離心分光技術(shù).doc

5 離心技術(shù) 離心技術(shù)在生物科學(xué)，特別是在生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究領(lǐng)域，已得到十分廣泛的應(yīng)用，每個生物化學(xué)和分子生物學(xué)實驗室都要裝備多種型式的離心機(jī)。離心技術(shù)主要用于各種生物樣品的分離和制備，生物樣品懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒（細(xì)胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離，而沉降速度取決于顆粒的質(zhì)量、大小和密度。5.1 基本原理 當(dāng)一個粒子（生物大分子或細(xì)胞器）在高速旋轉(zhuǎn)下受到離心力作用時，此離心力“F”由下式定義，即： F = ma = m2 r a 粒子旋轉(zhuǎn)的加速度， m 沉降粒子的有效質(zhì)量，粒子旋轉(zhuǎn)的角速度， r粒子的旋轉(zhuǎn)半徑( cm )。 通常離心力常用地球引力的倍數(shù)來表示，因而稱為相對離心力 “ RCF ”?；蛘哂脭?shù)字乘“g”來表示，例如25000g，則表示相對離心力為25000。相對離心力是指在離心場中，作用于顆粒的離心力相當(dāng)于地球重力的倍數(shù)，單位是重力加速度“g”（980cm/sec2），此時“RCF”相對離心力可用下式計算： RCF = 1.119105(rpm)2 r ( rpm revolutions per minute每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，r/min ) 由上式可見，只要給出旋轉(zhuǎn)半徑r，則RCF和rpm之間可以相互換算。但是由于轉(zhuǎn)頭的形狀及結(jié)構(gòu)的差異，使每臺離心機(jī)的離心管，從管口至管底的各點與旋轉(zhuǎn)軸之間的距離是不一樣的，所以在計算是規(guī)定旋轉(zhuǎn)半徑均用平均半徑“ra v”代替： ra v=( r minrmax) / 2 r的測量如下圖所示： 34 rmin 旋轉(zhuǎn)軸 rav rmax 一般情況下，低速離心時常以轉(zhuǎn)速“rpm”來表示，高速離心時則以“g” 表示。計算顆粒的相對離心力時，應(yīng)注意離心管與旋轉(zhuǎn)軸中心的距離“r”不同，即沉降顆粒在離心管中所處位置不同，則所受離心力也不同。因此在報告超離心條件時，通?？偸怯玫匦囊Φ谋稊?shù)“g”代替每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)“rpm”，因為它可以真實地反映顆粒在離心管內(nèi)不同位置的離心力及其動態(tài)變化?？萍嘉墨I(xiàn)中離心力的數(shù)據(jù)通常是指其平均值（RCFa v），即離心管中點的離心力。 為便于進(jìn)行轉(zhuǎn)速和相對離心力之間的換算，Dole 和Cotzias 利用RCF的計算公式，制作了轉(zhuǎn)速“rpm”、相對離心力“RCF”和旋轉(zhuǎn)半徑“r”三者關(guān)系的列線圖，圖式法比公式計算法方便（列線圖參見附錄）。換算時，先在r標(biāo)尺上取已知的半徑和在rpm標(biāo)尺上取已知的離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)，然后將這兩點間劃一條直線，與圖中RCF標(biāo)尺上的交叉點即為相應(yīng)的相對離心力數(shù)值。注意，若已知的轉(zhuǎn)數(shù)值處于rpm標(biāo)尺的右邊，則應(yīng)讀取RCF標(biāo)尺右邊的數(shù)值，轉(zhuǎn)數(shù)值處于rpm標(biāo)尺左邊，則應(yīng)讀取RCF標(biāo)尺左邊的數(shù)值。5.2 離心機(jī)的主要構(gòu)造和類型 離心機(jī)可分為工業(yè)用離心機(jī)和實驗用離心機(jī)。實驗用離心機(jī)又分為制備性離心機(jī)和分析性離心機(jī)，制備性離心機(jī)主要用于分離各種生物材料，每次分離的樣品容量比較大，分析性離心機(jī)一般都帶有光學(xué)系統(tǒng)，主要用于研究純的生物大分子和顆粒的理化性質(zhì)，依據(jù)待測物質(zhì)在離心場中的行為（用離心機(jī)中的光學(xué)系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測），能推斷物質(zhì)的純度、形狀和分子量等。分析性離心機(jī)都是超速離心機(jī)。 1. 制備性離心機(jī)可分為三類： 普通離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速6000 rpm左右，最大相對離心力近6000g，容量為幾十毫升至幾升，分離形式是固液沉降分離，轉(zhuǎn)子有角式和外擺式，其轉(zhuǎn)速不能嚴(yán)格控制，通常不帶冷凍系統(tǒng)，于室溫下操作，用于收集易沉降的大顆粒物質(zhì)，如紅血球、酵母細(xì)胞等。這種離心機(jī)多用交流整流子電動機(jī)驅(qū)動，電機(jī)的碳刷易磨損，轉(zhuǎn)速是用電壓調(diào)壓器調(diào)節(jié)，起動電流大，速度升降不均勻，一般轉(zhuǎn)頭是置于一個硬質(zhì)鋼軸上，因此精確地平衡離心管及內(nèi)容物就極為重要，否則會損壞離心機(jī)。 高速冷凍離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速為2000025000rpm（r/min），最大相對離心力為89000g，最大容量可達(dá)3升，分離形式也是固液沉降分離，轉(zhuǎn)頭配有各種角式轉(zhuǎn)頭、蕩平式轉(zhuǎn)頭、區(qū)帶轉(zhuǎn)頭、垂直轉(zhuǎn)頭和大容量連續(xù)流動式轉(zhuǎn)頭、一般都有制冷系統(tǒng)，以消除高速旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)頭與空氣之間摩擦而產(chǎn)生的熱量，離心室的溫度可以調(diào)節(jié)和維持在040C，轉(zhuǎn)速、溫度和時間都可以嚴(yán)格準(zhǔn)確地控制，并有指針或數(shù)字顯示，通常用于微生物菌體、細(xì)胞碎片、大細(xì)胞器、硫銨沉淀和免疫沉淀物等的分離純化工作，但不能有效地沉降病毒、小細(xì)胞器(如核蛋白體)或單個分子。 超速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速可達(dá)5000080000 rpm，相對離心力最大可達(dá)510000g，最著名的生產(chǎn)廠商有美國的貝克曼公司和日本的日立公司等，離心容量由幾十毫升至2升，分離的形式是差速沉降分離和密度梯度區(qū)帶分離，離心管平衡允許的誤差要小于0.1克。超速離心機(jī)的出現(xiàn)，使生物科學(xué)的研究領(lǐng)域有了新的擴(kuò)展，它能使過去僅僅在電子顯微鏡觀察到的亞細(xì)胞器得到分級分離，還可以分離病毒、核酸、蛋白質(zhì)和多糖等。超速離心機(jī)主要由驅(qū)動和速度控制、溫度控制、真空系統(tǒng)和轉(zhuǎn)頭四部分組成。超速離心機(jī)的驅(qū)動裝置是由水冷或風(fēng)冷電動機(jī)通過精密齒輪箱或皮帶變速，或直接用變頻感應(yīng)電機(jī)驅(qū)動，并由微機(jī)進(jìn)行控制，由于驅(qū)動軸的直徑較細(xì)，因而在旋轉(zhuǎn)時此細(xì)軸可有一定的彈性彎曲，以適應(yīng)轉(zhuǎn)頭輕度的不平衡，而不致于引起震動或轉(zhuǎn)軸損傷，除速度控制系統(tǒng)外，還有一個過速保護(hù)系統(tǒng)，以防止轉(zhuǎn)速超過轉(zhuǎn)頭最大規(guī)定轉(zhuǎn)速而引起轉(zhuǎn)頭的撕裂或爆炸，為此，離心腔用能承受此種爆炸的裝甲鋼板密閉。溫度控制是由安裝在轉(zhuǎn)頭下面的紅外線射量感受器直接并連續(xù)監(jiān)測離心腔的溫度，以保證更準(zhǔn)確更靈敏的溫度調(diào)控，這種紅外線溫控比高速離心機(jī)的熱電偶控制裝置更敏感，更準(zhǔn)確。超速離心機(jī)裝有真空系統(tǒng)，這是它與高速離心機(jī)的主要區(qū)別。離心機(jī)的速度在2000 rpm以下時，空氣與旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)頭之間的磨擦只產(chǎn)生少量的熱，速度超過20000 rpm時，由磨擦產(chǎn)生的熱量顯著增大，當(dāng)速度在40000 rpm以上時，由磨擦產(chǎn)生的熱量就成為嚴(yán)重問題，為此，將離心腔密封，并由機(jī)械泵和擴(kuò)散泵串聯(lián)工作的真空泵系統(tǒng)抽成真空，溫度的變化容易控制，磨擦力很小，這樣才能達(dá)到所需的超高轉(zhuǎn)速。2. 轉(zhuǎn)頭： 角式轉(zhuǎn)頭：角式轉(zhuǎn)頭是指離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定傾角的轉(zhuǎn)頭。它是由一塊完整的金屬制成的，其上有412個裝離心管用的機(jī)制孔穴，即離心管腔，孔穴的中心軸與旋轉(zhuǎn)軸之間的角度在2040度之間，角度越大沉降越結(jié)實，分離效果越好。這種轉(zhuǎn)頭的優(yōu)點是具有較大的容量，且重心低，運轉(zhuǎn)平衡，壽命較長，顆粒在沉降時先沿離心力方向撞向離心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一側(cè)就會出現(xiàn)顆粒沉積，此現(xiàn)象稱為“壁效應(yīng)”，壁效應(yīng)容易使沉降顆粒受突然變速所產(chǎn)生的對流擾亂，影響分離效果。 蕩平式轉(zhuǎn)頭：這種轉(zhuǎn)頭是由吊著的4或6個自由活動的吊桶（離心套管）構(gòu)成。當(dāng)轉(zhuǎn)頭靜止時，吊桶垂直懸掛，當(dāng)轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)速達(dá)到每分鐘200到800轉(zhuǎn)時，吊桶蕩至水平位置，這種轉(zhuǎn)頭最適合做密度梯度區(qū)帶離心，其優(yōu)點是梯度物質(zhì)可放在保持垂直的離心管中，離心時被分離的樣品帶垂直于離心管縱軸，而不像角式轉(zhuǎn)頭中樣品沉淀物的界面與離心管成一定角度，因而有利于離心結(jié)束后由管內(nèi)分層取出已分離的各樣品帶。其缺點是顆粒沉降距離長，離心所需時間也長。 區(qū)帶轉(zhuǎn)頭：區(qū)帶轉(zhuǎn)頭無離心管，主要由一個轉(zhuǎn)子桶和可旋開的頂蓋組成，轉(zhuǎn)子桶中裝有十字型隔板裝置，把桶內(nèi)分隔成四個或多個扇形小室，隔板內(nèi)有導(dǎo)管，梯度液或樣品液從轉(zhuǎn)頭中央的進(jìn)液管泵入，通過這些導(dǎo)管分布到轉(zhuǎn)子四周，轉(zhuǎn)頭內(nèi)的隔板可保持樣品帶和梯度介質(zhì)的穩(wěn)定。沉降的樣品顆粒在區(qū)帶轉(zhuǎn)頭中的沉降情況不同于角式和外擺式轉(zhuǎn)頭，在徑向的散射離心力作用下，顆粒的沉降距離不變，因此區(qū)帶轉(zhuǎn)頭的“壁效應(yīng)”極小，可以避免區(qū)帶和沉降顆粒的紊亂，分離效果好，而且還有轉(zhuǎn)速高，容量大，回收梯度容易和不影響分辨率的優(yōu)點，使超離心用于制備和工業(yè)生產(chǎn)成為可能。區(qū)帶轉(zhuǎn)頭的缺點是樣品和介質(zhì)直接接觸轉(zhuǎn)頭，耐腐蝕要求高，操作復(fù)雜。 垂直轉(zhuǎn)頭：其離心管是垂直放置，樣品顆粒的沉降距離最短，離心所需時間也短，適合用于密度梯度區(qū)帶離心，離心結(jié)束后液面和樣品區(qū)帶要作九十度轉(zhuǎn)向，因而降速要慢。 連續(xù)流動轉(zhuǎn)頭：可用于大量培養(yǎng)液或提取液的濃縮與分離，轉(zhuǎn)頭與區(qū)帶轉(zhuǎn)頭類似，由轉(zhuǎn)子桶和有入口和出口的轉(zhuǎn)頭蓋及附屬裝置組成，離心時樣品液由入口連續(xù)流入轉(zhuǎn)頭，在離心力作用下，懸浮顆粒沉降于轉(zhuǎn)子桶壁，上清液由出口流出。3. 離心管：離心管主要用塑料和不銹鋼制成，塑料離心管常用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸酯（PC），聚丙烯（PP）等，其中PP管性能較好。塑料離心管的優(yōu)點是透明（或半透明），硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺點是易變形，抗有機(jī)溶劑腐蝕性差，使用壽命短。不銹鋼管強(qiáng)度大，不變形，能抗熱，抗凍，抗化學(xué)腐蝕。但用時也應(yīng)避免接觸強(qiáng)腐蝕性的化學(xué)藥品，如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等。塑料離心管都有管蓋，離心前管蓋必須蓋嚴(yán)，倒置不漏液。管蓋有三種作用：防止樣品外泄。用于有放射性或強(qiáng)腐蝕性的樣品時，這點尤其重要。防止樣品揮發(fā)。支持離心管，防止離心管變形。4. 分析性離心機(jī)：分析性離心機(jī)使用了特殊設(shè)計的轉(zhuǎn)頭和光學(xué)檢測系統(tǒng)，以便連續(xù)地監(jiān)視物質(zhì)在一個離心場中的沉降過程。從而確定其物理性質(zhì)。分析性超速離心機(jī)的轉(zhuǎn)頭是橢圓形的，以避免應(yīng)力集中于孔處。此轉(zhuǎn)頭通過一個有柔性的軸聯(lián)接到一個高速的驅(qū)動裝置上，轉(zhuǎn)頭在一個冷凍的和真空的腔中旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)頭上有26個裝離心杯的小室，離心杯是扇形石英的，可以上下透光，離心機(jī)中裝有一個光學(xué)系統(tǒng)，在整個離心期間都能通過紫外吸收或折射率的變化監(jiān)測離心杯中沉降著的物質(zhì)，在預(yù)定的期間可以拍攝沉降物質(zhì)的照片，在分析離心杯中物質(zhì)沉降情況時，在重顆粒和輕顆粒之間形成的界面就像一個折射的透鏡，結(jié)果在檢測系統(tǒng)的照像底板上產(chǎn)生了一個“峰”，由于沉降不斷進(jìn)行，界面向前推進(jìn)，因此峰也移動，從峰移動的速度可以計算出樣品顆粒的沉降速度。分析性超速離心機(jī)和主要特點就是能在短時間內(nèi)，用少量樣品就可以得到一些重要信息，能夠確定生物大分子是否存在，其大致的含量，計算生物大分子的沉降系數(shù)，結(jié)合界面擴(kuò)散，估計分子的大小，檢測分子的不均一性及混合物中各組份的比例，測定生物大分子的分子量，還可以檢測生物大分子的構(gòu)象變化等。 5.3 制備性超速離心的分離方法：1. 差速沉降離心法： 這是最普通的離心法。即采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進(jìn)行離心，使沉降速度不同的顆粒，在不同的離心速度及不同離心時間下分批分離的方法。此法一般用于分離沉降系數(shù)相差較大的顆粒。差速離心首先要選擇好顆粒沉降所需的離心力和離心時間。當(dāng)以一定的離心力在一定的離心時間內(nèi)進(jìn)行離心時，在離心管底部就會得到最大和最重顆粒的沉淀，分出的上清液在加大轉(zhuǎn)速下再進(jìn)行離心，又得到第二部分較大較重顆粒的沉淀及含較小和較輕顆粒的上清液，如此多次離心處理，即能把液體中的不同顆粒較好地分離開。此法所得的沉淀是不均一的，仍雜有其它成分，需經(jīng)過23次的再懸浮和再離心，才能得到較純的顆粒。此法主要由于組織勻漿液中分離細(xì)胞器和病毒，其優(yōu)點是：操作簡易，離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開，并可使用容量較大的角式轉(zhuǎn)子。缺點是：須多次離心，沉淀中有夾帶，分離效果差，不能一次得到純顆粒，沉淀于管底的顆粒受擠壓，容易變性失活。2. 密度梯度區(qū)帶離心法（簡稱區(qū)帶離心法）：區(qū)帶離心法是將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。此法的優(yōu)點是：分離效果好，可一次獲得較純顆粒；適應(yīng)范圍廣，能象差速離心法一樣分離具有沉降系數(shù)差的顆粒，又能分離有一定浮力密度差的顆粒；顆粒不會擠壓變形，能保持顆?；钚裕⒎乐挂研纬傻膮^(qū)帶由于對流而引起混合。此法的缺點是：離心時間較長；需要制備惰性梯度介質(zhì)溶液；操作嚴(yán)格，不易掌握。密度梯度區(qū)帶離心法又可分為兩種：（1）差速區(qū)帶離心法：當(dāng)不同的顆粒間存在沉降速度差時（不需要像差速沉降離心法所要求的那樣大的沉降系數(shù)差）。在一定的離心力作用下，顆粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介質(zhì)的不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法稱為差速區(qū)帶離心法。此法僅用于分離有一定沉降系數(shù)差的顆粒（20% 的沉降系數(shù)差或更少）或分子量相差3倍的蛋白質(zhì)，與顆粒的密度無關(guān)，大小相同，密度不同的顆粒（如線粒體，溶酶體等）不能用此法分離。離心管先裝好密度梯度介質(zhì)溶液，樣品液加在梯度介質(zhì)的液面上，離心時，由于離心力的作用，顆粒離開原樣品層，按不同沉降速度向管底沉降，離心一定時間后，沉降的顆粒逐漸分開，最后形成一系列界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶，沉降系數(shù)越大，往下沉降越快，所呈現(xiàn)的區(qū)帶也越低，離心必須在沉降最快的大顆粒到達(dá)管底前結(jié)束，樣品顆粒的密度要大于梯度介質(zhì)的密度。梯度介質(zhì)通常用蔗糖溶液，其最大密度和濃度可達(dá)1.28 kg/cm3和60。此離心法的關(guān)鍵是選擇合適的離心轉(zhuǎn)速和時間（2）等密度區(qū)帶離心法：離心管中預(yù)先放置好梯度介質(zhì)，樣品加在梯度液面上，或樣品預(yù)先與梯度介質(zhì)溶液混合后裝入離心管，通過離心形成梯度，這就是預(yù)形成梯度和離心形成梯度的等密度區(qū)帶離心產(chǎn)生梯度的二種方式。離心時，樣品的不同顆粒向上浮起，一直移動到與它們的密度相等的等密度點的特定梯度位置上，形成幾條不同的區(qū)帶，這就是等密度離心法。體系到達(dá)平衡狀態(tài)后，再延長離心時間和提高轉(zhuǎn)速已無意義，處于等密度點上的樣品顆粒的區(qū)帶形狀和位置均不再受離心時間所影響，提高轉(zhuǎn)速可以縮短達(dá)到平衡的時間，離心所需時間以最小顆粒到達(dá)等密度點（即平衡點）的時間為基準(zhǔn)，有時長達(dá)數(shù)日。等密度離心法的分離效率取決于樣品顆粒的浮力密度差，密度差越大，分離效果越好，與顆粒大小和形狀無關(guān)，但大小和形狀決定著達(dá)到平衡的速度、時間和區(qū)帶寬度。等密度區(qū)帶離心法所用的梯度介質(zhì)通常為氯化絕CSCl，其密度可達(dá)1.7 g/cm3。此法可分離核酸、亞細(xì)胞器等，也可以分離復(fù)合蛋白質(zhì)，但簡單蛋白質(zhì)不適用。收集區(qū)帶的方法有許多種，例如：（1） 用注射器和滴管由離心管上部吸出。（2） 有針刺穿離心管底部滴出。（3） 用針刺穿離心管區(qū)帶部份的管壁，把樣品區(qū)帶抽出。（4）用一根細(xì)管插入離心管底，泵入超過梯度介質(zhì)最大密度的取代液，將樣品和梯度介質(zhì)壓出，用自動部分收集器收集。 5.4 離心操作的注意事項：高速與超速離心機(jī)是生化實驗教學(xué)和生化科研的重要精密設(shè)備，因其轉(zhuǎn)速高，產(chǎn)生的離心力大，使用不當(dāng)或缺乏定期的檢修和保養(yǎng)，都可能發(fā)生嚴(yán)重事故，因此使用離心機(jī)時都必須嚴(yán)格遵守操作規(guī)程。1. 使用各種離心機(jī)時，必須事先在天平上精密地平衡離心管和其內(nèi)容物，平衡時重量之差不得超過各個離心機(jī)說明書上所規(guī)定的范圍，每個離心機(jī)不同的轉(zhuǎn)頭有各自的允許差值，轉(zhuǎn)頭中絕對不能裝載單數(shù)的管子，當(dāng)轉(zhuǎn)頭只是部分裝載時，管子必須互相對稱地放在轉(zhuǎn)頭中，以便使負(fù)載均勻地分布在轉(zhuǎn)頭的周圍。2. 裝載溶液時，要根據(jù)各種離心機(jī)的具體操作說明進(jìn)行，根據(jù)待離心液體的性質(zhì)及體積選用適合的離心管，有的離心管無蓋，液體不得裝得過多，以防離心時甩出，造成轉(zhuǎn)頭不平衡、生銹或被腐蝕，而制備性超速離心機(jī)的離心管，則常常要求必須將液體裝滿，以免離心時塑料離心管的上部凹陷變形。每次使用后，必須仔細(xì)檢查轉(zhuǎn)頭，及時清洗、擦干，轉(zhuǎn)頭是離心機(jī)中須重點保護(hù)的部件，搬動時要小心，不能碰撞，避免造成傷痕，轉(zhuǎn)頭長時間不用時，要涂上一層上光臘保護(hù)，嚴(yán)禁使用顯著變形、損傷或老化的離心管。3. 若要在低于室溫的溫度下離心時。轉(zhuǎn)頭在使用前應(yīng)放置在冰箱或置于離心機(jī)的轉(zhuǎn)頭室內(nèi)預(yù)冷。4. 離心過程中不得隨意離開，應(yīng)隨時觀察離心機(jī)上的儀表是否正常工作，如有異常的聲音應(yīng)立即停機(jī)檢查，及時排除故障。5. 每個轉(zhuǎn)頭各有其最高允許轉(zhuǎn)速和使用累積限時，使用轉(zhuǎn)頭時要查閱說明書，不得過速使用。每一轉(zhuǎn)頭都要有一份使用檔案，記錄累積的使用時間，若超過了該轉(zhuǎn)頭的最高使用限時，則須按規(guī)定降速使用。 6 分光光度技術(shù)6.1 基本原理利用紫外光、可見光、紅外光和激光等測定物質(zhì)的吸收光譜，利用此吸收光譜對物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析和物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的方法，稱為分光光度法或分光光度技術(shù)，使用的儀器稱為分光光度計，這種分光光度計靈敏度高，測定速度快，應(yīng)用范圍廣，其中的紫外/可見分光光度技術(shù)更是生物化學(xué)研究工作中必不可少的基本手段之一。因此本章重點討論紫外/可見分光光度法的基本原理、儀器構(gòu)造及其在生化領(lǐng)域中的應(yīng)用等。1. 光譜：光是電磁波，可用波長“”表示，電磁波譜是由不同性質(zhì)的連續(xù)波長的光譜所組成，對于生物化學(xué)來說，最重要的波長區(qū)域是可見光和紫外光。光的波長是二個相鄰的波峰之間的距離。光的傳播是由相互垂直的電場分量“E”和磁場分量“H”所構(gòu)成。 C/波長 C光速 頻率，單位時間通過一個定點的波數(shù)。光又可以看作是由具有能量的粒子所組成。這些粒子所具有的原能量“E”由下式算出：EhH普朗克常數(shù)（ 6.62410-27爾格秒）頻率紫外區(qū)可分為紫外（近紫外）和真空紫外（遠(yuǎn)紫外）。由于吸收池（又稱樣品池、比色杯等）和光學(xué)元件以及氧氣能吸收小于190nm波長的光，因此常規(guī)紫外測定集中在近紫外區(qū)，即 200nm400nm?？梢姽鈪^(qū)為400nm800nm。組成物質(zhì)的分子均處于一定能態(tài)并不停地運動著，分子的運動可分為平動、轉(zhuǎn)動、振動和分子內(nèi)電子的運動，每種運動狀態(tài)都處于一定的能級，因此分子的能量可以寫成：EE0+E平+E轉(zhuǎn)+E振+E電E0是分子內(nèi)在的不隨分子運動而改變的能量，平動能E平只是溫度的函數(shù)，因此與光譜有關(guān)的能量變化是分子的轉(zhuǎn)動能量、振動能量和分子的電子能量。分子的每一種能量都有一系列的能級，能級不是任意的，而是具有量子化特征的，通常分子處于基態(tài)，當(dāng)它吸收一定能量躍遷到激發(fā)態(tài)，則產(chǎn)生吸收光譜。分子轉(zhuǎn)動、振動和電子能級的躍遷，相應(yīng)地產(chǎn)生轉(zhuǎn)動、振動及電子光譜。按照量子力學(xué)原理，分子能態(tài)按一定的規(guī)律跳躍式地變化，物質(zhì)在入射光的照射下，分子吸收光時，其能量的增加是不連續(xù)的，物質(zhì)只能吸收一定能量的光，吸收光的頻率和兩個能級間的能量差要符合下列關(guān)系：EE2- E1hE1、E2分別表示初能態(tài)和終能態(tài)的能量，初能態(tài)與終能態(tài)之間的能量差愈大，則所吸收的光的頻率愈高（即波長愈短），反之則所吸收的光的頻率愈低（即波長愈長）。由于吸收是不連續(xù)的，因此在光的一定部位出現(xiàn)一系列吸收暗帶。因為分子轉(zhuǎn)動、振動及電子能級躍遷的能量差別較大，因此，它們的吸收光譜出現(xiàn)在不同的光譜區(qū)域。分子轉(zhuǎn)動能級級差小，E0.05電子伏特（ev），分子轉(zhuǎn)動光譜的吸收出現(xiàn)在遠(yuǎn)紅外或微波區(qū)。振動能級縱間的差別較大， E0.051.0 ev，振動光譜出現(xiàn)在中紅外區(qū)。電子能級的級差更大， E120 ev，所以由電子躍遷得到的光譜出現(xiàn)在可見、紫外或波長更短的光譜區(qū)?？梢姽?、紫外光吸收光譜，是由于分子中聯(lián)系較松散的價電子被激發(fā)產(chǎn)生躍遷從而吸收光輻射能量形成的，即分子由基態(tài)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，電子由一個低能級的軌道（即成鍵軌道），吸收了光能量躍遷到高能級軌道（稱為反鍵軌道）。與吸收光譜有關(guān)的三種電子是： 二個原子的電子沿其對稱方向相互形成的共價鍵（即單鍵），稱 鍵， 構(gòu)成 鍵的電子稱 電子，如CC、CH鍵。 平行于二個原子軌道形成的價鍵（即雙鍵），稱 鍵，形成鍵的電子稱為 電子，如C=C鍵。 未共享成鍵的電子，稱n電子。各種電子躍遷所需能量大小的順序是：n* n*紫外吸收光譜主要是由于雙鍵電子，尤其是共軛雙鍵中的電子和未共享的電子對的激發(fā)所產(chǎn)生的。所以各種物質(zhì)分子對紫外光的吸光性質(zhì)取決于該分子的雙鍵數(shù)目和未共享電子對的共軛情況等。如下表所示： 電子躍遷類型與紫外吸收波長(nm)關(guān)系表電子躍遷類型 例 子紫外吸收波長范圍* CH 100150 nm *( 非共軛 ) CO 200 nm *( 共軛 ) CC 200300 nm n* CO 300 nm *躍遷：此類躍遷所需能量較小，吸收波長在紫外區(qū)的200300 nm，不飽和烴、共軛烯烴及芳香烴均可發(fā)生這類躍遷，氨基酸、蛋白質(zhì)與核酸均含有大量共軛雙鍵，因而200300 nm的紫外吸收測定，在生化實驗技術(shù)中有極廣泛的用途。若逐漸改變照射某物質(zhì)的入射光的波長，并測定物質(zhì)對各種波長光的吸收程度（吸光度“A”或光密度“O.D”）或透射程度（透光度“T”），以波長作橫坐標(biāo)，“A”或“T”為縱座標(biāo)，畫出連續(xù)的“A”或“T”曲線，即為該物質(zhì)的吸收光譜曲線。吸光度 A D C B max min 波長(nm) 由上圖可以看出吸收光譜的特征：曲線上“A”處稱最大吸收峰，它所對應(yīng)的波長稱最大吸收波長，以max表示。曲線上“B”處有一谷，稱最小吸收，它所對應(yīng)的波長，所對應(yīng)的波長，稱最小吸收波長，以min 表示。曲線上在最大吸收峰旁邊有一小峰“C”，稱肩峰。在吸收曲線的波長最短的一端，曲線上“D”處，吸收相當(dāng)強(qiáng)，但不成峰形，此處稱為末端吸收。max是化合物中電子能級躍遷時吸收的特征波長，不同物質(zhì)有不同的最大吸收峰，所以它對鑒定化合物極為重要。吸收光譜中，max、min、肩峰以及整個吸收光譜的形狀決定于物質(zhì)的性質(zhì)，其特征隨物質(zhì)的結(jié)構(gòu)而異，所以是物質(zhì)定性的依據(jù)。測定某物質(zhì)的紫外吸收光譜的曲線，可與已知標(biāo)準(zhǔn)的紫外光譜圖相對照，對照時須注意測定的條件，如溶劑、濃度等。常用標(biāo)準(zhǔn)的紫處吸收光譜是薩德勒研究實驗公司編制的“Sadtler”紫外標(biāo)準(zhǔn)圖譜集，到七十年代末為止已收集28585個化合物紫外光譜圖，此外還有藥物和非極性溶劑紫外光譜圖2000多幅。由于化合物紫外吸收峰較少，而且峰形都很寬，不象紅外光譜是許多指紋峰，所以在用紫外吸收光譜進(jìn)行化合物定性鑒定時，應(yīng)注意：化合物相同，其紫外光譜應(yīng)完全相同；但是紫外光譜相同不一定化合物就相同，可能僅是存在某些相同的發(fā)色團(tuán)或基團(tuán)，因此在鑒定時應(yīng)與紅外光譜相結(jié)合。由于電子躍遷的同時也引起分子的轉(zhuǎn)動和振動光譜，要把電子躍遷和分子振動、轉(zhuǎn)動的躍遷完全分開是不可能的，因此我們常見的紫外吸收光譜是由一個或幾個寬的吸收譜帶所組成。紫外光譜中常用的術(shù)語有發(fā)色團(tuán)、助色團(tuán)、增色效應(yīng)和減色效應(yīng)。發(fā)色團(tuán)：凡是與飽和碳?xì)浠衔镞B接能引起n*、*、 n* 等電子躍遷的基團(tuán)稱為發(fā)色團(tuán)。例如：CC、CO等發(fā)色團(tuán)。助色團(tuán)：助色團(tuán)是一些具有非共價鍵的基團(tuán)（如OH、NH2、SH等）。這些基團(tuán)在波長200 nm處沒有吸收，當(dāng)它與發(fā)色團(tuán)相連接時，使發(fā)色團(tuán)的吸收帶向長波移動，稱為紅移（或淺色效應(yīng)），紅移的同時吸收帶的強(qiáng)度增加。若助色團(tuán)與發(fā)色團(tuán)相連接，產(chǎn)生 n* 躍遷，使吸收波長向短波移動，稱為蘭移（或深色效應(yīng)）。增色效應(yīng)（hyperchromic effect）:核酸變性或降解，使得DNA或RNA溶液對紫外光的吸收明顯增加，即 值（吸光系數(shù)或稱消光系數(shù)）顯著升高，此現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。此效應(yīng)是由于堿基之間電子相互作用的改變所致，通常在260nm處測量。減色效應(yīng)（hypochromic effect）:在一定的條件下，變性的核酸又可以復(fù)性，此時值又明顯減少，回復(fù)到原來的核酸分子值較低的水平，即此時DNA或RNA溶液的紫外光吸收顯著降低，此現(xiàn)象稱為減色效應(yīng)，此效應(yīng)也是由于堿基之間電子相互作用的變化所引起的，通常在260nm條件下測量。2. 光吸收定律：朗伯比爾（Lambertbeer）光吸收定律： AlgTb cA吸光度，又稱光密度“O.D”。T透光度， TI / I。， I。為照射到吸收池上的光強(qiáng)，I為透過吸收池的光強(qiáng)。摩爾吸光系數(shù)或克分子吸光系數(shù)（Lmol1cm1）。b樣品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收地，b=1cm。C樣品濃度（mol/L）。由上式可以看出：吸光度A與物質(zhì)的吸光系數(shù)“”和物質(zhì)的濃度“C”成正比。摩爾吸光系數(shù)： ， 是物質(zhì)對某波長的光的吸收能力的量度。越大，吸收光的能力越強(qiáng)，相應(yīng)的分光度法測定的靈敏度就越高。值越大，說明電子躍遷的幾率大，通常 10105：一般認(rèn)為 104為強(qiáng)吸收；103104 為較強(qiáng)吸收； 102 為弱吸收，此時分光光度法不靈敏。因為通常使用分光光度計可檢測出的最小吸光度A0.001, 所以，當(dāng)b1cm, 105時，可檢測的溶液最小濃度是C10-8 mol/L。常用的吸光系數(shù)還有一種百分吸光系數(shù)，即在某一波長下，溶液濃度為1%（W / V），液層厚度b1cm時的吸光度，以E1%max表示。C百分濃度（W / V）。L液層厚度，吸收杯光徑長度。 A吸光度。最大吸收波長max時的 和E1%max值可用下式換算： E1%max分子量 / 10吸光度“A”有一個重要性質(zhì)是其具有加和性：A1C1b12C2b23C3b3即混合物的總吸光度等于溶液中的各組份各自在該波長下吸光度的算術(shù)和。這是多元混合物分光光度法定量分析的基礎(chǔ)。若溶液中各溶質(zhì)的吸光系數(shù)相同，則各溶質(zhì)吸光度的大小與溶質(zhì)濃度成比例。例如，離子交換柱層析分離核苷酸實驗中可利用吸光度計算回收率：mCV ， ， m溶質(zhì)的量 C溶質(zhì)濃度V溶液體積 A吸光度吸光系數(shù) b吸收池光徑 回收率（100%） （上式中假設(shè)總和各核苷酸的近似相等）例一：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池測定 260nm處的吸光度為0.650，用同一吸收池測定純?nèi)軇┑奈舛葹?.070，計算尿嘧啶溶液的摩爾濃度，已知其摩爾吸光系數(shù) = 8.2103 M1cm1（Mmol / L）。 A bC A（溶劑加樣品的吸光度）（溶劑的吸光度） A0.6500.0700.580 b1cm C=7.1105 mol / L 例二：1%（W/V，10 mg / ml）酪氨酸酶溶液的吸光度為24.9（1cm吸收池，280nm），計算A280=0.250的酪氨酸酶溶液的濃度。由于這兩種酶溶液的百分吸光系數(shù)“E1%1cm，280nm”是相同的，因此可用正比例法計算濃度。 C未知0.010.1mg / ml6.2 分光光度計的組成和構(gòu)造：1. 組成：各種型號的紫外/可見分光度計，不論是何種型式，基本上都由五部分組成：（1）光源；（2）單色器（包括產(chǎn)生平行光和把光引向檢測器的光學(xué)系統(tǒng)）；（3）樣品室；（4）接收檢測放大系統(tǒng)；（5）顯示或記錄器。光 源 單色器 樣品室 檢測放大系統(tǒng) 顯示器國產(chǎn)分光光度計近年來已有很大的發(fā)展，各種檔次的分光光度計都已更新升級換代，可見光系列有：721、722、723等型號，紫外/可見光系列有：751、752、753、754、756等型號，主要生產(chǎn)廠為上海分析儀器總廠等。我系1985年購買的瑞士KONTRON康強(qiáng)公司生產(chǎn)的UNICON 860型紫/可見光分光光度計，是雙光束、快速自動掃描、熒屏顯示的高檔分光光度計。這種雙光束分光光度計的特點是來自光源的連續(xù)光譜經(jīng)凹面全息光柵分光后，由出射狹縫得到單色光，經(jīng)過由電機(jī)帶動的25周/秒左右的旋轉(zhuǎn)鏡分解為“樣品”、“參比”光束，順序分時通過參比池和樣品吸收池，照射到光電倍增管上，由于兩條光路是幾乎同時測量，參比信號又不斷與標(biāo)準(zhǔn)電壓比較，使參比信號恒定，所以由光源、單色器、外界雜光、光電倍增管以及電源電壓等帶來的影響，儀器均能自動消除。最快波長掃描速度為1200nm/min，有五種測量功能和五種數(shù)據(jù)處理功能。我系2000年購買的德國耶拿（蔡司）公司生產(chǎn)的SPECORD 200型高檔紫外/可見光分光光度計的光路原理圖如下：SPECORD 200分光光度計的樣品和參比光路，分別有各自的帶溫控的光電二極管檢測器，因而取消了電機(jī)帶動的旋轉(zhuǎn)鏡，大大提高了儀器的穩(wěn)定性及各項檢測指標(biāo)，其波長范圍是190nm1100nm，吸光度測定范圍是03A，可變狹縫寬度為1nm、2nm和5nm，儀器使用微機(jī)控制時，掃描速度最高可達(dá)6000nm/min，寬大的樣品室可以安裝各種附件，儀器性能優(yōu)良，適合教學(xué)、科研使用。該儀器的使用說明詳見附錄。2. 構(gòu)造： 光源：理想光源的條件是：能提供連續(xù)的輻射；光強(qiáng)度足夠大；在整個光譜區(qū)內(nèi)光譜強(qiáng)度不隨波長有明顯變化；光譜范圍寬；使用壽命長，價格低。用于可見光和近紅外光區(qū)的光源是鎢燈，現(xiàn)在最常用的是鹵鎢燈（Halogen lamp），即石英鎢燈泡中充以鹵素，以提高鎢燈的壽命。適用波長范圍是3201100nm。由于能量輸出的波動為電壓波動的四次方倍，因此電源電壓必須穩(wěn)定。用于紫外光區(qū)的是氘燈（Deuterium lamp），適用波長范圍是195400nm，由于氘燈壽命有限，國產(chǎn)氘燈壽命僅五百小時左右，要注意節(jié)約燈時。 單色器：單色器是分光光度計的心臟部分，它的作用是把來自光源的混合光分解為單色光并能隨意改變波長。它的主要組成部件和作用是：入射狹縫限制雜散光進(jìn)入。色散元件即棱鏡或光柵，是核心部件，可將混合光分解為單色光。準(zhǔn)直鏡把來自入射狹縫的光束轉(zhuǎn)化為平等光，并把來自色散元件的平等光聚焦于出射狹縫上。 出射狹縫只讓額定波長的光射出單色器。轉(zhuǎn)動棱鏡或光柵的波長盤，可以改變單色器出射光束的波長；調(diào)節(jié)出入射狹縫隙的寬度，可以改變出射光束的帶寬和單色光的純度。光柵：光柵有透射光柵和反射光柵，實際應(yīng)用的都是反射光柵，它又可分為平面反射光柵（即通稱的反射光柵或閃爍光柵）和凹面反射光柵兩類，凹面反射光柵可以起色散元件和準(zhǔn)直鏡兩個作用，使色散后的光束聚焦于出射狹縫，得到銳線光譜。光柵的刻制方法有兩種：機(jī)刻光柵：用金剛刀擠壓鍍于硬質(zhì)玻璃上0.51的鋁反射層而得。刻制工作量極大，一般每分鐘只能刻10條線，刻100mm寬的600線/mm的光柵要100小時。最多刻到3600線/mm。由于其制造周期長，成本高，一般只能制得少量的母光柵，而實際應(yīng)用的多是復(fù)制光柵，即在母光柵上涂上硅油，再鍍上一層鋁，用環(huán)氧樹脂粘下來，就得到復(fù)制光柵。機(jī)刻光柵的缺點是線槽稍有缺陷時就會出現(xiàn)“鬼線”，即位于光譜強(qiáng)線兩側(cè)的模糊不清的假線。 全息光柵：用全息照相法刻制的高精度光柵。即用高強(qiáng)度的相干性極好的單色光，如激光，用高分辨的感光材料光致抗蝕劑記錄干涉條紋，曝光1小時，化學(xué)處理掉受光部分，再進(jìn)行真空鍍膜（鍍鋁），得到全息反射光柵。這種光柵幾乎沒有線槽間的周期誤差，幾乎沒有“鬼線”，雜散光很少。最大線槽密度可達(dá)6500線/mm，最大直徑可達(dá)400mm，刻線越多，分辨率就越高，最常用的是12001500線/mm的全息光柵。狹縫、光譜頻帶寬度和分辨率：出射狹縫的寬度通常有兩種表示方法：一為狹縫的實際寬度，以毫米（mm）表示，另一種為光譜頻帶寬度，即指由出射狹縫射出光束的光譜寬度，以毫微米nm表示。例如，出射狹縫的寬度是6nm，并不是說出射狹縫的寬度是6nm，而是指由此狹縫射出的光具有6nm的光譜帶寬。純粹的單色光只是一種理想情況，分光光度計所能得到的“單色光”，實際上只是具有一定波長范圍的譜帶，狹縫越寬，所包括的波長范圍也愈寬。 對單色光純度來說，狹縫是愈窄愈好，但光的強(qiáng)度也就越弱，因此狹縫不能無限制地小，狹縫的最小寬度取決于檢測器能準(zhǔn)確地進(jìn)行測量的最小光能量。目前達(dá)到的最小寬度為0.1nm。光譜有效頻帶寬度“b”是檢測器檢測到的光能量為峰值一半處的二點間的波長間隔，如下圖所示： 光強(qiáng)度 Pb 光譜有效頻帶寬（nm）b 狹縫寬度（mm） 1/2h 線色散率 b 光譜有效頻帶寬b d波長差 1/2hdS出射狹縫平面上二條 波長 光線（d）所分開的距離（mm） 由上式可以看出，b與b成正比， 與線色散率成反比。線色散率越大，則可得到的有效頻帶寬度越小。 光譜有效頻帶寬度檢查方法如下： 用鈉光燈照明，在被測狹縫后測納雙線的光譜，并記錄和測量放大了的納雙線光譜圖。 589.6 nm 589.0 nm 75cm 5 cm 半峰寬 b 因為光譜圖由“nm”放大為“cm”，比例應(yīng)不變： d589.6589.00.6 (nm) b0.65750.04 (nm)分辨率：是儀器對相鄰的兩個峰可分辨的最小波長間隔，是儀器分辨鄰近二條譜線的能力。分辨率 ： 例如若可分開鈉雙線：則 高的分辨率可達(dá)：R=105。所以，狹縫寬度b越小，光譜帶寬b越小，分辨率就越高。何種情況算是能夠分辨：定義為二條譜線的峰與谷處于同一位置時，此二個峰認(rèn)為是剛好能分辨。由于光柵分光其色散是線性的，所以只用一種狹縫寬度對各種波長的光的測量，其分辨率都相同，即狹縫寬度不必經(jīng)常調(diào)節(jié)。只要光強(qiáng)能達(dá)到要求，應(yīng)使用盡可能小的狹縫寬度，以提高分辨率。 樣品室：包括有池架、吸收池（即比色杯）、以及各種可更換的附件。池架有普通池架和恒溫池架，恒溫池架有水恒溫池架和電恒溫池架。水恒溫池架需用循環(huán)水恒溫裝置打入循環(huán)水保持池架恒溫，控溫精度為 0.1，電恒溫池架十分昂貴，控溫精度可達(dá) 0.05。吸收池有光學(xué)玻璃杯和石英玻璃杯兩種。光學(xué)玻璃杯因為普通光學(xué)玻璃吸收紫外光，因此只能用于可見光，適用波長范圍是400nm2000nm。石英玻璃杯可透過紫外光、可見光和紅外光， 是最常使用的吸收池，使用波長范圍是180nm3000nm。吸收池的形狀有長方形，方形和園筒形，光程可由0.1cm至10cm，最常用的是1cm池（容積3ml），光程要求極精確，透光的玻璃面要嚴(yán)格垂直于光路，有的石英杯上方刻有箭頭“”，標(biāo)明杯子使用時的透光方向，反方向使用會有偏差。有各種用途的石英吸收池：如液體池