水質(zhì)糞大腸菌群的測定標(biāo)準(zhǔn)2007.doc

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來表示試驗(yàn)結(jié)果的。實(shí)際上它是根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)理論，估計(jì)水體中的大腸桿菌密度和衛(wèi)生質(zhì)量的一種方法。如果從理論上考慮，并且進(jìn)行大量的重復(fù)檢定，可以發(fā)現(xiàn)這種估計(jì)有大于實(shí)際數(shù)字的傾向。不過只要每一稀釋度試管重復(fù)數(shù)目增加，這種差異便會減少，對于細(xì)菌含量的估計(jì)值，大部分取決于那些既顯示陽性又顯示陰性的稀釋度。因此在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上，水樣檢驗(yàn)所要求重復(fù)的數(shù)，要根據(jù)所要求數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度而定。3 培養(yǎng)基和試劑本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑除另有注明外，均為符合國家標(biāo)準(zhǔn)的分析純化學(xué)試劑；實(shí)驗(yàn)用水為新制備的去離子水。3.1 單倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液：成分：蛋白胨 10g 牛肉浸膏 3g 乳糖 5g 氯化鈉 5g 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1mL 蒸餾水 1000mL 制法：將蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氯化鈉加熱溶解于 1000mL 蒸餾水中，調(diào)節(jié) pH 為 7.27.4，再加入 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1mL，充分混勻，分裝于含有倒置的小玻璃管的試管中，于高壓蒸汽滅菌器中，在 115滅菌 20min，貯存于暗處備用。3.2 三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液：按上述配方比例三倍（除蒸餾水外），配成三倍濃縮的乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，制法同上。3.3 EC 培養(yǎng)液：成分：胰胨 20g 乳糖 5g 膽鹽三號 1.5g 磷酸氫二鉀（K2HPO4） 4g 磷酸二氫鉀（KH2PO4） 1.5g 氯化鈉 5 g 蒸餾水 1000mL 制法：將上述成分加熱溶解，然后分裝于含有玻璃倒管的試管中。置高壓蒸汽滅菌器中，115滅菌 20min。滅菌后 pH 應(yīng)為 6.9。3.4 培養(yǎng)基的存放在密封瓶中的脫水培養(yǎng)基成品要存放在大氣濕度低、溫度低于 30的暗處，存放時(shí)應(yīng)避免陽光直接照射，并且要避免雜菌侵入和液體蒸發(fā)。當(dāng)培養(yǎng)液顏色變化，或體積變化明顯時(shí)廢棄不用。4 步驟4.1 水樣接種量將水樣充分混勻后，根據(jù)水樣污染的程度確定水樣接種量。每個(gè)樣品至少用三個(gè)不同的水樣量接種。同一接種水樣量要有五管。相對未受污染的水樣接種量為 10mL、1mL、0.1mL。受污染水樣接種量根據(jù)污染程度接種 1mL、0.1mL、0.01mL 或 0.1mL、0.01mL、0.001mL 等。使用的水樣量可參考下表 1。表 1 接種用水量參考表接種量(mL）水樣種類井水河水、塘水湖水、塘水城市原污水檢測方法多管發(fā)酵法多管發(fā)酵法多管發(fā)酵法多管發(fā)酵法100501010.110-210-310-410-5 如接種體積為 10mL，則試管內(nèi)應(yīng)裝有三倍濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)液 5mL；如接種量為 1mL 或少于1mL，則可接種于普通濃度的乳糖蛋白胨培養(yǎng)液 10mL 中。4.2 初發(fā)酵試驗(yàn)將水樣分別接種到盛有乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的發(fā)酵管中。在 370.5下培養(yǎng) 24h2h。產(chǎn)酸和產(chǎn)氣的發(fā)酵管表明試驗(yàn)陽性。如在倒管內(nèi)產(chǎn)氣不明顯，可輕拍試管，有小氣泡升起的為陽性。4.3 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)輕微振蕩初發(fā)酵試驗(yàn)陽性結(jié)果的發(fā)酵管，用 3mm 接種環(huán)或滅菌棒將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到 EC 培養(yǎng)液中。在 44.50.5溫度下培養(yǎng) 24h2h（水浴箱的水面應(yīng)高于試管中培養(yǎng)基液面）。接種后所有發(fā)酵管必須在 30min 內(nèi)放進(jìn)水浴中。培養(yǎng)后立即觀察，發(fā)酵管產(chǎn)氣則證實(shí)為糞大腸菌群陽性。5 結(jié)果的計(jì)算根據(jù)不同接種量的發(fā)酵管所出現(xiàn)陽性結(jié)果的數(shù)目，從表 2 或表 3 中查得每升水樣中的糞大腸菌群。接種水樣為 100mL2 份、10mL10 份、總量 300mL 時(shí)，查表 2 可得每升水樣中的糞大腸菌群；接種 5份 10mL 水樣、5 份 1mL 水樣、5 份 0.1mL 水樣時(shí)，查表 3 求得 MPN 指數(shù)，MPN 值再乘 10，即為 1L水樣中的糞大腸菌群。如果接種的水樣不是 10mL、1mL 和 0.1mL，而是較低的或較高的三個(gè)濃度的水樣量，也可查表3 求得 MPN 值，再經(jīng)下式計(jì)算成每 100mL 的 MPN 值。10(mL)MPN值 = MPN指數(shù) 接種量最大的一管(mL )10mL 水量的陽性管數(shù)表 2 糞大腸菌群檢數(shù)表（接種水樣 100mL2 份、10mL10 份、總量 300m）100mL 水量的陽性瓶數(shù)01201L 水樣中糞大腸菌群數(shù)1L 水樣中糞大腸菌群數(shù)1L 水樣中糞大腸菌群數(shù)230表 3 最可能數(shù)（MPN）表（接種 5 份 10mL 水樣、5 份 1mL 水樣、5 份 0.1mL 水樣時(shí)，不同陽性及陰性情況下 100mL 水樣中細(xì)菌數(shù)的最可能數(shù)和 95可信限值）出現(xiàn)陽性份數(shù)每100mL水95%置信區(qū)間出現(xiàn)陽性份數(shù)每100mL水95%置信區(qū)間10mL管01mL 管00.1mL管0樣 中 細(xì) 菌 數(shù)的最可能數(shù)2下限上限10mL管41mL 管20.1mL管1樣 中 細(xì) 菌 數(shù)的最可能數(shù)26下限上限97800120.5 74302798001020.5 74313311 9302040.511 44034129310020.5 75002377010140.511 5013411 8911040.511 502431511011160.5155103311 931222222001120010106577990.50.511221513171721215555551122231201204663497094791621172328253120150130170220190233333334444443001122300111200101010010120128111114141717131717212622312244553557972819252534344646314646637867555555555555553334444455555512301234012345110140180130170220280350240350540920160024003137443543579012068120180300640250310500300190700850100075010001400320058001 適用范圍 第二篇 濾膜法本標(biāo)準(zhǔn)適用于一般地表水、地下水及廢水中糞大腸菌群的測定。用于檢驗(yàn)加氯消毒后的水樣時(shí)，在濾膜法之前，應(yīng)先做實(shí)驗(yàn)，證實(shí)它所得的數(shù)據(jù)資料與多管發(fā)酵試驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)資料具有可比性。2 原理濾膜是一種微孔性薄膜。將水樣注入已滅菌的放有濾膜（孔徑 0.45m）的濾器中，經(jīng)過抽濾，細(xì)菌即被截留在膜上，然后將濾膜貼于 MFC 培養(yǎng)基上，44.5溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，計(jì)數(shù)濾膜上生長的此特性的菌落數(shù)，計(jì)算出每 1L 水樣中含有糞大腸菌群數(shù)。3 培養(yǎng)基和試劑本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑除另有注明外，均為符合國家標(biāo)準(zhǔn)的分析純化學(xué)試劑；實(shí)驗(yàn)用水為新制備的去離子水。3.1 MFC 培養(yǎng)基：成分：胰胨 10g 蛋白胨 5g 酵母浸膏 3.0g 氯化鈉 5.0g 乳糖 12.5g 膽鹽三號 1.5g 1%苯胺藍(lán)水溶液 10mL 1%玫瑰色酸溶液（溶于 0.2mol/L 氫氧化鈉液中） 10mL 蒸餾水 1000mL 制法：將上述培養(yǎng)基中的成分（除苯胺藍(lán)和玫瑰色酸外），置于蒸餾水中加熱溶解，調(diào)節(jié) pH 為 7.4，分裝于小燒瓶內(nèi)，每瓶 100mL，于 115滅菌 20min。貯于冰箱中備用。臨用前，按上述配方比例，用滅菌吸管分別加入已煮沸滅菌的 1%苯胺藍(lán)溶液 1mL 及新配制的 1%玫瑰色酸溶液（溶于 0.2mol/L氫氧化鈉液中）1mL，混合均勻。加熱溶解前，加入 1.2%1.5%瓊脂可制成固體培養(yǎng)基。如培養(yǎng)物中雜菌不多，則培養(yǎng)基中不加玫瑰色酸亦可。3.2 培養(yǎng)基的存放在密封瓶中的脫水培養(yǎng)基成品要存放在大氣濕度低、溫度低于 30的暗處，存放時(shí)應(yīng)避免陽光直接照射，并且要避免雜菌侵入和液體蒸發(fā)。當(dāng)培養(yǎng)液顏色變化，或體積變化明顯時(shí)廢棄不用。4 步驟4.1 水樣量的選擇：水樣量的選擇根據(jù)細(xì)菌受檢驗(yàn)的特征和水樣中預(yù)測的細(xì)菌密度而定。如未知水樣中糞大腸菌的密度，就應(yīng)按下表所列體積過濾水樣，以得知水樣的糞大腸桿菌密度。先估計(jì)出適合在濾膜上計(jì)數(shù)所應(yīng)使用的體積，然后再取這個(gè)體積的 1/10 和 10 倍，分別過濾。理想的水樣體積是一片濾膜上生長 2006 個(gè)糞大腸菌群菌落，總菌落數(shù)不得超過 200 個(gè)。使用的水樣量可參考下表。接種量(mL）水樣種類檢測方法100501010.110-210-310-410-5較清潔的湖水濾膜法一般的江水濾膜法城市內(nèi)的河水濾膜法城市原污水濾膜法 4.2 濾膜及濾器的滅菌：將濾膜放入燒杯中，加入蒸餾水，置于沸水浴中煮沸滅菌三次，每次 15min。前兩次煮沸后需更換水洗滌 23 次，以除去殘留溶劑。也可用 121滅菌 10min，10min 一到，迅速將蒸汽放出，這樣可以盡量減少濾膜上凝集的水分。濾器、接液瓶和墊圈分別用紙包好，在使用前先經(jīng) 121高壓蒸汽滅菌 30min。濾器滅菌也可用點(diǎn)燃的酒精棉球火焰滅菌。4.3 過濾裝置安裝：以無菌操作把濾器裝置依照下圖裝好。4.4 過濾：用無菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣，將粗糙面向上，貼放在已滅菌的濾床上，穩(wěn)妥地固定好濾器。將適量的水樣注入濾器中，加蓋，開動真空泵即可抽濾除菌。3.5 培養(yǎng)：使用 MFC 培養(yǎng)基。培養(yǎng)基含或不含瓊脂，不含瓊脂的培養(yǎng)基使用已用 M-FC 培養(yǎng)基飽和的無菌吸收墊。將濾過水樣的濾膜置于瓊脂或吸收墊表面。將培養(yǎng)皿緊密蓋好后，置于能準(zhǔn)確恒溫于44.50.5的恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水浴中，經(jīng) 24h2h 培養(yǎng)。若用恒溫水浴培養(yǎng)，則需用防水膠帶貼封每個(gè)平皿，將培養(yǎng)皿成疊封入防水塑料袋或容器內(nèi)，浸沒在 44.50.5恒溫水浴中。在培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，裝培養(yǎng)皿的塑料袋必須用重物墜于水面之下，以保持所需的嚴(yán)格溫度。所有已制備的培養(yǎng)物都應(yīng)