn)生隨機(jī)切口RNA酶A降解RNA逆轉(zhuǎn)錄酶補(bǔ)平反應(yīng)，合成cDNA或制探針堿性磷酸酶切除核酸末端磷酸基 2.核酸酶： 通過切割相鄰兩個(gè)核苷酸殘基間磷酸二酯鍵，導(dǎo)致核酸分子多核苷酸鏈水解斷裂的蛋白酶。3.核酸內(nèi)切限制酶（限制性內(nèi)切核酸酶） 指一類能識別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并在識別序列內(nèi)或附近特異切割雙鏈DNA的核酸內(nèi)切酶。4.限制-修飾系統(tǒng)限制酶與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制-修飾系統(tǒng)5.核酸內(nèi)切限制酶 分類（1） 型限制性內(nèi)切酶 功能：限制、修飾特點(diǎn)：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸為輔助因子；識別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)不一致，無固定切割位點(diǎn)；應(yīng)用：不常用。（2） 型限制性內(nèi)切酶功能：識別并特異切割DNA分子。即通常所指DNA限制性核酸內(nèi)切酶；反應(yīng)特點(diǎn)：僅需 Mg2+ 作催化反應(yīng)輔助因子，能識別雙鏈DNA特殊序列，并可特異切割DNA，產(chǎn)生特異片段；應(yīng)用：種類繁多，分子克隆中最為常用（3） 型限制性內(nèi)切酶功能：限制、修飾特點(diǎn)：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸為輔助因子；特異切割，切割位點(diǎn)在距識別位點(diǎn)3端24-26 bp處。應(yīng)用：數(shù)量很少，無實(shí)際作用。6.核酸內(nèi)切限制酶基本特點(diǎn)： 識別長度為4-8個(gè)核苷酸的特異序列； 許多識別序列具回文結(jié)構(gòu)； 切割產(chǎn)生末端有粘端 和平端7.核酸內(nèi)切限制酶 其他分類方式：（1）同裂酶:識別同樣核苷酸序列的一些來源不同的核酸內(nèi)切限制酶。(2) 同尾酶一些來源不同、識別的靶子序列也不相同，但卻能產(chǎn)生出相同的粘性末端.8. 雜種位點(diǎn): 由一對同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端共價(jià)結(jié)合形成的位點(diǎn)。9. 核酸內(nèi)切限制酶 連接方式: 分子間的連接 和 分子內(nèi)的連接10.核酸內(nèi)切限制酶 活性影響因素： DNA模板的純度 DNA的甲基化程度 酶切反應(yīng)溫度 DNA的分子結(jié)構(gòu) 緩沖液11. 核酸內(nèi)切限制酶的星號活性 限制酶的星號活性：即star活性或星星活性。是指在酶反應(yīng)條件發(fā)生改變的情況下，該酶便失去了識別其固有的特異序列(識別位點(diǎn))的能力，而會在新的識別位點(diǎn)上發(fā)生DNA分子的切割作用(即識別序列發(fā)生了改變)。12. 產(chǎn)生星號活性的因素： 酶單位數(shù)/DNA比值過高，超過10u/mg DNA，就會產(chǎn)生星號活性；甘油濃度過高(超過5%)；二價(jià)離子的改變，如果反應(yīng)體系的Mg2+被Mn2+、Cu2+、Zn2+、Co2+代替，EcoRI和Hind等均會出現(xiàn)星號活性；低離子強(qiáng)度8)有機(jī)溶劑，如DMSO，乙醇，乙二醇，二甲基甲酰胺等。13. DNA連接酶： 定義：可使一段DNA 3-OH末端和5-P 末端形成3,5-磷酸二酯鍵，把兩DNA片段連在一起封閉雙鏈上形成的切口的酶。14. 裂口：即DNA裂口，是指雙鏈DNA分子上的某一條鏈?zhǔn)ヒ粋€(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸時(shí)所出現(xiàn)的DNA單鏈斷裂。15 缺口：即雙鏈DNA分子的單鏈斷裂，即在相鄰的2個(gè)核苷酸分子之間，失去了(移走了)一個(gè)磷酸二酯鏈。16 DNA連接酶 分類及其作用 （1）DNA連接酶：連接粘性末端（2）T4連接酶：連接平末端和粘性末端17 DNA連接酶的連接作用：A. 粘性末端DNA片段的連接B. 平末端片段的連接18.常用的DNA聚合酶 ： 大腸桿菌DNA聚合酶、大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow大片 段酶 、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、修飾的T7 DNA聚合酶、反 轉(zhuǎn)錄酶等。19. DNA聚合酶的定義：能夠根據(jù)DNA模板合成互補(bǔ)DNA的核酸酶20DNA聚合酶 I 活性：53聚合活性，53外切和35 外切活性。發(fā)揮生物學(xué)活性的條件：（1）DNA模板（可以是單鏈或雙鏈）（2）帶有3-端游離羥基的引物鏈（3）底物和激活劑21. Klenow聚合酶： 活性： 53聚合活性，35 外切酶活性，無 53 外切酶活性。 用途： （1）填補(bǔ)或標(biāo)記DNA的3隱蔽末端； （2）催化合成cDNA第二鏈； （3）DNA序列測定22. Taq DNA聚合酶： 顯著特點(diǎn)：熱穩(wěn)定性。70反應(yīng)2h殘留活性90 %； 93 反應(yīng) 2 h殘留活性60% ；94 反應(yīng) 2 h殘留活性40%。應(yīng)用：（1）對DNA的特定片段進(jìn)行體外擴(kuò)增； （2） DNA序列測定。23. 逆轉(zhuǎn)錄酶： 又稱RNA指導(dǎo)下的DNA聚合酶。 活性： 53聚合酶活性和RNaseH活性。聚合作用所需模板可以是 RNA或DNA，引物是帶3-OH的RNA或DNA。用途：（1）在體外以mRNA為模板合成cDNA；（2）對有5突出末端的DNA片段作末端標(biāo)記（補(bǔ)平）；（3）雙脫氧法測序；（4）以DNA或RNA為模板合成核酸探針24. T4 DNA聚合酶： 活性： 53聚合酶活性和35外切酶活性，且35外切酶活性對單鏈DNA的作用比對雙鏈DNA強(qiáng)。高濃度dNTP 環(huán)竟下前者活性更強(qiáng)。 應(yīng)用：標(biāo)記DNA平末端或隱蔽3末端25. T7 DNA聚合酶： 活性：53聚合酶活性；有單鏈及雙鏈的35外切酶活性，但無53外切酶活性；特點(diǎn)：極佳的連續(xù)合成能力應(yīng)用：（1）用于長模板DNA的引物延伸反應(yīng)；（2）通過單純延伸或取代合成途徑標(biāo)記DNA 3末端；（3）使雙鏈DNA 5或3突出末端變平末端。26.末端轉(zhuǎn)移酶：末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（是從小牛胸腺中純化出來的一種小分子量（34103dal）的堿性蛋白質(zhì)。末端轉(zhuǎn)移酶用途：(1) (主要)給外源DNA片段和及載體加互補(bǔ)同聚物尾巴；(2) 標(biāo)記DNA片段的3末端。27. 堿性磷酸酶：來自于大腸桿菌或小牛腸該酶用于脫去DNA（RNA）5末端的磷酸基團(tuán)，使5-P成為5-OH，該過程稱核酸分子的脫磷酸作用。當(dāng)需要5端同位素標(biāo)記或?yàn)榱吮苊釪NA片段自身連接（或環(huán)化）時(shí)可進(jìn)行脫磷酸反應(yīng)。28. 核酸外切酶：定義 是一類從多核苷酸鏈的一頭開始按序催化降解核苷酸的酶。 按作用特性的差異，可以分為單鏈的核酸外切酶和雙鏈的核酸外切酶。前者包括大腸桿菌的核酸外切酶（exo ）和核酸外切酶 （exo ），后者包括大腸桿菌外切酶 （ exo ）、 噬菌體核酸外切酶（ exo ）以及T7噬菌體基因6核酸外切酶等。 第七章 基因工程常用載體1. 載體：將外源DNA或基因攜帶入寄主細(xì)胞的工具。載體類型：質(zhì)粒 噬菌體 噬菌粒 粘粒 特點(diǎn)： 在寄主細(xì)胞內(nèi)必須能夠自主復(fù)制（具備復(fù)制原點(diǎn)）。 必須具備合適的酶切位點(diǎn)供外源DNA片段插入，同時(shí)不影響復(fù)制。 有一定的選擇標(biāo)記，用于篩選。 有一定的拷貝數(shù)，便于制備。2. 質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性：A染色體外的遺傳因子，能自我復(fù)制B大多數(shù)為雙鏈、閉環(huán)DNA分子，少數(shù)為線性C大小1kb-200kb，也有更大3質(zhì)粒編碼的表型：抗菌素的抗性產(chǎn)生抗菌素的基因 降解復(fù)雜有機(jī)化合物產(chǎn)生毒素 限制與修飾固氮 殺蟲4.顯性質(zhì)粒（表達(dá)型質(zhì)粒）：某些質(zhì)粒除了有與控制本身復(fù)制和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因外，還攜帶一些其它基因，寄主細(xì)胞由于含有這樣的質(zhì)粒而呈現(xiàn)出新的性狀。5.隱蔽質(zhì)粒：寄主含有某種質(zhì)粒，但無異樣性狀表露。這種質(zhì)粒為隱蔽質(zhì)粒。6.氨芐青霉素抗性基因 AmpR ampr ampicillin作用：青霉素抑制細(xì)胞壁肽聚糖的合成，與有關(guān)的酶結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)肽反應(yīng)并抑制其活性。 四環(huán)素抗性基因 tetr tetracycline作用：四環(huán)素與核糖體30S亞基的一種蛋白質(zhì)結(jié)合，從而抑制核糖體的轉(zhuǎn)位。氯霉素抗性基因 CmR Catr chloramphenicol作用：氯霉素與50S亞基結(jié)合并抑制蛋白質(zhì)合成卡那霉素和新霉素抗性基因 Kanamycin/Neomycin作用：可與核糖體成分相結(jié)合并抑制蛋白質(zhì)合成的脫氧鏈霉素胺氮基糖苷。7. 常用的質(zhì)粒載體 克隆載體：用于擴(kuò)增或保存DNA片段，是最簡單的載體。8. 噬菌體 的基本功能： 保護(hù)自己的DNA或RNA免遭環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的破壞。 將其核酸分子注入到感染的細(xì)菌細(xì)胞。 將被感染的細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)變制造噬菌體體系，從而能產(chǎn)生大量的子代噬菌體顆粒。使被感染的細(xì)胞釋放出子代噬菌體顆粒9.噬菌體生命周期 的基本過程： 吸附：噬菌體顆粒吸附到位于感染細(xì)胞表面的特殊接收器上。 注入：噬菌體DNA穿過細(xì)胞壁注入細(xì)胞 轉(zhuǎn)變：被感染的細(xì)菌細(xì)胞的功能發(fā)生變化成為制造噬菌體顆粒的場所。 合成：功能發(fā)生改變了轉(zhuǎn)變的寄主細(xì)胞大量合成噬菌體特有的核酸和蛋白質(zhì)。組裝：包裝了DNA的頭部和尾部組成噬菌體的顆粒，這個(gè)過程也叫做噬菌體的形態(tài)建成。釋放：新合成的子代噬菌體顆粒從寄主細(xì)胞內(nèi)釋放出來。10. 原噬菌體：溶源性細(xì)菌內(nèi)存在的整合的或非整合的噬菌體DNA。11. 原噬菌體主要特征： 噬菌體的DNA分子注入細(xì)菌細(xì)胞。 經(jīng)過短暫的轉(zhuǎn)錄期之后，需要合成一種整合酶，于是轉(zhuǎn)錄活性便被一種阻遏物所關(guān)閉。 噬菌體的DNA分子插入到細(xì)菌染色體基因組DNA上，變成原噬菌體。 細(xì)菌繼續(xù)生長、增殖、噬菌體的基因作為染色體的一部分進(jìn)行復(fù)制。 12.粘性末端：噬菌體的基因組是由雙鏈DNA組成，其線性分子的兩端各有一條由12個(gè)核苷酸組成的彼此互補(bǔ)的5單鏈突出序列，即通常所說的粘性末端。13.cos位點(diǎn)：注入感染寄主細(xì)胞內(nèi)的lDNA線性分子，會迅速環(huán)化形成雙鏈DNA分子。這種由粘性結(jié)合形成的特定的雙鏈區(qū)段14. 插入型載體：有插入型載體和置換型載體。通過特定的酶切位點(diǎn)允許外源 DNA 片段插入的載體15置換型載體：允許外源 DNA 片段替換非必須 DNA 片段的載體16. 噬菌體載體主要用于構(gòu)建基因文庫，特別是cDNA文庫。17. 基因文庫：由大量的含有基因組DNA的不同DNA片段的克隆所構(gòu)成的群體。18. M13的增殖： 吸附/入侵/F菌株的性纖毛，D