發(fā)明專利模板

一株發(fā)酵產(chǎn)黑色素的枯草芽孢桿菌及發(fā)酵產(chǎn)黑色素的方法技術(shù)領(lǐng)域：本發(fā)明屬于生物工程發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及通過枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵生產(chǎn)黑色素及提取方法。背景技術(shù)：黑色素是一種廣泛存在于生物體中的一類天然色素，是酪氨酸經(jīng)過一連串的化學(xué)反應(yīng)形成的，通常以聚合的方式存在。黑色素可以作為吸收紫外線的化妝品成分、天然染發(fā)劑的成分、以及生物殺蟲劑的光保護劑尤其是應(yīng)用于化妝品，因其具有吸收紫外線的作用，可以保護皮膚；色素有很多重要的生物學(xué)功能,它能通過與蛋白質(zhì)的交聯(lián)起到強化結(jié)構(gòu)的作用,同時黑色素還能提供一些機械力,并且保護蛋白質(zhì)不被降解；此外黑色素在醫(yī)學(xué)上也具有很廣的應(yīng)用范圍，具有清除自由基、阻止心磷脂脂質(zhì)體的氧化、抗輻射及抗氧化、對病理學(xué)和分類學(xué)的研究具有重要意義、作為新型的天然藥物載體、用來治療某些與黑色素缺乏相關(guān)的神經(jīng)性疾病,例如白癜風(fēng)是常見的一種由于黑色素的缺失而引起的一種疾病。目前，黑色素既可以通過酪氨酸或其衍生物的氯化進行化學(xué)合成，也可以從動植物材料中提取，還可以利用微生物合成，但現(xiàn)在大規(guī)模生產(chǎn)黑色素仍以化學(xué)合成法為主。例如一種以哺乳類動物的毛發(fā)為原料和一種以黑芝麻味原料，用氫氧化鈉溶液浸提后采用鹽析作為沉淀劑使黑色素沉淀來制取黑色素的方法。但隨著人們對以化學(xué)原料合成黑色素安全性問題的認(rèn)識，現(xiàn)越來越傾向于對天然黑色素的開發(fā)和應(yīng)用。尤其傾向于用微生物液體發(fā)酵生產(chǎn)黑色素。天然黑色素安全性高，成分確定可操作性強，尤其是采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)黑色素具有反應(yīng)條件溫和、操作簡單、低成本等特點。現(xiàn)在國內(nèi)對利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)黑色素的研究還較少，本發(fā)明是利用枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵生產(chǎn)黑色素。發(fā)明內(nèi)容：本發(fā)明針對現(xiàn)有黑色素合成工藝的不足，提供一種利用微生物液體發(fā)酵生產(chǎn)黑色素并提取的方法。本發(fā)明所用菌株為枯草芽孢桿菌*（ ）現(xiàn)已保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心（CGMCC），保藏編號為*本枯草芽孢桿菌*（ ）屬于革蘭氏陰性菌 本發(fā)明的技術(shù)方案：通過枯草芽孢桿菌的液體發(fā)酵生產(chǎn)黑色素，其過程包括菌種的斜面培養(yǎng)、種子液培養(yǎng)、搖床發(fā)酵培養(yǎng)、深層液體發(fā)酵培養(yǎng)和黑色素的提取。本發(fā)明的具體步驟為:(1)發(fā)酵菌種的準(zhǔn)備：取保存在-80的枯草芽孢桿菌接種于于固體培養(yǎng)基中，劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度3638，培養(yǎng)時間4872h，挑取單菌落作為種子菌。固體培養(yǎng)基的配制方法：成分為蛋白胨1g、葡萄糖0.1g、NaCl0.5g、CaCl2 0.01g、L-酪氨酸0.1g、瓊脂粉1.5g，然后用去離子水定容到100ml，調(diào)節(jié)PH為7.0，最后在溫度121、高壓蒸汽滅菌1520min，冷卻制得固體平板。(2)種子液發(fā)酵培養(yǎng)：將固體平板菌接種于種子液中，在溫度3638、轉(zhuǎn)速181r/min，培養(yǎng)1216h，培養(yǎng)至對數(shù)期。種子液的配制方法：成分為蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、NaCl1g然后用去離子水定容至100ml，調(diào)節(jié)PH為7.0，分裝到若干個250ml搖瓶中，在溫度121、高壓蒸汽滅菌1520min，冷卻得到種子液。(3)將種子液進行放大培養(yǎng)：取上述（2）種子液按接種量6%（V/V）接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度3638、轉(zhuǎn)速181r/min培2226h，然后加入L-酪氨酸0.1g/100ml，再繼續(xù)培養(yǎng)2030h。發(fā)酵培養(yǎng)基制備：成分為氮源1.5%2.5%、碳源1.5%2.5%、NaCl0.4g、KH2PO4、MgSO4.7H2O 0.02g、KNO31g、（NH4）2SO4 1g、玉米粉1g，然后用去離子水定容到100ml，調(diào)節(jié)PH為7.0，在溫度121、高壓蒸汽滅菌20min制得發(fā)酵液。上述（3）中發(fā)酵液：氮源可為酵母膏、尿素中的一種或多種。碳源可為麩皮、蔗糖、乳糖中的一種或多種。深層通風(fēng)液體發(fā)酵培養(yǎng)：（5）發(fā)酵液中黑色素的提?。喊l(fā)酵結(jié)束后將枯草芽孢桿菌黑色素發(fā)酵液過濾或者離心除去菌體，取發(fā)酵液濃縮，用5mol/LHCl調(diào)pH值至23，充分振蕩,靜置40100min，在攪拌的同時加入等體積有機溶劑使其充分沉淀，用濾布過濾棄上清，得黑色粗提物，于50真空干燥至恒重。所述發(fā)酵液離心轉(zhuǎn)速為50008000r/min，離心10min，除去菌體。所述有機溶劑為無水乙醇、無水甲醇或無水丙酮中任意一種。所述有機溶劑為濃度40%100%的乙醇。所述黑色素發(fā)酵液的濃縮比為50%。所述靜置可以為恒溫水浴中靜置，水浴溫度為0100。所述水浴溫度優(yōu)選為80。本發(fā)明制備黑色素的優(yōu)點：本發(fā)明方法制備的黑色素具有安全、簡單、高效等優(yōu)點。在化妝業(yè)、工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景。產(chǎn)自枯草芽孢桿菌的黑色素降低的生產(chǎn)能耗、縮短的生產(chǎn)周期、對環(huán)境危害小，于國家倡導(dǎo)的可持續(xù)性發(fā)展相結(jié)合。具體實施方式：下面結(jié)合具體事例對發(fā)明做詳細(xì)介紹：本發(fā)明所用菌種為枯草芽孢桿菌*（ ）現(xiàn)已保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心（CGMCC），保藏編號為*本枯草芽孢桿菌*（ ）屬于革蘭氏陰性菌 實施例一、種子液的培養(yǎng) (1)發(fā)酵菌種的準(zhǔn)備：取保存在-80的枯草芽孢桿菌菌種于固體培養(yǎng)基中，劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度3638，培養(yǎng)4872h，挑取單菌落作為種子液菌種。固體培養(yǎng)基的配制方法：成分為蛋白胨1g、葡萄糖0.1g、NaCl0.5g、CaCl2 0.01g、L-酪氨酸0.1g、瓊脂粉1.5g，然后用去離子水定容到100ml，用NaOH或HCL調(diào)節(jié)PH為7.0，在溫度121、高壓蒸汽滅菌1520min，冷卻制得固體平板。(2)枯草芽孢桿菌種子液培養(yǎng)：將固體平板菌接種于種子液中，在溫度3638、轉(zhuǎn)速181r/min，培養(yǎng)1216h，培養(yǎng)至對數(shù)期。 種子液的配制方法：成分為蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、NaCl1g然后用去離子水定容至100ml，用NaOH或HCL調(diào)節(jié)PH為7.0，分裝到2個250ml搖瓶中，在溫度121 、高壓蒸汽滅菌1520min，冷卻得到種子液。實施例二、 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)取上述枯草芽孢桿菌種子液按接種量6%（V/V）接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度3638、轉(zhuǎn)速181r/min培2226h，然后加入L-酪氨酸0.1g/100ml，再繼續(xù)培養(yǎng)2030h。發(fā)酵培養(yǎng)基制備：成分為氮源1.5%2.5%、碳源1.5%2.5%、NaCl0.4g、KH2PO4、MgSO4.7H2O0.02g、KNO31g、（NH4）2SO41g、玉米粉1g，然后用去離子水定容到100ml，調(diào)節(jié)PH為7.0，在溫度121、高壓蒸汽滅菌20min制得發(fā)酵液。上述發(fā)酵培養(yǎng)基中：源可為酵母膏、尿素中的一種或多種。碳源可為麩皮、蔗糖、乳糖中的一種或多種。實施例三、深層通風(fēng)液體發(fā)酵培養(yǎng)實施例四、發(fā)酵液中黑色素的提取發(fā)酵罐裝液量為15L，接種量為6%（V/V）,溶氧量20%,37181r/min，在24h后加入L-酪氨酸0.1g/100ml培養(yǎng)2-3d。發(fā)酵結(jié)束后將枯草芽孢桿菌黑色素發(fā)酵液過濾或者離心除去菌體，取發(fā)酵液濃縮，用5mol/LHCl調(diào)pH值至23，充分振蕩,靜置40100min，在攪拌的同時加入等體積有機溶劑使其充分沉淀，用濾布過濾棄上清，得黑色粗提物，于50真空干燥至恒重。所述發(fā)酵液離