瓊脂稀釋法操作步驟ppt課件.ppt

瓊脂稀釋法操作步驟 原理 將抗菌藥物配制到瓊脂培養(yǎng)基中成 128 g ml 64 g ml 32 g ml 0 06 g ml對(duì)倍稀釋的濃度系列多點(diǎn)接種器將制備好的細(xì)菌菌懸液迅速點(diǎn)種到瓊脂表面 經(jīng)35 16 20小時(shí)培養(yǎng)肉眼觀察細(xì)菌生長(zhǎng) 以未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)平板的最低藥物濃度為最低抑菌濃度 MIC 抗菌藥物保存液的準(zhǔn)備1 估算抗菌藥物最小稱量瓊脂稀釋法最高藥物濃度為128 g ml藥物和培養(yǎng)基的體積比1 14 即藥物濃度將成15倍稀釋 因此保存液為128 g ml 15 1920 g ml如果1次用量為10ml 則 抗菌藥物最小稱量 抗菌藥物保存液的準(zhǔn)備2 抗菌藥物稀釋選擇合適的抗菌藥物稀釋液進(jìn)行藥物稀釋 稀釋液需要量見(jiàn)下列公式 稀釋液體積 抗菌藥物保存液的準(zhǔn)備3 實(shí)際操作 先計(jì)算完成一批試驗(yàn)需幾次完成 每次用量多少 然后可一起稱量 一起稀釋 然后按每次需要量分裝在試管中 貼上標(biāo)簽 注明藥物名稱 濃度 體積數(shù)及配制日期 置與 20 保存 備用 培養(yǎng)基 菌液準(zhǔn)備1 生長(zhǎng)法 無(wú)菌環(huán)取4 5個(gè)菌落大小形態(tài)一致的菌落頂部后接種于4 5mlMH肉湯內(nèi)35 培養(yǎng)4 6小時(shí)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 亦可過(guò)夜培養(yǎng) 但不允許超過(guò)18小時(shí)用肉湯 生理鹽水校正至0 5麥?zhǔn)瞎軡舛? 2X108CFU ml 菌液準(zhǔn)備2 直接菌落懸浮法 從孵育了18 24h新鮮培養(yǎng)物的平板上 用無(wú)菌環(huán)取單個(gè)菌落接種于無(wú)菌肉湯 生理鹽水內(nèi)校正至0 5麥?zhǔn)瞎軡舛? 2X108CFU ml推薦用于苛氧菌和潛在的MRS 菌液準(zhǔn)備3 對(duì)絕大多數(shù)細(xì)菌來(lái)說(shuō) 上述用生長(zhǎng)法或直接菌落懸浮法制備的0 5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?應(yīng)該再用無(wú)菌肉湯或生理鹽水行1 10稀釋 此時(shí)菌液濃度為1 2 107CFU ml 調(diào)整好的菌液應(yīng)該在制備后的15分鐘內(nèi)完成點(diǎn)種 菌液準(zhǔn)備4 如一次實(shí)驗(yàn)需完成50株或100株細(xì)菌 則細(xì)菌要編上工作序號(hào)1 50或1 100 并在結(jié)果記錄紙上要一一對(duì)應(yīng)寫上工作序號(hào)和菌種編號(hào) 瓊脂稀釋法藥敏平板的制備1 配制融化的MH瓊脂或適合其他苛氧菌 厭氧菌等特殊細(xì)菌的培養(yǎng)基 待冷卻到48 50 澆制藥物平板 取滅菌的90mm平板12只 用記號(hào)筆在平板底部作好 點(diǎn)種標(biāo)記 藥物名稱 藥物濃度 濃度從0 06 g ml 128 g ml 每種濃度1只平板共12個(gè)濃度系列 瓊脂稀釋法藥敏平板的制備2 取11支無(wú)菌玻璃試管 13 100mm 每支試管標(biāo)記為 960 480 240 120 60 30 15 7 5 3 75 1 875 0 935 g m 并于上述每根管子中用無(wú)菌移液管加無(wú)菌稀釋液1 5ml 瓊脂稀釋法藥敏平板的制備3 將保存在 20 冰箱中的1920 g ml濃度的抗菌藥物保存液取出融化后 用無(wú)菌移液管吸取2 5ml加入到128 g ml標(biāo)記的平板內(nèi)1ml移液管內(nèi)剩余的1 5ml加入到960標(biāo)記的試管內(nèi) 混勻后再吸取2 5ml加入到64 g ml標(biāo)記的平板內(nèi)1ml移液管內(nèi)剩余的1 5ml再加入到480 g ml標(biāo)記的玻璃試管內(nèi) 混勻后再吸取2 5ml依次類推 直至最后一個(gè)0 06 g ml標(biāo)記的平皿內(nèi)加入1ml 則抗菌藥物稀釋完成 瓊脂稀釋法藥敏平板的制備4 準(zhǔn)備2只無(wú)藥的平板 作點(diǎn)種前和點(diǎn)種后質(zhì)控對(duì)照所有藥物平板應(yīng)保持表面干燥 不可有肉眼可見(jiàn)的水珠 可在35 孵箱內(nèi)倒置平板開蓋烘干15 20分鐘 瓊脂稀釋法藥敏平板的制備5 如果需使用的藥物平板為100 100mm的方平板 則每根玻璃管內(nèi)需加入2 5ml的抗菌藥物稀釋液 每次無(wú)菌吸管吸取的抗菌藥物量應(yīng)該為4 5ml每只方平板應(yīng)加入2ml抗菌藥物試液無(wú)菌吸管內(nèi)應(yīng)存留下2 5ml與下一個(gè)濃度的玻璃試管內(nèi)的2 5ml稀釋液進(jìn)行充分混勻藥敏培養(yǎng)基應(yīng)加入28ml 測(cè)試菌液的點(diǎn)種1 預(yù)先將點(diǎn)種針和點(diǎn)種板高壓滅菌 并在孵箱內(nèi)烘干 52孔 100孔 或21孔 將已調(diào)整好濁度 1 2 107CFU ml 的菌液用微量加樣器將菌液依次加入菌液點(diǎn)種板小孔內(nèi) 并作好與藥物平板相應(yīng)的點(diǎn)種標(biāo)記 一般每小孔內(nèi)應(yīng)加入菌液270 l 每批試驗(yàn)均須保留有質(zhì)控菌位置和無(wú)菌菌液位置用酒精棉球清潔多點(diǎn)接種器后 將點(diǎn)種針安裝在多點(diǎn)接種器架子上 再將加好菌液的點(diǎn)種板安置上多點(diǎn)接種器的點(diǎn)種板位置上 測(cè)試菌液的點(diǎn)種2 開啟多點(diǎn)接種器進(jìn)行點(diǎn)種 因每一根點(diǎn)種針直徑約3mm 因此點(diǎn)種到藥物平板上每點(diǎn)的菌液量約為2 l 所以接種量為104CFU 點(diǎn)點(diǎn)種時(shí)應(yīng)先點(diǎn)種對(duì)照前的質(zhì)控平板 然后從最低藥物濃度開始點(diǎn)種依次點(diǎn)種到藥物濃度最高的平板 藥物平板的孵育 上述接種好的平板應(yīng)在室溫下靜置至接種點(diǎn)上的菌液被瓊脂完全吸收 再將藥敏平皿倒置 于35 孵育16 20小時(shí)如葡萄球菌苯唑西林和甲氧西林 則需33 35 絕對(duì)不能超過(guò)35 孵育24小時(shí) 閱讀結(jié)果萬(wàn)古霉素藥敏試驗(yàn)的腸球菌和葡萄球菌等需孵24小時(shí)后 閱讀結(jié)果淋病奈瑟球菌需在5 CO2空氣環(huán)境中孵育20 24小時(shí) 閱讀結(jié)果 結(jié)果閱讀和判斷 結(jié)果閱讀時(shí) 平板應(yīng)置于黑色不反光的表面上 記錄的MIC是完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低抗生素濃度 單個(gè)菌落或接種物所致的輕微的不清晰現(xiàn)象可忽略不計(jì) 如果在MIC判斷終點(diǎn)附近持續(xù)存在或多個(gè)菌落