rna提取步驟.doc

RNAfast200 總RNA 極速抽提試劑盒 適用范圍：細(xì)胞、組織、全血、骨髓、體液、細(xì)菌、病毒Catalog no. 220010 50 次保存條件：室溫，保質(zhì)期2年。技術(shù)支持：使用中遇到任何問題或建議，請(qǐng)通過E-mail（）與我們的技術(shù)支持部門聯(lián)系，部門的資深分子生物學(xué)專家將在2個(gè)工作日內(nèi)給予答復(fù)。性能介紹： 樣本量全血10-1,000l，培養(yǎng)細(xì)胞1107，組織30mg，細(xì)菌90%產(chǎn)量1-5g/ml全血，100-300g/1107細(xì)胞，1-6g/ mg組織，50-200g/1109細(xì)菌純度OD260/OD280: 1.92.1特點(diǎn)1. 可能是目前國(guó)際上速度最快、步驟最少的總RNA提取方法2. 獲得的RNA質(zhì)量與Trizol提取相同，但操作更穩(wěn)定，RNA不易丟失，不同提取批次間變異小，較少發(fā)生DNA和蛋白質(zhì)污染3. 獲得的RNA完整性好，純度高，得率高，可以滿足目前所有的后繼實(shí)驗(yàn)要求4. 適用性廣，可同時(shí)適用于動(dòng)物組織、細(xì)胞、細(xì)菌、植物組織等的總RNA提取5. 可直接處理血清、血漿及其它體液6. 非常適于臨床標(biāo)本病毒RNA抽提用于RT-PCR檢測(cè)7. 生產(chǎn)全線除RNase處理及防護(hù)，所有容器及試劑除RNase處理用途普通RT-PCR，定量RT-PCR， NASBA，表達(dá)芯片分析，cDNA合成，構(gòu)建cDNA文庫(kù)，RPA，Northern Blot，mRNA篩選等試劑盒組成：( Catalog no. 220010 50 次)RA110ml（僅提取細(xì)胞漿RNA時(shí)使用）RA230ml洗液60ml（已加有15ml）洗脫液10ml內(nèi)套柱，外套柱50套鋼網(wǎng)，平皿，研磨棒需要時(shí)另配（提取組織RNA時(shí)用）說明書1份操作流程：實(shí)驗(yàn)操作前請(qǐng)先認(rèn)真閱讀“注意事項(xiàng)”1 樣本預(yù)處理a 抗凝全血：離心管中先加入3ml淋巴細(xì)胞分離液，在上層小心加上2-3ml抗凝全血，1,500rpm室溫離心15min，吸取中間層細(xì)胞至1.5ml eppendorf管，加入生理鹽水1ml，4,000rpm離心2min，倒去上清，加入生理鹽水100l，充分振蕩形成細(xì)胞懸液，直至沒有細(xì)胞團(tuán)塊（重要）；b 組織塊：剪切成小塊后放入平皿（置冰袋上預(yù)冷）中的鋼網(wǎng)上，加入DEPC處理的PBS或生理鹽水（約1ml/30mg組織），用研磨棒將組織研磨擠壓過鋼網(wǎng)，收集過網(wǎng)懸液，取100l放入eppendorf管中（也可采用液氮中搗碎或冰浴中勻漿的方法）；c 培養(yǎng)細(xì)胞：懸浮細(xì)胞離心后留下細(xì)胞團(tuán)塊和適量上清（100l/2106細(xì)胞），充分震蕩直至沒有細(xì)胞團(tuán)塊（重要）。取100l放入eppendorf管中；貼壁細(xì)胞消化后處理同上。d 采用細(xì)胞漿RNA提取方法時(shí)，取上述組織研磨液或各類細(xì)胞懸液離心（2,000rpm2min），去除上清后充分振蕩致細(xì)胞團(tuán)松散，加入RA1液（100l/1107細(xì)胞或30mg組織），充分振蕩混勻30s，再離心30s，吸取100l上清液放入新的eppendorf管中；e 體液及其它液體性樣本：尿液、腹水、胸水、腦積液等根據(jù)需要取1-10ml，離心2min，留下沉淀及約100l上清，充分震蕩懸浮沉淀；有時(shí)也可以直接取樣本100l； f 細(xì)菌：培養(yǎng)良好的細(xì)菌菌液1ml，離心后留下細(xì)菌團(tuán)塊及大約100l上清，充分振蕩懸浮細(xì)菌，直至沒有細(xì)胞團(tuán)塊（重要）。2 處理好的樣本中，加入RA2液500l，充分顛倒混勻1min。3 將樣本裂解物吸入或倒入內(nèi)套管，離心1min。4 棄去外套管中液體，內(nèi)套管中加入500 l洗液，離心1min。再重復(fù)此過程洗一次。5 取出內(nèi)套管，棄去外套管中液體，仍然套回內(nèi)套管，不加洗液，離心1min。6 將內(nèi)套管移入新的eppendorf管中，在膜中央加入洗脫液（或pH7.0的DEPC處理水）25-50l，室溫靜置1min，離心1min，獲得總RNA。注意事項(xiàng)：1. 試劑盒室溫保存，保質(zhì)期2年。2. 離心速度均為12,000rpm-14,000rpm，室溫離心（有條件可4離心）。以eppendorf 5417離心機(jī)為例，12,000rpm13,362g，其它類型離心機(jī)轉(zhuǎn)速應(yīng)達(dá)到相近的g數(shù)。3. 首次使用時(shí)在洗液瓶中加入45ml無污染的分析純無水乙醇，用后擰緊瓶蓋。4. 避免環(huán)境中RNA酶污染，操作要戴手套，所有槍頭和eppendorf管以DEPC水處理，移液槍保證潔凈無RNA酶污染。如果把試劑放在超凈臺(tái)（普通超凈臺(tái)或?qū)Ｓ玫淖烂鍼CR超凈臺(tái)）中操作，可以有效減少RNA酶污染。5. 血液抽取后應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)提取RNA。凍存的血液RNA大部分丟失，不能用于提取。如果不能盡快提取，可以先用淋巴細(xì)胞分離液分離獲得細(xì)胞后（包括其它的細(xì)胞、組織），保存在RNA保存液（RNAwait）中。如果試劑盒主要用于提取全血或骨髓RNA，建議采用RNAfast1000（全血樣本1-2ml）、RNAfast2000（全血樣本2-10ml，詳細(xì)資料請(qǐng)查閱本公司網(wǎng)站）。6. 對(duì)細(xì)胞量2106以下，或組織6mg以下，按照上述標(biāo)準(zhǔn)流程操作；對(duì)更多量的細(xì)胞和組織，有以下兩種方案：a. 提取細(xì)胞漿RNA（操作流程1d），可以一次處理1107細(xì)胞、30mg組織（甚至更大量）。由于RNA 90%以上存在于細(xì)胞胞漿中，因而此方法可以提取獲得絕大部分RNA，除有特殊要求提取其它部位RNA的實(shí)驗(yàn)外，一般均可選用此方法；b. 按細(xì)胞量每2106，或組織每6mg加入RA2液600l。例如1107細(xì)胞加入RA2液3000l，充分顛倒混勻2min，分5次取600l移入同一內(nèi)套管離心；或者分取600l同時(shí)加入5支內(nèi)套管離心。后續(xù)提取過程按照上述標(biāo)準(zhǔn)流程操作。7. 有時(shí)實(shí)驗(yàn)者發(fā)現(xiàn)樣本中加入RA2液后，出現(xiàn)白色絮狀、絲狀沉淀，這是由于加入RA2液前沒有充分振蕩混勻細(xì)胞懸液或細(xì)胞量過大，將影響RNA的得率。8. 樣本裂解物加入內(nèi)套管中離心1min結(jié)束后，如管中仍有液體，表明樣本超量或裂解不完全導(dǎo)致吸附膜阻塞。處理方案是：a.減少樣本量；b.加入RA2液后充分震蕩；c.如已發(fā)生阻塞又不想放棄此標(biāo)本，可用加樣槍頭劃破內(nèi)套管膜的表層，再重新離心1min。9. 盡量保證在膜中央加入洗脫液，低于25l將不能保證吸附膜被充分浸潤(rùn)。10. 洗脫液pH7.0時(shí)會(huì)明顯降低RNA的洗脫效率，而國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室用水大多呈偏酸性，自備洗脫液時(shí)應(yīng)當(dāng)注意。本試劑盒提供的洗脫液為pH7.6。11. 如果獲得的總RNA出現(xiàn)有明顯的基因組DNA污染，表明操作失誤，如樣本中液體量太多或