生化實(shí)驗(yàn)論文

小鼠肝臟過(guò)氧化氫酶 的 制備與測(cè)定 小組成員 李 朋 10011140010 邱方洲 10011140016 武 浩 10011140020 謝 黎 10011140022 2010 級(jí)一大班法醫(yī) 2012 年 1 月 3 日 小鼠肝臟過(guò)氧化氫酶的制備與測(cè)定 過(guò)氧化氫酶 Catalase 是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的氧化還原酶 尤其在動(dòng)物的肝臟 腎臟 紅細(xì)胞中含量較多 其生物學(xué)功能是催化細(xì)胞內(nèi) H2O2 分解 防止過(guò)多 H2O2 對(duì)細(xì) 胞的危害 人工制備的過(guò)氧化氫酶可廣泛應(yīng)用于食品與乳制品業(yè) 造紙與印染業(yè) 農(nóng)業(yè)與 環(huán)保業(yè) 以及醫(yī)療衛(wèi)生業(yè)等多領(lǐng)域 小鼠肝臟過(guò)氧化氫酶分子量約為 238KD 結(jié)構(gòu)上由 4 個(gè)具有相同多肽鏈的亞基組成 是以 鐵卟啉為輔基的結(jié)合酶 在 407nm 波長(zhǎng)下有特征性的吸收 溶于水 幾乎不溶于乙醇 氯仿 乙醚等有機(jī)試劑 酸性環(huán)境下溶解度低易析出 最適溫度為 37 最適 pH 值約為 7 8 本 實(shí)驗(yàn)以小鼠肝臟為原料 根據(jù)過(guò)氧化氫酶溶解性和大分子等特性 通過(guò)組織勻漿 鹽析 透析 分子篩層析等步驟 提取純化過(guò)氧化氫酶 并對(duì)制備的過(guò)氧化氫酶進(jìn)行蛋白濃度 分子量 米氏常數(shù)等測(cè)定 小鼠肝臟過(guò)氧化氫酶的制備與測(cè)定小鼠肝臟過(guò)氧化氫酶的制備與測(cè)定 實(shí)驗(yàn)方案實(shí)驗(yàn)方案 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?熟悉并掌握生化四大技術(shù) 離心 層析 比色 電泳 熟悉并掌握分離純化小鼠過(guò)氧化氫酶和測(cè)定其含量的技術(shù)和方法 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 勻漿原理 勻漿原理 分離純化某一種蛋白質(zhì)時(shí) 首先要把蛋白質(zhì)從組織或細(xì)胞中釋放出來(lái)并保持原 來(lái)的天然狀態(tài) 不喪失活性 所以要根據(jù)所提取蛋白質(zhì)的性質(zhì)采用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì) 胞破碎 過(guò)氧化氫酶在乙醇 氯仿等有機(jī)溶劑中溶解度很小 而脂質(zhì)在有機(jī)溶劑中溶解度 較大 通過(guò)加入有機(jī)溶劑可實(shí)現(xiàn)過(guò)氧化氫酶與脂質(zhì)的分離 過(guò)氧化氫酶在乙醇 氯仿等有機(jī) 溶劑中穩(wěn)定性好 不易變性 而某些雜蛋白在有機(jī)溶劑中穩(wěn)定性差 容易變性 根據(jù)上述 制備過(guò)氧化氫酶 勻漿 鹽析 透析 過(guò)氧化氫酶測(cè)定 米氏常數(shù)值測(cè)定 Lineweaver Burk雙倒數(shù)作圖法 蛋白含量測(cè)定 lowry法 純度及分子量測(cè)定 SDS PAGE 層析 制備過(guò)氧化氫酶 勻漿 鹽析 透析 過(guò)氧化氫酶測(cè)定 米氏常數(shù)值測(cè)定 Lineweaver Burk雙倒數(shù)作圖法 蛋白含量測(cè)定 lowry法 純度及分子量測(cè)定 SDS PAGE 米氏常數(shù)值測(cè)定 Lineweaver Burk雙倒數(shù)作圖法 蛋白含量測(cè)定 lowry法 純度及分子量測(cè)定 SDS PAGE 層析 原理選擇 0 05mol L pH4 0 醋酸 乙醇緩沖液以及氯仿作為勻漿緩沖液 通過(guò)勻漿法破碎肝 組織細(xì)胞 勻漿液離心后脂質(zhì)分配到有機(jī)相中 部分雜蛋白則沉淀下來(lái) 而過(guò)氧化氫酶主 要存在于上清液中 分離出上清液即獲得過(guò)氧化氫酶的粗提液 鹽析原理 鹽析原理 蛋白質(zhì)在高濃度鹽溶液中由于水化膜被破壞而溶解度降低 通過(guò)向過(guò)氧化氫酶 粗提液中加入適當(dāng)濃度的中性鹽 使過(guò)氧化氫酶呈鹽析狀態(tài) 而部分雜蛋白呈鹽溶狀態(tài) 離心 后過(guò)氧化氫酶主要存在于沉淀中 棄去上清收集沉淀 即可實(shí)現(xiàn)過(guò)氧化氫酶與部分雜蛋白 的分離 透析原理 透析原理 采用 20 乙醇 0 1mol L pH4 7 醋酸緩沖液 0 1mol L NaCl 溶液為透析液 對(duì) 產(chǎn)物進(jìn)行透析處理 在該透析條件下 過(guò)氧化氫酶溶解度變小 以沉淀形式析出 但不變 性 透析過(guò)夜后離心 過(guò)氧化氫酶主要存在于沉淀中 但沉淀中也可能含有少量變性的雜 蛋白 選擇 0 1mol L pH7 8 磷酸緩沖液復(fù)溶沉淀 則過(guò)氧化氫酶溶解 而變性的雜蛋白不 能溶解 從而實(shí)現(xiàn)過(guò)氧化氫酶與部分雜蛋白的分離 層析原理 層析原理 凝膠層析法主要根據(jù)混合物中分子大小不同的各種物質(zhì) 隨流動(dòng)相流經(jīng)作為固 定相的凝膠層析柱時(shí) 各種物質(zhì)分子擴(kuò)散移動(dòng)速度不同使混合物中各種物質(zhì)得到分離的技 術(shù) 采用 sephadexG 200 葡聚糖凝膠層析柱可以實(shí)現(xiàn)過(guò)氧化氫酶與其他分子量雜蛋白的分 離 通過(guò)監(jiān)測(cè)洗脫液在 407nm 過(guò)氧化氫酶特征性吸收波長(zhǎng) 和 280nm 波長(zhǎng)下的光吸收值 變化 合并收集 OD407nm 和 OD280nm 重疊峰值管 即可獲得純化后的過(guò)氧化氫酶 米氏常數(shù)測(cè)定原理 米氏常數(shù)測(cè)定原理 底物濃度與反應(yīng)速率之間的關(guān)系可用 V 表示 圖形為矩形 max SK SV m 雙曲線(xiàn)如下 將此式取倒數(shù)可得 以和作圖可得一直線(xiàn) 1 max SV SK V m V 1 1 S 由圖可知該直線(xiàn)與橫軸的截距為 找出一系列的點(diǎn) 將點(diǎn)還原為直線(xiàn) 即可求出 Km m K 1 點(diǎn)的取法 設(shè)置不同的底物濃度 加入酶的量相同 反應(yīng)相同的時(shí)間 找出反應(yīng)后過(guò)氧化 氫的量 分解的底物可以求得 用它來(lái)表示反應(yīng)速率 剩余的過(guò)氧化氫用高錳酸鉀滴定 2KMnO4 5H2O2 3H2SO4 2MnSO4 K2SO4 5O2 8H2O 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定原理 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定原理 蛋白質(zhì)中的酪氨酸等與酚試劑之磷鉬酸 磷鎢酸作用產(chǎn)生藍(lán)色化合 物 其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比 Lowry 法測(cè)定蛋白質(zhì)可分為兩個(gè)步驟 1 在堿性溶液中 蛋白質(zhì)與銅離子發(fā)生反應(yīng) Cu2 蛋白質(zhì) Cu 蛋白質(zhì) 2 Cu 蛋白質(zhì)使試劑中的磷鎢酸 磷鉬酸還原成為藍(lán)色化合物 測(cè)定光吸收值就可以推算出 蛋白質(zhì)的含量 試劑中的碳酸鈉有緩沖作用 使溶液的 pH 始終保持在 10 左右 顯色最深 福林 酚法的靈敏度高 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定范圍是 25 250 g ml 但此法實(shí)際上是蛋白質(zhì)中酪 氨酸和色氨酸等與試劑的反應(yīng) 因此他受蛋白質(zhì)氨基酸組成的影響 即不同蛋白質(zhì)中氨基 酸組成的不同會(huì)使顯色強(qiáng)度有所差別 此外 樣品中酚類(lèi)及檸檬酸的干擾會(huì)使結(jié)果偏高 低濃度的尿素 約 0 5 左右 胍 約 0 5 左右 硫酸鈉 1 硝酸鈉 1 三氯醋 酸 0 5 乙醇 5 丙酮 0 5 對(duì)顯色無(wú)影響 上述物質(zhì)濃度高時(shí)必須做校正曲線(xiàn) SDS PAGE 測(cè)定分子量原理測(cè)定分子量原理 在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉 SDS 則蛋白質(zhì)分子電泳的遷移率主要取決于分子量大小 Mr 而與本身所帶的電荷量和形 狀無(wú)關(guān) 具體公式 lgMW A B Rf 實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)步驟 一 組織勻漿法制備過(guò)氧化氫酶粗提液 1 頸椎脫臼處死 6 只小鼠 取肝臟約 6g 2 加入預(yù)冷勻漿緩沖液 51ml 用組織搗碎機(jī)勻漿 3min 取 200 L 勻漿液留樣放入冰 箱 20 保存 3 冰浴下緩慢加入 3ml 氯仿 再次勻漿 1min 勻漿液離心 4 7500rpm 30min 棄 沉淀 收獲上清液 44ml 于錐形瓶中 4 取勻漿上清液 120 L 加入 40 L 4 電泳上樣 Buffer 沸水浴 5min 備用于 SDS PAGE 檢測(cè) 20 保存 另取 200 L 勻漿后上清液 20 保存 二 鹽析與透析法初步純化過(guò)氧化氫酶 1 冰浴攪拌狀態(tài)下向肝臟勻漿上清液緩慢滴加 7mlNa2SO4 繼續(xù)用玻璃棒手動(dòng)冰浴攪 拌 1h 2 將鹽析溶液離心 4 7500rpm 10min 棄上清保留沉淀 3 用 24ml 磷酸緩沖液溶解沉淀 15min 離心 4 5000rpm 10min 棄沉淀保留上 清液 4 取鹽析后上清液 120 L 用 40 L 4 電泳上樣 Buffer 沸水浴 5min 備用于 SDS PAGE 檢測(cè) 20 保存 5 將透析袋至于沸水浴 5min 清洗晾涼后備用 6 將上清液放入透析袋中 置于透析液中兩周 中途更換一次透析液 7 兩周后取透析袋中渾濁溶液離心 4 7500rpm 10min 棄上清保留沉淀 8 用 3ml 磷酸緩沖液溶解沉淀 15min 離心 4 4000rpm 10min 棄沉淀保留上清 液 9 取上清液 120 L 用 40 L 4 電泳上樣 Buffer 制樣沸水浴 5min 備用于 SDS PAGE 檢測(cè) 于 20 保存 10 將透析袋至于沸水浴 5min 清洗晾涼后備用 11 將收獲的上清液放入處理后的透析袋中置于 75 的甘油中包埋濃縮 2h 待樣品濃 縮至 1 2ml 收樣 置于 20 保存 三 凝膠層析法進(jìn)一步純化過(guò)氧化氫酶 1 凝膠的處理 預(yù)先處理好 2 裝柱 取一支層析柱 于底部填塞薄棉 將層析柱垂直夾于鐵架臺(tái) 于柱中加入 緩沖液 5cm 使用前將凝膠混勻順玻璃棒緩慢注入柱中 待其自然下沉 凝膠床 至少 2 3 柱高 3 平衡 磷酸緩沖鹽溶液流洗 控制流速 5 10 滴 min 4 濃縮樣品 5 加樣 用吸管吸取待分離的濃縮液 1 2ml 在接近凝膠床表面處沿柱壁緩慢加入 6 洗脫 用磷酸鹽緩沖液保持流速 7 收集及檢測(cè) 樣品下降至底部 5cm 開(kāi)始用試管收集流出液 每管收集 2ml 收集管 依次在 407nm 和 280nm 波長(zhǎng)下測(cè)吸光度值 繪制洗脫曲線(xiàn) 如圖 如圖 1 8 收獲純化產(chǎn)物 收集 OD407nm 和 OD280nm 重疊峰值管 9 取 2ml 純化后存樣于 20 保存 備于蛋白質(zhì)濃度和 Km 值測(cè)定 10 取層析樣品 60 L 用 20 L 4 電泳上樣 Buffer 制樣 沸水浴 5min 備用于 SDS PAGE 檢測(cè) 于 20 保存 四 Lowry 法測(cè)定純化的過(guò)氧化氫酶濃度 1 選擇標(biāo)準(zhǔn)蛋白 選擇與待測(cè)樣品 層析后的純化樣品 相同或組成類(lèi)似的蛋白質(zhì)作 為標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液 2 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的配制 將標(biāo)準(zhǔn)蛋白經(jīng)凱氏定氮法準(zhǔn)確測(cè)定其蛋白質(zhì)含量 再用無(wú)離 子水配制成 0 1mg ml 的儲(chǔ)存液 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表 1 所示配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白組 編上號(hào)碼 以第一管為空白管 在分光光度計(jì)上測(cè)定 650nm 處的光密度值 4 以各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo) 各管的光密度值為縱坐標(biāo)作圖 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 如圖 如圖 2 5 測(cè)定樣品蛋白 取試管兩支 一支放 1ml 稀釋的層析后純化樣品和 1ml 試劑 AB 混 合液 另一支放 1ml 生理鹽水和 1ml 試劑 AB 混合液 兩者均混勻后在 50 水浴 保溫 10 分鐘 冷卻 再各加入試劑 C 3ml 立即混勻 置于 50 水浴中保溫 20 分 鐘 冷卻后測(cè)定 650nm 波長(zhǎng)處的光密度值 五 雙倒作圖法測(cè)定純化的過(guò)氧化氫酶米氏常數(shù) 1 稀釋勻漿后和層析后樣品各 1000 倍 5 L 5ml 2 過(guò)氧化氫的濃度再標(biāo)定 取清潔錐形瓶 2 支 各加 0 04mol L 的過(guò)氧化氫溶液 2 0ml 和 25 硫酸 2 0ml 分別用 0 002mol L 高錳酸鉀滴定至微紅 記錄滴定毫升數(shù)去 平均值 計(jì)算過(guò)氧化氫的摩爾濃度 3 反應(yīng)測(cè)速 取干燥的 50ml 錐形瓶 5 只 編號(hào)后操作 終止反應(yīng) 血液加入后立即 計(jì)時(shí) 10 分鐘 到時(shí)立即加入 25 硫酸 2 0ml 邊加邊搖 終止酶促反應(yīng) 4 滴定 用標(biāo)準(zhǔn) 0 002mol L 高錳酸鉀滴定 記錄各瓶耗高錳酸鉀的 ml 數(shù) 5 計(jì)算 1 反應(yīng)瓶中過(guò)氧化氫濃度計(jì)算 S H2O2摩爾濃度 H2O2的 ml 數(shù) 3 0 2 反應(yīng)速度計(jì)算 V H2O2的摩爾濃度 加入 H2O2毫升數(shù) 0 002 2 5 消耗 KMnO4的 ml 數(shù) 加入的 H2O2的毫摩爾數(shù) 剩余的 H2O2的毫摩爾數(shù) 3 求 Km 值 如圖 如圖 3 六 SDS PAGE 法測(cè)定純化的過(guò)氧化氫酶分子量 1 凝膠的制備 預(yù)先處理好 2 蛋白質(zhì) 樣品的處理 將蛋白質(zhì)溶解在蛋白質(zhì)樣品溶解液中 在 100 加熱 2 5 分鐘 蛋白質(zhì)的最后濃度一般為 0 05 1mg ml 3 加樣 4 電泳 5 剝膠和固定 垂直柱形電泳 6 染色和脫色 7 蛋白質(zhì)的定量 如圖 如圖 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 小鼠肝臟過(guò)氧化氫酶分離純化小鼠肝臟過(guò)氧化氫酶分離純化 酶活酶活溶液體溶液體 積積 mlml 蛋白濃蛋白濃 度度 mg mlmg ml IU mlIU ml 總酶活總酶活比活比活 IU m g 回收率回收率 KmKm 分子量分子量 勻漿產(chǎn)勻漿產(chǎn) 物物 4444 2 7 層析產(chǎn)層析產(chǎn) 物物 2 20 2051010202048 7848 78 0 0795 57 891 圖 1 試驗(yàn)中的幾個(gè)注意事項(xiàng)試驗(yàn)中的幾個(gè)注意事項(xiàng) 1 使用離心機(jī)要注意平衡 平穩(wěn) 對(duì)稱(chēng) 牢固 緩慢 以防止損傷離心機(jī) 2 手動(dòng)玻璃勻漿器助溶時(shí) 要注意緩慢旋轉(zhuǎn)推移 時(shí)間稍微長(zhǎng)一些 使溶解的更充 分 3 使用分光光度計(jì)前 要記得調(diào)零 圖 2 圖 3 圖 4 4 裝柱時(shí) 避免出現(xiàn)斷層 干膠 實(shí)驗(yàn)必須保證試管 量筒 吸管等的清潔 以避 免試劑之間的污染 影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果 5 勻漿制備中快慢交替 防止溫度過(guò)高對(duì)過(guò)氧化氫酶產(chǎn)生影響 6 洗脫速度不可過(guò)快 以防樣品帶擴(kuò)散 結(jié)果誤差分析結(jié)果誤差分析 本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論數(shù)值基本符合 但稍有誤差 可能因?yàn)?1 使用的儀器內(nèi)有雜質(zhì) 儀器老化 2 滴加的試劑與酶沒(méi)有充分接觸 3 酶因?yàn)椴僮鲿r(shí)溫度稍高部分會(huì)失活 4 拿出離心管時(shí)稍微晃動(dòng)使沉淀與上清液混合 5 層析時(shí)收集的液滴大小不均造成吸光度測(cè)量誤差 6 滴定時(shí)計(jì)時(shí)不準(zhǔn)確 滴定終點(diǎn)人為判斷不一致 7 滴定前過(guò)氧化氫分解或稍被硫酸污染 8 周?chē)h(huán)境中的雜蛋白影響 可能因?yàn)閷?shí)驗(yàn)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)造成酶活性降低 實(shí)驗(yàn)討論實(shí)驗(yàn)討論 1 鹽析時(shí) 為什么要在冰浴攪拌的狀態(tài)下 且要緩慢滴加 答 常溫下 酶的活性有損傷 攪拌和緩慢滴加 是防止局部鹽濃度過(guò)高 使雜蛋白 析出 2 為什么勻漿 透析中用醋酸緩沖液 而鹽析 凝膠層析中用的都