十體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)

118 十 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)十 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn) In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test 1 范圍范圍 本規(guī)范規(guī)定了體外哺乳類細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)的基本原則 要求和方法 本規(guī)范適用于檢測(cè)化妝品原料及其產(chǎn)品的致突變性 2 規(guī)范性引用文件規(guī)范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals No 476 1997 3 試驗(yàn)?zāi)康脑囼?yàn)?zāi)康?該測(cè)試系統(tǒng)用于檢測(cè)化妝品原料及其產(chǎn)品引起的突變 包括堿基對(duì)突變 移碼突變和缺 失等 從而評(píng)價(jià)受試物引起突變的可能性 4 定義定義 正向突變 Forward mutation 從原型至突變子型的基因突變 這種突變可引起酶和功 能蛋白的改變 突變頻率 Mutant frequency 所觀察到的突變細(xì)胞數(shù)與存活細(xì)胞數(shù)之比值 5試驗(yàn)原理試驗(yàn)原理 在加入和不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下 使細(xì)胞暴露于受試物一定時(shí)間 然后將細(xì)胞再 傳代培養(yǎng) 突變細(xì)胞在含有 6 硫代鳥嘌呤 6 thioguanine 6 TG 或三氟胸苷 trifluorothymidine TFT 的選擇性培養(yǎng)液中能繼續(xù)分裂并形成集落 基于突變集落數(shù) 計(jì) 算突變頻率以評(píng)價(jià)受試物的致突變性 6 試驗(yàn)方法試驗(yàn)方法 6 1 試劑和受試物制備 6 1 1 受試物 6 1 1 1 受試物的配制 固體受試物需溶解或懸浮于溶劑中 用前稀釋至適合濃度 液體受 試物可以直接加入試驗(yàn)系統(tǒng) 或用前稀釋至適合濃度 受試物應(yīng)在使用前新鮮配制 否則就必 須證實(shí)儲(chǔ)存不影響其穩(wěn)定性 6 1 1 2 溶劑的選擇 溶劑必須是非致突變物 不與受試物發(fā)生化學(xué)反應(yīng) 不影響細(xì)胞存活 和 S9 活性 首選溶劑是水或水溶性溶劑 二甲基亞砜 DMSO 也是常用溶劑 但使用時(shí)濃 度不應(yīng)大于 0 5 6 1 1 3 受試物濃度設(shè)置 6 1 1 3 1 最高濃度的選擇 決定最高濃度的因素是細(xì)胞毒性 受試物在試驗(yàn)系統(tǒng)中的溶解 度以及 pH 或滲克分子濃度 osmolality 的改變 6 1 1 3 2 細(xì)胞毒性的確定 應(yīng)使用指示細(xì)胞完整性和生長(zhǎng)情況的指標(biāo) 在活化系統(tǒng)存在或 不存在兩種條件下確定細(xì)胞毒性 例如相對(duì)集落形成率或相對(duì)細(xì)胞總生長(zhǎng)情況 total growth 應(yīng)在預(yù)試驗(yàn)中確定細(xì)胞毒性和溶解度 6 1 1 3 3 劑量設(shè)置 119 至少應(yīng)設(shè)置 4 個(gè)可供分析的濃度 當(dāng)有細(xì)胞毒性時(shí) 其濃度范圍應(yīng)包括從最大毒性至幾 乎無毒性 通常濃度間隔系數(shù)不大于 10 如最高濃度是基于細(xì)胞毒性 那么該濃度組的細(xì)胞相對(duì)存活率 相對(duì)集落形成率 或相 對(duì)細(xì)胞總生長(zhǎng)情況應(yīng)為 10 20 不低于 10 對(duì)于那些細(xì)胞毒性很低的化合物 最高濃度應(yīng)是 5 L mL 5mg mL 或 0 0lmol L 對(duì)于相對(duì)不溶解的物質(zhì) 其最高濃度應(yīng)達(dá)到或超過在細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)下的溶解度限值 最 好在試驗(yàn)處理開始和結(jié)束時(shí)均評(píng)價(jià)溶解度 因?yàn)橛捎?S9等的存在 試驗(yàn)系統(tǒng)內(nèi)在暴露過程中 溶解度可能發(fā)生變化 不溶解性可用肉眼鑒別 但沉淀不應(yīng)影響觀察 6 1 2 對(duì)照 在每一項(xiàng)試驗(yàn)中 在代謝活化系統(tǒng)存在和不存在的條件下均應(yīng)設(shè)陽性對(duì)照和陰 性 溶劑 對(duì)照 6 1 2 1 陽性對(duì)照 當(dāng)使用代謝活化系統(tǒng)時(shí) 陽性對(duì)照物必須是要求代謝活化 并能引起突 變的物質(zhì) 在沒有代謝活化系統(tǒng)時(shí) 陽性對(duì)照物可使用甲磺酸乙酯 ethyl methanesulfonate EMS 甲磺酸甲酯 methyl methanesulphonate MMS 乙基亞硝基脲 ethyl nitrosourea ENU 等 在有代謝活化系統(tǒng)時(shí) 可以使用 3 甲基膽蒽 3 methylcholanthrene 環(huán)磷酰胺 cyclophosphamide N 亞硝基胍 N nitroso dimethylamine 7 12 二甲基苯蒽等 也可使用 其他適宜的陽性對(duì)照物 6 1 2 2 陰性對(duì)照物 陰性對(duì)照 包括溶劑對(duì)照 除不含受試物外 其他處理應(yīng)與受試物相 同 此外 當(dāng)不具有實(shí)驗(yàn)室歷史資料證實(shí)所用溶劑無致突變作用和無其他有害作用時(shí) 還應(yīng) 設(shè)空白對(duì)照 6 1 3 細(xì)胞 HPRT 位點(diǎn)突變分析常用中國(guó)倉鼠肺細(xì)胞株 V 79 和中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞株 CHO TK 位點(diǎn)突變分析常用小鼠淋巴瘤細(xì)胞株 L5178Y 和人類淋巴母細(xì)胞株 TK6 6 1 4 培養(yǎng)液 應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)所用系統(tǒng)和細(xì)胞類型來選擇適宜的培養(yǎng)基 對(duì)于 V 79 或 CHO 細(xì) 胞 常用 MEM Eagle 培養(yǎng)基加入 10 胎牛血清和適量抗菌素 對(duì)于 L5178Y 或 TK6 細(xì)胞 常用 RPMI 1640 培養(yǎng)基加入 10 馬血清和適量抗菌素 6 1 5 活化系統(tǒng) 同體外哺乳類細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn) 6 1 6 選擇劑 6 硫代鳥嘌呤 6 TG 建議使用終濃度為 5mg mL 三氟胸苷 TFT 建 議使用終濃度為 3mg mL 6 2 試驗(yàn)步驟 6 2 1 HPRT 位點(diǎn)突變分析 6 2 1 1 試驗(yàn)前 1d 接種細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中 置于 37 C 孵箱培養(yǎng) 6 2 1 2 試驗(yàn)時(shí)吸去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液 加入一定濃度的受試物 S9 mix 不加入 S9 mix 的 樣品 用培養(yǎng)液補(bǔ)足 及一定量的不含血清培養(yǎng)液 置孵箱中處理 3h 6h 后 吸去培養(yǎng)液 用 Hank s 液洗細(xì)胞三次 加入含胎牛血清的培養(yǎng)液 6 2 1 3 在受試物與細(xì)胞作用后當(dāng)天和第 3d 將細(xì)胞按低密度分種 在第 7d 接種細(xì)胞 每個(gè) 劑量 3 瓶 7d 后染色以測(cè)定細(xì)胞存活率 另將一定數(shù)量細(xì)胞接種于每個(gè)培養(yǎng)瓶中 每個(gè)劑 量 8 瓶 3h 后加入 6 TG 終濃度為 5mg mL 10d 后染色 計(jì)數(shù)突變細(xì)胞集落 6 2 1 4 試驗(yàn)結(jié)果用 x 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析 6 2 2 TK 位點(diǎn)突變分析 L5178Y 細(xì)胞 96 孔板法 6 2 2 1 處理 取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞 調(diào)整密度為 5 105 mL 按 1 體積加入受試物 37 震 搖處理 3 小時(shí) 離心 棄上清液 用 PBS 或不含血清的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞 2 遍 重新懸浮細(xì)胞 于含 10 馬血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)液中 并調(diào)整細(xì)胞密度為 2 105 mL 120 6 2 2 2 PE0 0 天的平板接種效率 測(cè)定 取適量細(xì)胞懸液 作梯度稀釋至 8 個(gè)細(xì)胞 mL 接種 96 孔板 每孔加 0 2 mL 即平均 1 6 個(gè)細(xì)胞 孔 每個(gè)劑量作 1 2 塊板 37 5 CO2 飽和濕度條件下培養(yǎng) 12d 計(jì)數(shù)每塊平板有集落生長(zhǎng)的孔數(shù) 6 2 2 3 表達(dá) 步驟 6 2 2 1 所得細(xì)胞懸液作 2d 表達(dá)培養(yǎng) 每天計(jì)數(shù)細(xì)胞密度并保持密度在 106 ml 以下 6 2 2 4 PE2 第 2d 的平板接種效率 測(cè)定 第 2d 表達(dá)培養(yǎng)結(jié)束后 取適量細(xì)胞懸液 按步 驟 6 2 2 2 作梯度稀釋并接種 96 孔板 培養(yǎng) 12d 后計(jì)數(shù)每塊平板有集落生長(zhǎng)的孔數(shù) 6 2 2 5 TFT 抗性突變頻率 MF 測(cè)定 第 2d 表達(dá)培養(yǎng)結(jié)束后 取適量細(xì)胞懸液 調(diào)整細(xì) 胞密度為 1 104 mL 加入 TFT 三氟胸苷 終濃度為 3 g mL 混勻 接種 96 孔板 每孔 加 0 2 mL 即平均 2000 個(gè)細(xì)胞 孔 每個(gè)劑量作 2 4 塊板 37 5 CO2 飽和濕度條件 下培養(yǎng) 12d 計(jì)數(shù)有突變集落生長(zhǎng)的孔數(shù) 6 2 2 6 計(jì)算 6 2 2 6 1 平板效率 PE0 和 PE2 ln EW TW PE 1 6 式中 EW 為無集落生長(zhǎng)的孔數(shù) TW 為總孔數(shù) 1 6 為每孔接種細(xì)胞數(shù) 6 2 2 6 2 相對(duì)存活率 RS PE0 處理 相對(duì)存活率 RS PE0 對(duì)照 100 6 2 2 6 3 突變頻率 MF ln EW TW n MF 10 6 PE2 式中 EW 為無集落生長(zhǎng)的孔數(shù) TW 為總孔數(shù) n 為每孔接種細(xì)胞數(shù) 2000 7 結(jié)果評(píng)價(jià)結(jié)果評(píng)價(jià) 在下列兩種情況下可判定受試物在本試驗(yàn)系統(tǒng)中為陽性結(jié)果 1 受試物引起突變頻率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 并與劑量相關(guān)的增加 2 受試物在任何一個(gè)劑量條件下 引起具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 并有可重復(fù)性的陽性反應(yīng) 陰性結(jié)果的判定需在 RS 達(dá) 20 即已產(chǎn)生明顯細(xì)胞毒性 的情況下未見突變頻率顯 著增加時(shí)方可作出 在評(píng)價(jià)時(shí)應(yīng)把生物學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義結(jié)合考慮 陽性結(jié)果表明受試物可引起所用哺乳類細(xì)胞的基因突變 可重復(fù)的陽性劑量 反應(yīng)關(guān)系 意義更大 陰性結(jié)果表明在本試驗(yàn)條件下 受試物不引起所用哺乳類細(xì)胞的基因突變 8 試驗(yàn)報(bào)告試驗(yàn)報(bào)告 試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括以下內(nèi)容 1 受試物名稱 有關(guān)的理化性狀 所用溶劑及其配制 劑量選擇 應(yīng)說明受試物對(duì)細(xì) 胞毒性的測(cè)定方法 溶解情況等 2 細(xì)胞株名稱 3 實(shí)驗(yàn)條件和方法 代謝活化系統(tǒng) 制備 S 時(shí)所用的誘導(dǎo)劑 動(dòng)物品種和來源 S mix 的配方 對(duì)照物 陽性對(duì)照物名稱和使用濃度 陰性 溶劑 對(duì)照物名稱及使用濃度 培養(yǎng)液 所用培養(yǎng)液名稱 血清類別和使用濃度