染色體顯微操作技術(shù)

第5章 染色體顯微切割,引言： 在大部分人類腫瘤和某些特定人類遺傳病中存在染色體重排。腫瘤特定的染色體異常會導(dǎo)致原癌基因產(chǎn)物的激活、腫瘤特異融合蛋白的產(chǎn)生或腫瘤抑制基因的失活。,一個癌細胞的染色體共104條，包括許多異常的染色體,Ph染色體示9；22易位（9q34;22q11）;fi 22q-;示9+,Burkitt淋巴瘤的14q+染色體8q24;14q32易位,一些腫瘤常見的染色體異常,染色體顯帶技術(shù)的建立，腫瘤非隨機性染色體異常的細胞遺傳學(xué)分析已成為許多人類腫瘤診斷和預(yù)后不可或缺的指標，但常規(guī)顯帶染色體分析不能確定所有的細胞遺傳學(xué)染色體重排。,該技術(shù)的局限性阻礙了許多人類腫瘤，尤其是實體瘤核型的確定，但這種情況已被染色體顯微切割和FISH技術(shù)所彌補。染色體顯微切割已經(jīng)成為由細胞遺傳學(xué)分析快速過渡到分子檢測的有力工具。,細胞核移植技術(shù)：就是將供體細胞核移入除去核的卵母細胞中，使后者不經(jīng)過精子穿透等有性過程即無性繁殖即可被激活、分裂并發(fā)育成新個體，使得核供體的基因得到完全復(fù)制。以供體核的來源不同可分為胚細胞核移植與體細胞核移植兩種。,1 切開卵母細胞透明帶2 擠出卵母細胞細胞核3 注入供體細胞核4 電融合儀融合培養(yǎng),1,2,3,4,5,顯微操作儀,嵌合體技術(shù),嵌合體 (chimera)一詞源于古希臘神話，其意是指獅頭、羊身、龍尾等部分拼湊起來的怪獸。嵌合在生物學(xué)上是指同一個體中，基因型相異的細胞或組織混合存在的狀態(tài)。,現(xiàn)代的胚胎工程技術(shù)中，也有一種叫胚胎嵌合的技術(shù)。它是將個胚胎細胞（同種或異種動物胚胎）合并，共同發(fā)育成個胚胎，即“嵌合胚胎”，然后將這個胚胎移植給受體，讓其妊娠產(chǎn)仔。如果產(chǎn)下來的幼仔具有以上種動物胚胎的細胞，則稱其為“嵌合體動物”。例如，用同一種類的黑鼠和白鼠胚胎嵌合，可生下黑白相間的花小鼠；不同種類的綿羊和山羊胚胎細胞嵌合，可生下綿山羊，它既有綿羊的特征，又有山羊的特征。,1 囊胚顯微注射法：用顯微操作技術(shù)將供胚的全部內(nèi)細胞團注入除去部分內(nèi)細胞團的受胚囊胚腔中，或?qū)⒐┡叩牟糠謨?nèi)細胞團注入受胚的囊胚腔中，也可以向受胚囊胚腔中（或卵周間隙）注入16細胞至桑甚胚的卵裂球、胚胎干細胞或已分化的細胞，使其發(fā)育為嵌合胚胎的方法即為囊胚注入法。,2. 聚合法,是指將去除透明帶的兩枚8細胞至桑葚期胚胎，或來自兩個不同胚胎的卵裂球，或卵裂球與胚胎聚合在一起的方法。,胚胎移植,1.概念:將雌性動物的早期胚胎,或者通過其他方式得到的胚胎,移植到同種的.生理狀態(tài)相同的其他雌性動物的體內(nèi),使之發(fā)育為新個體的技術(shù).供體：提供胚胎的個體。受體：接受胚胎的個體。,染色體顯微切割分手工切割和激光切割法，倒置顯微鏡上裝配切割臂，安上硅化玻璃針，找到分散良好的分裂相來切割所需染色體片段。,顯微切割圖例,1.染色體顯微切割技術(shù)的發(fā)展,染色體顯微切割最早起源于從一個特定的染色體區(qū)域分離出DNA標記，并首先成功地應(yīng)用于果蠅多線染色體和小鼠染色體的研究。,1981年，德國的歐洲分子生物學(xué)實驗室（EMBL）Scalenghe等切割了果蠅唾液腺多線期X染色體第3段的幾個片段，通過蛋白酶消化、酚抽提、EcoR I酶切進行重組克隆。,多線染色體：,1984年染色體顯微切割應(yīng)用小鼠； 1986年Bates等切割了人的2號染色體短臂。但當時由于所切割的染色體DNA量少，通常要切割上百條染色體，且其文庫也只含幾百個微克隆。,由于無法直接擴增染色體DNA，所以必須在顯微鏡下反復(fù)切割若干拷貝的染色體，才能滿足實驗的要求這不僅費力耗時，而且要求實驗操作人員必須具備熟練的染色體分帶和鑒定經(jīng)驗，才保證實驗的準確性。,顯微切割技術(shù)的突破在于它與PCR的結(jié)合，1989年Ludecke等切割了人類G顯帶染色體，結(jié)合PCR技術(shù)進行體外擴增，使其工作量大大減小。,對于同一條染色體，只要切割和收集5 10個拷貝，通過PCR擴增，即可滿足實驗要求。從而極大地提高了實驗技術(shù)的可行性和準確性。,在1989年，Ludecke等建立了一個顯著提高克隆效率的方法。 該方法首先用Rsa I酶切顯微切割的DNA，連接到一個用Sma I酶切的pUC載體，然后用PCR擴增插入位點兩側(cè)的載體序列。,PCR擴增,隨后的研究對該方法進行完善，顯微切割DNA經(jīng)酶切后連接到一個由24堿基或20堿基的寡核苷酸組成的5，端突出連接頭。用20個堿基連接頭作為引物進行PCR擴增顯微切割的DNA，限制酶切擴增產(chǎn)物并克隆到質(zhì)粒載體中去。,替代方法： 該方法用簡并寡核苷酸引物直接用PCR擴增顯微切割DNA。該方法在顯微切割的DNA進行PCR擴增前增加了拓撲異構(gòu)酶I處理，大大簡化了顯微切割的程序。優(yōu)點： 通過減少顯微切割DNA的拷貝數(shù)降低顯微切割的操作時間和難度，同時也降低了外源性DNA污染的風險。,2.染色體顯微切割的應(yīng)用,2.1 感興趣區(qū)域DNA克隆的構(gòu)建,2.2 FISH探針的制備2.3 染色體重排的檢測2.4 區(qū)域特異性cDNA的選擇,2.染色體顯微切割的應(yīng)用,2.1 感興趣區(qū)域DNA克隆的構(gòu)建 顯微切割在人類基因組計劃啟動之前主要是分離填補物理作圖缺口的染色體區(qū)域特有的DNA標記。定位克隆計劃已經(jīng)建立了幾個區(qū)域的特異文庫。,2.2 FISH探針的制備2.3 染色體重排的檢測2.4 區(qū)域特異性cDNA的選擇,物理作圖,要完成真核生物基因組測序的巨大工程，通常首先需要把基因組分解成為許多較小的DNA片段，然后分別測序，再綜合組裝。 物理作圖就是要把基因組分解成為許多較小的DNA片段，然后再把這些DNA片段連接起來，構(gòu)建一個由DNA片段重疊群組成的物理圖（physical map）。,物理圖譜：描繪DNA上可以識別的標記的位置和相互之間的距離（以堿基對的數(shù)目為衡量單位，即物理距離），這些可以識別的標記包括限制性內(nèi)切酶的酶切位點，分子標記及功能基因等。構(gòu)建作圖文庫建立克隆重疊群重疊群長度確定作圖片段錨定整合圖譜,物理作圖的主要環(huán)節(jié),2.染色體顯微切割的應(yīng)用,2.1 感興趣區(qū)域DNA克隆的構(gòu)建2.2 FISH探針的制備 為了檢測以前不可辨認的腫瘤和遺傳病的染色體異常，已普遍采用全染色體探針的熒光原位雜交技術(shù)。為滿足日益增多的高質(zhì)量染色體涂染探針的需求，染色體顯微切割已用于許多FISH探針的制備，包括所有人類的染色體涂染探針、染色體臂涂染探針和區(qū)帶特異性涂染探針。,2.3 染色體重排的檢測2.4 區(qū)域特異性cDNA的選擇,染色體涂染技術(shù),染色體涂染技術(shù)即將整條染色體、某條染色體臂（長臂或短臂）或者染色體某個片斷的DNA制備成探針，然后用熒光原位雜交的方法，將探針雜交到中期分裂相染色體上，在熒光顯微鏡下觀察熒光素在染色體上標記的顏色，從而分析和研究染色體的重組、畸變以及同源基因等的一種新技術(shù)。,染色體涂染,染色體涂染技術(shù),1.染色體DNA探針的制備,2.熒光原位雜交,流式細胞分類法；克隆基因庫或體細胞雜交株；染色體顯微切割和PCR擴增等途徑。,1.染色體DNA探針的制備,流式細胞分類法（flow cytometry） 該法用一種或多種熒光染料將懸浮液中的中期分裂相染色體染色。由于染色體大小、形態(tài)、組成和結(jié)構(gòu)的不同，所染色的特征有其特異性，從而可以通過流式細胞術(shù)將特定的染色體收集起來。,局限性：如果受試物的染色體形態(tài)單一、數(shù)目較多,僅根據(jù)染色體的形態(tài)和大小很難將所有的染色體準確地區(qū)分開來。,局限性：如果受試物的染色體形態(tài)單一、數(shù)目較多，如牛 (2n=60) 和狗(2n=78)的所有常染色體及綿羊(2n=54)和馬(2n= 64)的大部分常染色體都是端位著絲點，因此，僅根據(jù)染色體的形態(tài)和大小很難將所有的染色體準確地區(qū)分開來。,1.染色體DNA探針的制備,克隆基因庫或體細胞雜交株 通過特定的克隆基因文庫或者特異性的體細胞雜交細胞系制備某條染色體整個或部分DNA探針。該法特異性強，準確性高，且可與功能遺傳學(xué)的研究結(jié)合起來，但對實驗室要求較高，取材來源和研究范圍有所限制 。,染色體顯微切割和PCR擴增,通過該方法制備的染色體DNA探針，相對而言，具有直接、準確、 簡便和應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點。,2.熒光原位雜交（ fluorescent in situ hybridazation,FISH）,原位雜交是基于DNA分子復(fù)制原理而發(fā)展起來的一種技術(shù)。用帶有標記（放射性同位素、熒光染料等）的DNA或RNA片段作為核酸探針,與組織切片或細胞內(nèi)待測核酸 (RNA或DNA）片段進行雜交，然后用放射自顯影等方法予以顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的mRNA或DNA的存在及定位。,2.熒光原位雜交,熒光原位雜交是在20世紀80年代末在放射性原為雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性分子細胞遺傳技術(shù)，以熒光標記取代同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法。探針首先與某種介導(dǎo)分子結(jié)合，雜交后再通過免疫細胞化學(xué)過程連接上熒光染料。,基本原理： 如果被檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標記上報告分子如生物素、地高辛，可利用該報告分子與熒光素標記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析。,實驗流程： FISH樣本的制備探針的制備探針標記雜交（染色體顯帶）熒光顯微鏡檢測結(jié)果分析。,優(yōu)點: 熒光試劑和探針經(jīng)濟、安全； 探針穩(wěn)定，一次標記后可在兩年內(nèi)使用； 實驗周期短、能迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準確； 可定位長度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當； 多色FISH在同一個核中顯示不同顏色可同時檢測多種序列； 既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu)。,缺點： 不能達到100%雜交，特別是在應(yīng)用較短的cDNA探針時效率明顯下降。,染色體涂染技術(shù)的應(yīng)用,染色體涂染技術(shù)主要應(yīng)用于動物分子細胞遺傳學(xué)、人類疾病、性染色體以及染色體進化等研究。1995年以來，劍橋大學(xué)應(yīng)用這項技術(shù)進行哺乳動物的染色體比對，他們運用了YAC等細胞的多種染色體作探針，以研究重組染色體的斷裂點。澳大利亞Latrobe大學(xué)以染色體涂染技術(shù)探討人的XY染色體的親緣關(guān)系。美國Ambady等人用顯微切割術(shù)和PCR擴增建立了豬第6號染色體DNA文庫，尋找微星體，用于豬基因圖的研究。國外實驗室主要研究不同種屬的動物(包括人) 或植物染色體(尤其是性染色體) 的比較與進化，研究過的動物有雞、狗、狐、猴、 貓、猿、鼠、兔、牛、羊、山羊以及其它鳥類、有袋類和哺乳類等。,2.染色體顯微切割的應(yīng)用,2.1 感興趣區(qū)域DNA克隆的構(gòu)建2.2 FISH探針的制備2.3 染色體重排的檢測,該方法最引人注目的特點之一是它可直接檢測任何細胞遺傳學(xué)上可見到的染色體重排的染色體結(jié)構(gòu)。該方法已用于分析不同的染色體重排，包括缺失、易位、小的環(huán)狀染色體和擴增。常規(guī)顯帶記為簡單末端缺失的畸變，通過用顯微切割方法重新分析，結(jié)果可清楚地顯示該缺失為中間缺失或易位。應(yīng)用顯微切割對包括同源染色區(qū)域和雙微小體的基因擴增產(chǎn)物進行分析顯示：這些區(qū)域通常是由多個染色體區(qū)段組成。,2.4 區(qū)域特異性cDNA的選擇,FISH檢測（chromosome painting)染色體易位,圖 染色體倒位圖（SISH顯示和電鏡下觀察）,相互易位,2.染色體顯微切割的應(yīng)用,2.1 感興趣區(qū)域DNA克隆的構(gòu)建2.2 FISH探針的制備2.3 染色體重排的檢測2.4 區(qū)域特異性cDNA的選擇,從同源染色區(qū)域（HSR）顯微切割DNA技術(shù)的應(yīng)用，使得從顯微切割區(qū)域內(nèi)分離轉(zhuǎn)錄序列的方法得以建立。顯微切割結(jié)合選擇性雜交已用于鑒別骨肉瘤細胞系中12q11-q13.2HSR有關(guān)的基因。簡單地說，顯微切割DNA的PCR產(chǎn)物被固定在尼龍膜上，然后將從癌細胞系中用隨機引物法制備的cDNA與靶HSR進行雜交。經(jīng)雜交和嚴格洗脫后，特異性雜交的cDNA克隆被洗脫并用PCR方法回收。,3.染色體顯微切割策略,染色體顯微切割,用拓撲異構(gòu)酶I處理切割的DNA,顯微切割DNA的擴增,熒光原位雜交（FISH）,染色體顯微切割,用于顯微切割的中期染色體是用植物血球凝集素（PHA）刺激正常外周血淋巴細胞制備的，中期分裂相滴在干凈的蓋玻片上并進行G顯帶，通常35個拷貝的靶染色體區(qū)域足以獲得高質(zhì)量探針。 染色體顯微切割是用安裝在倒置顯微鏡上的顯微操作裝置控制一個玻璃針來完成的。顯微切割的染色體片段轉(zhuǎn)移到5微升含拓撲異構(gòu)酶I的收集液中。,用拓撲異構(gòu)酶I處理切割的DNA,在PCR擴增前，切割的DNA用拓撲異構(gòu)酶I處理，使得結(jié)構(gòu)非常緊密的DNA螺旋解旋。這種處理可以顯著提高被切割DNA序列的回收。 收集到期望數(shù)量的被切割染色體區(qū)段后，顯微切割的DNA在37度條件下用拓撲異構(gòu)酶I處理1小時。,顯微切割DNA的擴增,擴增被切割DNA最困難的問題是PCR反應(yīng)的有效啟動。Taq聚合酶對啟動PCR不是高效的，因為它的延伸溫度是72度，而對部分簡并引物的最佳退火溫度大約是30度。為了解決這個問題，在PCR第58個循環(huán)加入T7 DNA聚合酶（測序酶），并且酶是在每個循環(huán)的退火溫度（30度）時加入。完成此種預(yù)擴增后，接著用Taq聚合酶催化的常規(guī)PCR反應(yīng)完成。,T7 DNA聚合酶最初具有53聚合酶活性以及單鏈和雙鏈35外切酶活性。 當T7 DNA聚合酶用適當方法處理后,可使35外切酶活力明顯下降。改造后的T7 DNA聚合酶又稱T7測序酶。 使用T7測序酶得到的測序數(shù)據(jù)具有在每個堿基位置都有相對均勻的配對參入。因此，放射自顯影所得到的結(jié)果較為清晰易辯，對于許多模板來說，使用含有dGTP的混合物即可得到理想的測序結(jié)果。然而，如果出現(xiàn)了帶壓縮的問題，則用含 dITP的混合物來取代常規(guī)的dGTP。dITP的摻入，使在富含GC的模板中也能有效地消除帶壓縮現(xiàn)象。,T7測序酶具有很高的聚合速度，并有高度的延續(xù)性，正因如此，該酶在使用中不同于Kleno