第七章植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與細(xì)胞融合2014年

內(nèi)容植物原生質(zhì)體分離 植物原生質(zhì)體培養(yǎng) 植物細(xì)胞 要求了解原生質(zhì)分離 純化 活力測定及其影響因素 掌握植原生質(zhì)體培養(yǎng)的方法 步驟和影響因素 理解植物細(xì)胞融合的原理及方法 第七章原生質(zhì)體培養(yǎng) 植物細(xì)胞中除去細(xì)胞壁的裸露的有生活力的部分 除了沒有細(xì)胞壁外 具有細(xì)胞的一切特征 原生質(zhì)體包括 細(xì)胞質(zhì)膜 膜內(nèi)細(xì)胞質(zhì) 其他具有生命活性的細(xì)胞器 如細(xì)胞核 線粒體和高爾基體等 原生質(zhì)體 protoplast 原生質(zhì)體培養(yǎng)意義 是植物細(xì)胞工程的核心技術(shù) 1 除去了細(xì)胞壁 為植物細(xì)胞之間的融合掃平了障礙 實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞雜交 為制造新雜種開辟了道路 克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性 2 原生質(zhì)體是各種遺傳操作的理想受體 從而可以進(jìn)行品種的遺傳改良 可攝入外源DNA 細(xì)胞器 細(xì)菌或病毒顆粒 為高等植物的遺傳飾變打下基礎(chǔ) 3 獲得細(xì)胞無性系和選育突變體的優(yōu)良起始材料 一 原生質(zhì)體的分離 一 材料來源植物的莖 葉 胚 子葉 下胚軸等器官組織以及愈傷組織和懸浮培養(yǎng)細(xì)胞均可作為原生質(zhì)體分離的材料 目前較多采用葉片分離原生質(zhì)體 但分裂旺盛的 再分化能力強(qiáng)的愈傷組織或懸浮細(xì)胞系 尤其是胚性愈傷組織或胚性懸浮細(xì)胞系是最理想的原生質(zhì)體分離材料 第一節(jié)原生質(zhì)體的分離與純化 材料預(yù)處理 意義 提高原生質(zhì)體的分裂頻率 逐步提高植物材料的滲透壓 以適應(yīng)培養(yǎng)基中的高滲環(huán)境 方法 暗處理豌豆枝條取下后 分離原生質(zhì)體前 先在黑暗中 一定濕度 放1 2d 提高原生質(zhì)體存活率高 并能繼續(xù)分裂 預(yù)培養(yǎng)羽衣甘藍(lán)先去葉下表皮 再在誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)7d 再去壁 原生質(zhì)體高度液泡化 葉綠體也解體 低溫處理龍膽試管苗的葉片只有用4 低溫處理后 分離得到的原生質(zhì)體才能分裂 在很多情況下材料不必經(jīng)過專門的預(yù)處理 1 機(jī)械法Klercker于1892年最早進(jìn)行分離高等植物原生質(zhì)體的研究 其方法是把細(xì)胞置于一種高滲的糖溶液中 使細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離 原生質(zhì)體收縮成球形 然后用利刃切割 發(fā)生質(zhì)壁分離的細(xì)胞壁被切去后釋放出原生質(zhì)體 缺點(diǎn) 原生質(zhì)體的產(chǎn)量低 方法繁瑣費(fèi)力 對分生細(xì)胞和其它液泡化程度不高的細(xì)胞不適用 未得到廣泛應(yīng)用 優(yōu)點(diǎn)能夠排除外加酶對離體原生質(zhì)體的結(jié)構(gòu)和代謝活性的有害影響 二 原生質(zhì)體分離方法 2 酶分離法 1960年 Cocking首先利用纖維素酶處理番茄根尖 分離得到收率高 活力強(qiáng) 完整性好的原生質(zhì)體 1968年 纖維素酶和離析酶商品化生產(chǎn)后 大量進(jìn)行植物原生質(zhì)體的研究 現(xiàn)在果膠酶處理 單細(xì)胞 纖維素酶處理 原生質(zhì)體分離原生質(zhì)體最有效方法 細(xì)胞壁的組成 纖維素半纖維素果膠質(zhì)少量蛋白質(zhì)25 50 53 5 纖維素酶半纖維素酶果膠酶 酶的種類及特點(diǎn) 纖維素酶主要含有纖維素酶C 作用于天然的和結(jié)晶的纖維素 具有分解天然纖維素的作用 還含纖維素酶CX 作用于定形的纖維素 可分解短鏈纖維素 另含有纖維素二糖酶 木聚糖酶 萄聚糖酶 果膠酶 脂肪酶 磷脂酶 核酸酶 溶菌酶等 總體作用是降解纖維素 得到裸露的原生質(zhì)體 半纖維素酶降解半纖維素為單糖或單糖衍生物 果膠酶使細(xì)胞間的果膠質(zhì)降解 把細(xì)胞從組織內(nèi)分離出來 此外 還有蝸牛酶 主要用于花粉母細(xì)胞和四分體細(xì)胞 等 原生質(zhì)體酶分離法 兩步分離法用果膠酶離析植物組織 收集細(xì)胞 經(jīng)洗滌后用纖維素酶解離細(xì)胞壁 然后獲得原生質(zhì)體 日本產(chǎn)的Onozuka纖維素酶常和果膠酶結(jié)合使用 一步分離法一定量的纖維素酶和果膠酶組成混合酶液 對材料進(jìn)行一次性處理 上海植物生理研究所生產(chǎn)的ZA3 867纖維酶是多種酶的復(fù)合物 含有纖維素酶 果膠酶 半纖維素酶等 分離細(xì)胞壁的效果較好 酶液的配制 酶的配比和濃度果膠酶 纖維素酶純度高 但濃度不宜太高 木本植物加入半纖維素酶 如果溶液中的滲透壓和細(xì)胞內(nèi)的滲透壓不同 原生質(zhì)體有可能漲破或收縮 因此在酶液 洗液和培養(yǎng)液中滲透壓應(yīng)大致和原生質(zhì)體內(nèi)的相同 或者比細(xì)胞內(nèi)滲透壓略大些 較高水平的滲透劑可以阻止原生質(zhì)體的破裂和出芽 但同時也可能抑制原生質(zhì)體的分裂 糖溶液系統(tǒng)包括甘露醇 山梨醇 蔗糖和葡萄糖等 濃度約在0 40 0 80mol L 可促進(jìn)分離的原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁并繼續(xù)分裂 鹽溶液系統(tǒng)包括KCl MgSO4和KH2PO4等 此外 酶溶液里還可加入適量的葡聚糖硫酸鉀 提高原生質(zhì)體的穩(wěn)定性 使RNA酶不活化 并使離子穩(wěn)定 滲透穩(wěn)定劑 pH 酶溶液的pH值對原生質(zhì)體的產(chǎn)量和生活力影響很大 用菜豆葉片作培養(yǎng)材料時發(fā)現(xiàn)原始pH值為5 0時 原生質(zhì)體產(chǎn)生得很快 但損壞較嚴(yán)重 并且培養(yǎng)后大量破裂 當(dāng)pH值提高到6 0時 最初原生質(zhì)體卻產(chǎn)生少 但與pH值為5 0時處理同樣時間后相比 原生質(zhì)體數(shù)量顯著增加 原始pH值提高到7 0時 生活的原生質(zhì)體數(shù)量進(jìn)一步增加 損傷的原生質(zhì)體也少得多 分離葉肉原生質(zhì)體的完整流程 一 原生質(zhì)體的純化1 沉降法 過濾離心法 應(yīng)用最廣利用比重原理 低速離心使原生質(zhì)體沉于底部 過濾酶處理混合液 30 40 m微孔濾膜 低速離心 150g以下 3 5min 棄上清 用液體培養(yǎng)基或甘露醇溶液懸浮洗滌 重復(fù)2 3次 1 2ml液體培養(yǎng)基懸浮原生質(zhì)體 備用 優(yōu)點(diǎn) 操作方便 損失少 缺點(diǎn) 純度不高 二 原生質(zhì)體的純化與活力測定 2 漂浮法 利用比重大于原生質(zhì)體的高滲蔗糖溶液 離心后原生質(zhì)體位于蔗糖溶液和原生質(zhì)體懸浮培養(yǎng)基的界面上 殘?jiān)樾汲恋焦艿?先加蔗糖溶液 20 左右 酶處理混合液置于其上 離心 150g 5min用液體培養(yǎng)基或甘露醇溶液懸浮洗滌2 3次 1 2ml液體培養(yǎng)基懸浮原生質(zhì)體 備用 優(yōu)點(diǎn) 純度高缺點(diǎn) 收率低 3 界面法 采用2種或2種以上密度不同的溶液 離心后使完整的原生質(zhì)體處在兩液相的界面 最早Hughes 1978 兩液相下層 450mM L蔗糖上層 450mM L甘露醇Piwowarczyk 1978 改進(jìn)了上述方法兩液相下層 培養(yǎng)基 含500mM L蔗糖中層 培養(yǎng)基 含140mM L蔗糖 360mM L山梨醇上層 含原生質(zhì)體酶液 含300mM L山梨醇和100mM LCaCl2現(xiàn)在用不同連續(xù)梯度Ficoll 聚蔗糖 溶液 上面為酶 原生質(zhì)體混合液 經(jīng)離心 150g 5min 不同比重的原生質(zhì)體漂浮在不同濃度梯度的界面上 優(yōu)點(diǎn) 收獲的原生質(zhì)體大小均勻一致 缺點(diǎn) 收率低 純化后的葉肉原生質(zhì)體 二 原生質(zhì)體活力的測定 1 以胞質(zhì)環(huán)流作為進(jìn)行活躍代謝的指標(biāo) 但對在細(xì)胞周圍攜有大量葉綠體的葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體來說 這種方法的作用不大 2 以氧的攝入量作指標(biāo) 攝入量可通過一個能指示呼吸代謝強(qiáng)度的氧電極進(jìn)行測定 3 以光合活性作指標(biāo) 4 以完整的質(zhì)膜排斥伊凡藍(lán)的能力作指標(biāo) 5 以熒光素雙醋酸酯 FDA 的染色能力為指標(biāo) 一 供體植物的選擇供體組織的生理狀態(tài)很重要 一般情況下 在可控光 溫 濕的環(huán)境條件下能得到重復(fù)的結(jié)果 即在無菌條件下生長的幼苗制備原生質(zhì)體較好 第二節(jié)原生質(zhì)體培養(yǎng) 1 基本培養(yǎng)基MS和B5 或其衍生的培養(yǎng)基 CaCl2促進(jìn)細(xì)胞分裂 鈣可增強(qiáng)原生質(zhì)體穩(wěn)定性 提高分裂頻率 明顯改變細(xì)胞質(zhì)內(nèi)外的離子交換 NH4NO3降低細(xì)胞分裂頻率 2 生長調(diào)節(jié)物質(zhì)生長素 細(xì)胞分裂素類 針對不同的研究對象 培養(yǎng)基中生長素和細(xì)胞分裂素的水平要做適當(dāng)調(diào)整 二 原生質(zhì)體培養(yǎng)基 3 滲壓劑在沒有再生出一個堅(jiān)韌的細(xì)胞壁之前 原生質(zhì)必須有培養(yǎng)基滲透壓的保護(hù) 高滲溶液 培養(yǎng)時一般逐步過渡 通常的滲透劑是甘露醇和山梨醇 MS NAA2 0ppm BA0 5ppm 3 蔗糖 9 甘露醇4 pH 5 6 6 0培養(yǎng)基用醋酸纖維微孔濾膜過濾滅菌 新分離出來的原生質(zhì)體應(yīng)在散射光或黑暗中培養(yǎng) 培養(yǎng)溫度一般在25 30 下 三 培養(yǎng)條件 1 液體淺層培養(yǎng)原生質(zhì)體懸浮在液體培養(yǎng)基 約2 105 ml密度 將原生質(zhì)體懸浮液移到直徑為6cm的培養(yǎng)皿中 2 3mm為宜 5 10天后開始原生質(zhì)體分裂優(yōu)點(diǎn) 通氣好 原生質(zhì)體代謝物易擴(kuò)散 防止有害物質(zhì)積累過多造成毒害 轉(zhuǎn)移添加新鮮培養(yǎng)基方便 便于觀察和照相 操作簡單 可微量培養(yǎng) 細(xì)胞植板率高 缺點(diǎn) 原生質(zhì)體沉淀 分布不均 細(xì)胞團(tuán)聚集多 難成單細(xì)胞株系 四 培養(yǎng)方法 原生質(zhì)體 密度為4 105 ml 與等量體積瓊脂糖培養(yǎng)基均勻混合 置于6cm培養(yǎng)皿 2 3mm 暗培養(yǎng) 5 7天原生質(zhì)體開始分裂 優(yōu)點(diǎn)原生質(zhì)體分布均勻 利于分裂 容易獲得單胞株系 可定位觀察 缺點(diǎn)原生質(zhì)體易受熱傷害 易破碎 原生質(zhì)體始終處于高滲透壓脅迫下生長發(fā)育緩慢 植板率低 2 固體 平板培養(yǎng) 原生質(zhì)體采用平板培養(yǎng)方法包埋在培養(yǎng)皿底層 上面再加入相同成分的液體培養(yǎng)基 暗培養(yǎng) 需更換新鮮液體培養(yǎng)基 優(yōu)點(diǎn)原生質(zhì)體分布均勻 有利于分裂 易獲單細(xì)胞株系 能除去抑制分裂的有害物質(zhì) 細(xì)胞植板率高 缺點(diǎn)原生質(zhì)體易受熱傷害 易破碎 3 固 液 雙層培養(yǎng) 五 低密度培養(yǎng) 與細(xì)胞培養(yǎng)相似 原生質(zhì)體初始植板密度對植板效率有顯著的影響 原生質(zhì)體培養(yǎng)的一般密度為104 105 高密度下 個別原生質(zhì)體形成的細(xì)胞團(tuán)在相當(dāng)早時就交織在一起 如果原生質(zhì)體群體在遺傳上是異質(zhì)的 就會形成嵌合體組織 在體細(xì)胞雜交和誘發(fā)突變的研究中 最好能獲得個別細(xì)胞的無性系 需要低密度 100 500 原生質(zhì)體培養(yǎng) 1 培養(yǎng)基 KM8pKao Michayluk 1975 Viciahajastana 一種蠶豆 單細(xì)胞再生出壁 并分裂形成愈傷 在苜蓿 豌豆和Vicia中培養(yǎng)中 低密度下 小于100 分裂的更快 培養(yǎng)馬鈴薯原生質(zhì)體及馬鈴薯 番茄原生質(zhì)體融合產(chǎn)物獲得成功 黑暗或近于黑暗 50lx 培養(yǎng) 2 培養(yǎng)方法 1 飼養(yǎng)細(xì)胞層法用X射線或紫外線照射細(xì)胞 106 抑制細(xì)胞分裂 但不破壞細(xì)胞代謝 將其清洗 植板在軟瓊脂培養(yǎng)基上 此平板稱飼喂層 然后將未照射處理的原生質(zhì)體鋪在飼喂層上 特點(diǎn)以一種植物細(xì)胞制成的平板 支持另一種植物原生質(zhì)體的生長 飼喂層沒有種的特異性 煙草原生質(zhì)體植板密度低于104時 一般不能分裂 用此方法 植板密度可低至10 100 2種類型的活躍代謝和正在分裂的原生質(zhì)體混合在液體培養(yǎng)基中一起培養(yǎng) 用于某些物種原生質(zhì)體或雜種細(xì)胞的培養(yǎng) 條件2個物種原生質(zhì)體間能發(fā)生有效的互饋 其產(chǎn)生的愈傷組織形態(tài)上能彼此區(qū)分 2 共培養(yǎng)法 3 Cuprak微滴法 高國楠 1977 及Gleba 1978 設(shè)計(jì)特別培養(yǎng)皿培養(yǎng)單個原生質(zhì)體及其再生的細(xì)胞 兩室大的內(nèi)室 很多小穴 加入原生質(zhì)體懸浮液 0 25 0 5 l 小的外室 注入無菌水 保持培養(yǎng)皿內(nèi)濕度 可進(jìn)行單個原生質(zhì)體培養(yǎng) 六 細(xì)胞壁的形成 培養(yǎng)2 4天 原生質(zhì)體失去其特有的球型外觀 這是再生新壁的象征 研究認(rèn)為 旋花科植物原生質(zhì)體只有在外源供應(yīng)一種易于代謝的碳源 蔗糖 時 細(xì)胞壁才能再生 培養(yǎng)基中若存在電解質(zhì)滲透壓調(diào)節(jié)劑時會抑制壁的再生 壁的形成與細(xì)胞分裂有直接關(guān)系 凡是不能再生壁的原生質(zhì)體就不能進(jìn)行正常的有絲分裂 愈傷組織形成后 轉(zhuǎn)入不含滲透壓調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)劑中 其培養(yǎng)及植株再生與一般組織培養(yǎng)方法相同 原生質(zhì)體培養(yǎng)的程序 一 原生質(zhì)體融合意義原生質(zhì)體融合也稱體細(xì)胞雜交 即 分離下來的不同親本雜交的原生質(zhì)體 在人工控制下互相融合成一體 自然條件下 原生質(zhì)體自然融合頻率極低 必須加以一定的方法誘導(dǎo) 才能促進(jìn)原生質(zhì)體的融合 第三節(jié)原生質(zhì)體融合 原生質(zhì)體融合 打破了種間界限 生殖隔離 使基因交流擴(kuò)大范圍 克服有性雜交特別是遠(yuǎn)緣雜交的不親和性 擴(kuò)大了遺傳變異及種質(zhì)資源的范圍 原生質(zhì)體融合的意義 甘薯原生質(zhì)體融合植株 1 化學(xué)法融合1 無機(jī)鹽誘導(dǎo)融合1909年 Kuster證實(shí) 低滲NaNO3處理可誘導(dǎo)發(fā)生質(zhì)壁分離表皮細(xì)胞2個原生質(zhì)體融合 缺點(diǎn)異核體形成頻率不高 尤其是對于高度液泡化的葉肉原生質(zhì)體 二 原生質(zhì)體融合方法 Carlson等 1972 獲得第一個體細(xì)胞雜種 2 高pH 高鈣離子誘導(dǎo)融合 Keller和Melcher 1973年 強(qiáng)堿性的高濃度鈣離子 pH 10 5 鈣離子 50mmol L 37 處理30min 兩個品系煙草葉肉原生質(zhì)體很容易融合 1977年 獲得煙草種間和種內(nèi)體細(xì)胞雜種 對矮牽牛效果也很好 但對有些物種 高pH可能有毒 高國楠等 1974 提出 現(xiàn)被廣泛采用 滴150 l混合雙親的原生質(zhì)體懸浮液于載體玻片上 形成一層薄層 吸取PEG融合誘導(dǎo)液 28 58 分子量1500 6000 450 l 使其逐漸與原生質(zhì)體接觸 促使原生質(zhì)體相粘連 培養(yǎng)基進(jìn)行清洗 高Ca2 高pH溶液清洗 可提高原生質(zhì)體融合頻率 3 聚乙二醇 PEG 誘導(dǎo)融合 優(yōu)點(diǎn) 采用聚乙二醇作為融合劑時 異核體形成的頻率很高 可重復(fù)性很強(qiáng) 對大多數(shù)細(xì)胞類型來說毒性很低 將原生質(zhì)體懸浮液離心 去上清 用電擊液 10 甘露醇 0 1mmol L醋酸鈣 0 5mmol L醋酸鎂 懸浮 置于融合小室 在電融合儀的交變電場作用下 原生質(zhì)體彼此靠近 緊密接觸 在兩極間排成串珠狀 給予瞬間的高強(qiáng)度電脈沖 質(zhì)膜發(fā)生可逆性電激穿 導(dǎo)致融合 電融合法的優(yōu)點(diǎn) 與化學(xué)融合法相比 簡單 迅速 效率高 經(jīng)融合處理后沒有中毒反應(yīng) 需要特殊設(shè)備 不常采用 2 物理法融合 電融合技術(shù) 德國農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育枝頭上開花 結(jié)出鮮紅的番茄 而地下塊莖卻是馬鈴薯 番茄馬鈴薯 德國漢堡大學(xué)把牛肉細(xì)胞和番茄細(xì)胞融合成雜交種細(xì)胞 繁殖出一種雜交新品種 內(nèi)含牛肉動物蛋白和番茄植物蛋白各半 蛋白質(zhì)總量為普通番茄的40倍 所結(jié)出的果實(shí)兼有牛肉味和番茄味 營養(yǎng)也較全面 牛肉番茄 對稱融合完整原生質(zhì)體融合 產(chǎn)生核 核 胞質(zhì) 胞質(zhì)重組的對稱雜種 常因分裂不同步使一方的染色體全部或部分丟失 不對稱融合使一方的細(xì)胞核失活 胞質(zhì)體 或同時也使另一方的胞質(zhì)失活 核質(zhì)體 產(chǎn)生不對稱雜種 微原生質(zhì)體融合只有一條或幾條染色體的微核與原生質(zhì)體融合 原生質(zhì)體融合類型 胞壁再生比原生質(zhì)體培養(yǎng)稍滯后 核融合異核體 同核體及多核體的混合群體 異核體雙核分裂同步 子細(xì)胞含雙親的遺傳物質(zhì) 不同步 一方染色體丟失 細(xì)胞增殖有的在條件適合時繼續(xù)分裂形成細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織 有的中途停止分裂 死亡 融合體的培養(yǎng)和發(fā)育 經(jīng)過融合處理后的原生質(zhì)體群體內(nèi)包含未融合的2種親本原生質(zhì)體 同核體 異核體 各種其他核 質(zhì)組合 異核體是未來雜種的潛在來源 約占0 5 10 但其在生長和分化兩個方面均無競爭優(yōu)勢可言 有效鑒定和選擇雜種細(xì)胞 是體細(xì)胞雜交成功的關(guān)鍵 三 雜種細(xì)胞的篩選與鑒定 1 根據(jù)物理特性直觀選擇 1 根據(jù)可見標(biāo)志選擇如根據(jù)親本原生質(zhì)體含有的色素 對融合產(chǎn)物進(jìn)行鑒定 在其可辨特征消失之前 將其從混合群體中分離出來單獨(dú)培養(yǎng) 主要用于非綠色原生質(zhì)體與含有葉綠體的原生質(zhì)體的融合 用不同熒光染料標(biāo)記2種原生質(zhì)體 雜種存在2種熒光染料 在酶解時 染料0 5mg L 加到酶混合液中 異硫氰酸熒光素 綠 堿性蕊香紅熒光素 紅 2 根據(jù)熒光標(biāo)記選擇 用發(fā)不同熒光的熒光染料標(biāo)記 3 低密度植板選擇 把原生質(zhì)體以低密度植板在瓊脂培養(yǎng)基上 以便追蹤個別的雜種細(xì)胞及它們的后代 1 激素自主性互補(bǔ)選擇2個親本原生質(zhì)體生長 需要生長激素 雜種自身能產(chǎn)生生長激素 無激素培養(yǎng)基篩選 Carson篩選出粉藍(lán)煙草和朗氏煙草的雜種細(xì)胞 2 互補(bǔ)篩選法 2 野生型與白化突變互補(bǔ)選擇 矮牽牛白化突變體與綠色野生型矮牽牛 不同種 原生質(zhì)體融合