「血清總蛋白和白蛋白測定實驗方案」.doc

血清中總蛋白和白蛋白測定的實驗方案血清總蛋白的測定：實驗原理血清(漿)中蛋白質(zhì)的肽鍵(-CO-NH-)在堿性溶液中能與2價銅離子作用生成穩(wěn)定的紫紅色絡(luò)合物。此反應(yīng)和2個尿素分子縮合后生成的雙縮脲(H2N-OC-NH- CO-NH2)在堿性溶液中與銅離子作用形成紫紅色的反應(yīng)相似，故稱之為雙縮脲反應(yīng)。這種紫紅色絡(luò)合物在540nm處有明顯吸收峰，吸光度在一定范圍內(nèi)與血清蛋白含量呈正比關(guān)系，經(jīng)與同樣處理的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液比較，即可求得蛋白質(zhì)含量。實驗器材 分光光度計實驗試劑1.6mol/L NaOH溶液稱取NaOH 240g，溶于新鮮制備的蒸餾水約800ml中，定容至1L，貯于有蓋塑料瓶中。2.雙縮脲試劑 稱取硫酸銅結(jié)晶(CuSO45H2O)3g溶于新鮮制備的蒸餾水500ml中，加入酒石酸鉀鈉(NaKC4H4064H2O），用以結(jié)合Cu2+，防止CuO在堿性條件下沉淀)9g和KI(防止堿性酒石酸銅自動還原并防止Cu2O的離析)5g。待完全溶解后，在攪拌下加入6mol/L NaOH溶液100ml，并用蒸餾水定容至1L，置塑料瓶中蓋緊保存。此試劑室溫下可穩(wěn)定半年，若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制。3.6070g/L蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液可用定值參考血清或標(biāo)準(zhǔn)白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)。實驗操作取試管3支，混勻，置2530min或37 10min，在波長540mm處比色，用空白管調(diào)零，測各管吸光度。參考范圍6080g/L。注意事項1.黃疸血清，嚴(yán)重溶血，葡萄糖，酚酞及溴磺酞鈉對本法有明顯干擾，故用標(biāo)本空白管來消除。但如標(biāo)本空白管吸光度太高，可影響測定的準(zhǔn)確度。2.高脂血癥混濁血清會干擾比色，可采用下述方法消除：取2支帶塞試管或離心管，各加待測血清0.1ml，再加蒸餾水0.5ml和丙酮10ml，塞緊并顛倒混勻10次后離心，傾去上清液，將試管倒立于濾紙上吸去殘余液體。向沉淀中分別加入雙縮脲試劑及雙縮脲空白試劑，再進(jìn)行與上述相同的其他操作和計算。方法評價1.雙縮脲顯色反應(yīng)僅和蛋白質(zhì)中肽鍵數(shù)成正比關(guān)系，與蛋白質(zhì)的種類、分子量及氨基酸的組成無明顯關(guān)系，各種蛋白質(zhì)的顯色程度基本相同。2.本法重復(fù)性好，RCV為4%，CCV為3.9%；線性范圍為0140g/L；本法干擾少，并且大多可以避免；使用單一的穩(wěn)定試劑，操作簡便、快速，既適于手工操作，也便于自動化分析，已被推薦為測定血清總蛋白的參考方法。3.唯一的缺點是靈敏度較低，比酚試劑法低約100倍。但本法的檢出限為0.21.7g/L，這相當(dāng)于70g/L的血清324l，已能滿足臨床生化檢驗的需要。4.本法是臨床測定血清總蛋白質(zhì)首選最方便、最實用的常規(guī)方法。5.臨床上常見的血清蛋白定量法主要有雙縮脲法、臨床折射計法、染料結(jié)合法、BCA法和免疫比濁法。臨床意義 血清總蛋白濃度受到血容量變化的影響，脫水時蛋白濃度相對增加，水潴留時則降低。在生理情況下，體位、運動等也可使血蛋白濃度發(fā)生輕微變化。 1.血清總蛋白濃度升高 （1）各種原因失水所致的血液濃縮：如嘔吐、腹瀉、燒傷、糖尿病酮癥酸中毒、急性傳染病、急腹癥等。 （2）網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)疾?。喝缍喟l(fā)性骨髓瘤、原發(fā)性巨球蛋白血癥、單核細(xì)胞性白血病等； （3）風(fēng)濕性疾?。喝缦到y(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化。 （4）慢性傳染病：如結(jié)核、梅毒等 2.血清總蛋白濃度降低 （1）各種原因引起的血清蛋白丟失或攝入不足：如腎病綜合征、營養(yǎng)不良、消耗增加； （2）蛋白質(zhì)合成障礙，如肝臟疾病。 血清白蛋白測定血清白蛋白溴甲酚綠法測定實驗：實驗原理：在pH42的緩沖液中，白蛋白作為一種陽離子，結(jié)合陰離子染料溴甲酚綠（BCG）形成藍(lán)綠色化合物，在波長630nm處有吸收峰，其吸光度與白蛋白濃度成正比例，與同樣處理的白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液比較可求得血清中白蛋白含量。實驗試劑1、05molL琥珀酸緩沖貯存液（PH40）溶解Na0H 10g琥珀酸 56g于 800m1蒸餾水中，用1molL氫氧化鈉調(diào)至pH4.10.05加水稀釋至1000ml此液置4冰箱保存2、BCG已存液（10molL）：溶解BCG（MW720.22）1.80g于5m1 Na0H中用蒸餾水稀釋至250ml3、疊氮鈉貯存液：溶解疊氮鈉40g于1000ml蒸餾水中。4、聚氧化乙烯月桂醚（BYij35）貯存液溶解2.5g聚氧化乙烯月桂醚于80ml蒸餾水中，加熱助溶然后加蒸餾水至10ml5、BCG試劑：與1L容量瓶中盛蒸餾水約400m1，加琥珀酸緩沖貯存100ml，用吸管準(zhǔn)確加入BCG貯存液80m1，并用蒸餾水將吸管壁上殘留的少量染料沖洗到液體中加疊氮鈉25ml，聚氧化乙烯月桂醚25ml最后用蒸餾水稀釋到刻度，配好BCG試劑應(yīng)為4.15土0.05。6、40gL白蛋白標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液實驗步驟 波長630nm。用空白管調(diào)零，用定量加液器加BCG應(yīng)用液與血清標(biāo)本混合后，立即在30土3S，讀取吸光度，如果標(biāo)本混濁可做標(biāo)本空白管（血清002m1加琥珀酸緩沖液40ml）以琥珀酸緩沖液調(diào)零測定標(biāo)本空白管吸光度，測定管吸光度減去標(biāo)本空白管吸光度后計算結(jié)果測定管標(biāo)準(zhǔn)管空白管待測血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液蒸餾水BCG應(yīng)用液計算：血清白蛋自（gL）測定管吸光度標(biāo)準(zhǔn)管吸光度標(biāo)準(zhǔn)管白蛋白濃度（g/L）同時測定血清標(biāo)本的總蛋白濃度，減去血清白蛋白濃度，即得血清球蛋白濃度，并可計算血清白、球蛋白比值參考值：3555g/L注意事項：1、實驗證明BCG不但與白蛋白顯色，而且與各種蛋白成分顯色其中以球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、融珠蛋白更為顯著，其反應(yīng)度較該蛋白稍慢，故有人主張用定值參考血清作標(biāo)準(zhǔn)比較理想，BCG與血清特異結(jié)合后，在此