葡萄糖對人肝細胞血管生成素樣蛋白3表達的影響.doc

KKME-專業(yè)醫(yī)學搜索引擎/葡萄糖對人肝細胞血管生成素樣蛋白3表達的影響作者:李倩,王繼紅,程梅,王欣 【摘要】 目的：觀察高濃度葡萄糖對人肝細胞株（L02）及胰島素抵抗細胞模型（IRL02）的血管生成素樣蛋白3（ANGPTL3）表達的影響，探討ANGPTL3與糖尿?。―M）并發(fā)高脂血癥的關系，在細胞水平分析DM并發(fā)高脂血癥的分子機制. 方法：以L02為研究對象，并建立胰島素抵抗模型（IRL02）. L02和IRL02兩組細胞分別在含5.6，7.0，11.1，28.0和33.0 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，5.6 mmol/L組作為對照組. 用RTPCR方法檢測ANGPTL3的mRNA表達量，并用Western Blot方法檢測ANGPTL3蛋白質(zhì)表達水平，分析ANGPTL3與DM并發(fā)高脂血癥的關系. 結(jié)果：高濃度葡萄糖可促進L02和IRL02兩組細胞ANGPTL3的mRNA和蛋白質(zhì)表達，并呈一定的量效關系，變化差異均有統(tǒng)計學意義（P0.0001）；IRL02細胞對葡萄糖的刺激尤為敏感（P0.0001）. 結(jié)論：高濃度葡萄糖可上調(diào)ANGPTL3的基因和蛋白質(zhì)表達，其在DM并發(fā)高脂血癥中可能起重要作用. 【關鍵詞】 血管生成素樣蛋白3；糖尿?。桓咧Y；葡萄糖；胰島素抗藥性 0引言 人血管生成素樣蛋白3（angiopoientinlike protein 3，ANGPTL3）是Mr約為70 ku的分泌蛋白，由460個氨基酸組成，其氨基端的螺旋樣結(jié)構(gòu)域與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的功能相關，主要在肝臟中表達1. ANGPTL3可通過抑制脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）的活性導致以極低密度脂蛋白（very lowdensity lipoprotein，VLDL）三酰甘油升高為主的高脂血癥. 脂代謝與糖代謝在多個環(huán)節(jié)相互作用，共同影響糖尿病（diabetes mellitus，DM）的發(fā)生與發(fā)展. 血脂異常是DM的危險因素，而有關ANGPTL3與DM相關性的研究目前國內(nèi)外都極少報道. 本實驗通過研究高糖環(huán)境下人肝細胞株（L02）及其胰島素抵抗細胞模型（insulin resistant L02，IRL02）ANGPTL3的mRNA和蛋白表達量變化，分析葡萄糖對該基因表達的影響，擬從分子水平探討ANGPTL3在DM并發(fā)高脂血癥中的病理生理作用. 1材料和方法 1.1材料L02（重慶醫(yī)科大學基礎研究所）；RPMI 1640培養(yǎng)基，1125胰蛋白酶（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；RTPCR試劑盒（寶生物大連有限公司）；ANGPTL3 基因引物和Actin引物，胰島素（上海生物工程技術服務有限公司）；ANGPTL3小鼠mAb和Actin小鼠mAb（英國Abcam公司）；辣根過氧化物酶標記羊抗鼠mAb，PVDF膜（北京鼎國生物制品公司）；免疫印跡（Western Blot）試劑盒（Santa Cruz公司）. PCR儀，微型電轉(zhuǎn)移裝置，GelDoc 100凝膠成像儀（美國BioRad公司）. 1.2方法 1.2.1細胞培養(yǎng)和胰島素抵抗模型的建立L02細胞用含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液在50 mL/L CO2, 37條件下培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期的細胞用于實驗. 用含510-7 mol/L胰島素的培養(yǎng)液培養(yǎng)16 h的L02細胞代替胰島素抵抗模型，稱為IRL02細胞，以在不含胰島素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)16 h的L02細胞為對照. 細胞計數(shù),接種后隨機分為L02細胞組和IRL02細胞組. 其中L02細胞組在上述條件培養(yǎng)16 h，更換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，又分為G1G5五個亞組，分別用含5.6，7.0，11.1，28.0，33.0 mmol/L的葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，設G1為對照組. IRL02細胞組：除用含510-7 mol/L胰島素的培養(yǎng)液替換胎牛血清培養(yǎng)L02細胞外，其它培養(yǎng)條件和時間與L02細胞組完全相同，同樣分為IRG1G5五個亞組，設IRG1為對照組. 1.2.2RTPCR檢測ANGPTL3的mRNA表達量按總RNA抽提試劑盒說明操作提取細胞總RNA，用UV法定量分析RNA得率和純度，瓊脂糖凝膠電泳分析其完整性. cDNA合成（10 L反應體系）：取MgCl2 2 L，10RT緩沖液1 L，無核酸酶蒸餾水3.75 L，dNTP混合液1 L，RNA酶抑制劑0.25 L，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 L，隨機引物0.5 L，總RNA(300 ng) 1 L. 逆轉(zhuǎn)錄反應條件：30 10 min，42 30 min，99 5 min，5 5 min，所得產(chǎn)物用于PCR擴增. PCR反應：采用Primer Premier 5.0軟件設計ANGPTL3引物和Actin引物. ANGPTL3上游引物序列：5 TCC AGA ACA CCC AGA AGT AAC 3，下游引物序列: 5 CCA GCC TCC TGA ATA ACC CT 3；Actin上游引物序列:5 TCC TCC CTG GAGAAG AGC TA 3，下游引物序列：5 TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG 3. ANGPTL3和Actin反應同管進行，終體積50 L. PCR反應條件：94 2 min，1個循環(huán)；94 30 s，55 30 s，72 1 min，共35個循環(huán). 取8 L反應液進行25 g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)采集圖片，Quantity One軟件分析，將ANGPTL3與Actin面積灰度值的比值作為ANGPTL 3的mRNA表達量參數(shù). 1.2.3Western Blot檢測細胞ANGPTL3的蛋白質(zhì)表達量提取細胞總蛋白質(zhì)，Lowry法測定總蛋白濃度. Western Blot：蛋白質(zhì)提取液（含60 g總蛋白）與5SDS上樣緩沖液按體積比41混合，常規(guī)處理后進行100 g/L SDS聚丙烯酰胺電泳，電轉(zhuǎn)過夜，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜. 常規(guī)Western Blot方法操作，ANGPTL3 mAb 11000稀釋，Actin mAb 15000稀釋，辣根過氧化物酶標記羊抗鼠mAb 15000稀釋. 凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Quantity One軟件分析，ANGPTL3與Actin的面積灰度值比值作為ANGPTL3的蛋白質(zhì)表達參數(shù). 統(tǒng)計學處理：數(shù)據(jù)用xs表示，用SAS 9.1軟件分析，采用析因設計方差分析，P0.05為差異具有統(tǒng)計學意義. 2結(jié)果 2.1實驗整體統(tǒng)計結(jié)果由表1可見，隨著葡萄糖濃度增加， L02細胞及IRL02細胞ANGPTL3的mRNA和蛋白質(zhì)表達量也隨之增加，對mRNA表達影響的析因設計方差分析結(jié)果為F=84.14, P0.0001；對蛋白質(zhì)表達影響分析結(jié)果為F=115.93, P0.0001，差異均有統(tǒng)計學意義. 在mRNA水平，葡萄糖濃度的影響：F=178.67，P0.0001；細胞組間比較：F=6.33，P0.05；葡萄糖濃度與細胞組比較：F=9.07，P=0.0002. 即葡萄糖對ANGPTL3的mRNA表達有明顯影響，在葡萄糖不同濃度組、不同細胞組和兩者的交互作用方面差異均有統(tǒng)計學意義. 在ANGPTL3蛋白質(zhì)表達方面，葡萄糖濃度變化對ANGPTL3表達影響的F=181.05；細胞組間比較F=194.72；濃度與細胞組間比較F=31.11，三者差異均有統(tǒng)計學意義（P0.05）. 說明ANGPTL3的基因表達對低葡萄糖濃度刺激不太敏感；而G3G5組與G1組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P0.0001）. 5個亞組間任意兩組兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P0.05），即當葡萄糖濃度升至11.133.3 mmol/L時，L02細胞ANGPTL3的mRNA表達升高（表1, 圖1）. 在蛋白質(zhì)表達水平， G2G5組與G1組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P0.05）外， 其它各組間差異均有統(tǒng)計學意義（P0.05）， 顯示高濃度葡萄糖可促進L02細胞ANGPTL3蛋白質(zhì)的表達（表1，圖2）. 2.3不同濃度葡萄糖對IRL02細胞ANGPTL3表達的影響在IRG1 IRG5五個亞組細胞間ANGPTL3的mRNA和蛋白質(zhì)表達量比較（表1，圖3），差異均有統(tǒng)計學意義（P0.0001，）. 在mRNA水平，IRG2 IRG5各組與IRG1組間比較，以及各亞組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P0.0001），顯示高糖可明顯刺激IRL02細胞ANGPTL3的mRNA表達，使其顯著升高. 在蛋白質(zhì)表達水平（表1，圖4），IRG2 IRG5各組與IRG1組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P0.0001），即隨培養(yǎng)液中葡萄糖濃度的增加，ANGPTL3蛋白質(zhì)的表達明顯升高. IRG2，IRG3和IRG5組組間兩兩比較顯示差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）. 顯示在極高濃度葡萄糖環(huán)境中，ANGPTL3蛋白質(zhì)表達數(shù)量的增加已受到限制. 2.4同濃度葡萄糖對L02和IRL02兩組細胞ANGPTL3表達的影響兩組細胞ANGPTL3的mRNA表達，除葡萄糖濃度5.6 mmol/L組IRL02細胞的表達量低于L02細胞外；其它各組均呈現(xiàn)IRL02細胞表達量明顯高于L02細胞(表1). 比較同葡萄糖濃度兩組細胞mRNA表達量，結(jié)果顯示，除7.0 mmol/L和11.1 mmol/L組IRL02細胞的表達雖比L02細胞增高，但差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）外；其余三組葡萄糖濃度對任意兩組細胞的影響差異均有統(tǒng)計學意義（P0.05）. 在ANGPTL3蛋白質(zhì)表達水平，IRL02細胞的表達量除葡萄糖5.6 mmol/L組低于L02細胞外，其它各組ANGPTL3的表達均明顯高于L02細胞組（表1），且各濃度葡萄糖對兩組細胞ANGPTL3 表達的影響除葡萄糖5.6 mmol/L組外，其它組組間差異均有統(tǒng)計學意義（P0.0001）. 3討論 DM導致患者死亡的最常見原因是心血管并發(fā)癥，2型DM患者約有58%死于動脈粥樣硬化性心血管病，其特征是胰島素（相對）缺乏和胰島素抵抗，而胰島素抵抗常引起內(nèi)源性胰島素過渡分泌，嚴重的高胰島素血癥因?qū)PL的激活作用明顯減弱可引起三酰甘油水平升高2，并與血糖控制不滿意密切相關. 本研究結(jié)果顯示，高糖可明顯刺激L02細胞ANGPTL3的mRNA和蛋白質(zhì)表達，在IRL02細胞高糖對該基因的上調(diào)作用更加明顯，說明ANGPTL3基因的表達在體內(nèi)極可能受血糖的調(diào)控，提示高血糖可以通過上調(diào)ANGPTL3的表達促進高脂血癥的發(fā)生與發(fā)展，ANGPTL3與DM及其相關高脂血癥密切相關. 實驗結(jié)果還顯示，當環(huán)境葡萄糖濃度升高到7.033.0 mmol/L時，IRL02的ANGPTL3基因和蛋白質(zhì)表達量都顯著增加，并有劑量依賴性，但當細胞處于葡萄糖濃度為5.6 mmol/L時，ANGPTL3的基因和蛋白質(zhì)表達反而降低，說明良好地控制血糖對預防DM脂代謝紊亂有重要意義. 有關胰島素抵抗血糖異常狀態(tài)下，胰島素信號通路可能通過上調(diào)ANGPTL3的表達導致血脂升高的具體機制我們正在進一步研究. ANGPTL3大量表達可引發(fā)三酰甘油升高為主的高脂血癥3. 而高三酰甘油血癥參與了一系列代謝性疾病的發(fā)病過程4-5. ANGPTL3的大量表達還可促進脂肪細胞的脂解作用，釋放大量FFA6，而FFA是肥胖導致IR的一項重要因素7；攝入高脂飲食和循環(huán)中的游離脂肪酸濃度增高可導致外周組織和肝臟的胰島素抵抗，進而產(chǎn)生2型DM和代謝綜合征8. 我們的研究結(jié)果提示，胰島素抵抗引發(fā)的高血糖狀態(tài)可通過上調(diào)ANGPTL3的表達，導致循環(huán)中三酰甘油和FFA增高，發(fā)生高脂血癥，而增高的三酰甘油和FFA又加重了肝臟及外周組織的胰島素抵抗，形成惡性循環(huán)，互為因果. 有研究還發(fā)現(xiàn)ANGPTL3基因是LXR的直接靶點9-11. 對LXR的研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖是其內(nèi)源性配基12，提示葡萄糖上調(diào)ANGPTL3的表達機制可能與LXR有關. 綜上所述，ANGPTL3可能是DM和高脂血癥發(fā)生、發(fā)展和橋接的關鍵點，對于ANGPTL3的基礎研究有助于DM，高脂血癥等代謝性疾病的病因?qū)W的發(fā)展，而針對ANGPTL3表達的調(diào)控和干預有望成為治療這類疾病的新型治療手段和途徑. 【參考文獻】 1 Ono M, Shimizugawa T, Mitsuru S, et al. Protein region important for regulation of lipid metabolism in angiopoietinlike 3(ANGPTL3):Angptl3 is cleaved and activated in vivoJ. Biol Chem, 2003,278(43)：41804-41809. 2 Shimamura M，Matsuda M，Ando Y，et al. Leptin and insulin downregulate angiopoietinlike protein 3, a plasma triglycerideincreasing factorJ. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 322:1080-1085. 3 Koster A, Chao YB, Mosior M, et al. Transgenic angiopoietinlike (angptl)4 overexpression and targeted disruption of angptl4 and angptl3: Regulation of triglyceride metabolismJ.Endocrinology，2005，146(11)：4943-4950. 4 Davey RA,Tebbutt NC, et al. Severe combined hyperlipidaemia and retinal lipid infiltration in a patient with Type 2 diabetes mellitusJ.Lipids Health Dis, 2006,5:29. 5 Oike Y, Akao M, Kubota Y, et al. Angiopoietinlike proteins: Potential new targets for metabolic syndrome therapyJ. Trends Mol Med，2005，11(10)：473-479. 6 Shimamura M，Matsuda M，Kobayashi S，et al. Angiopoietinlike protein 3, a hepatic secretory factor, activates lipolysis in adipocytesJ. Biochem Biophys Res Commun, 2003，301:604-609. 7 Gormsen LC, Jessen N, Gjedsted J, et al. Doseresponse effects of free fatty acids on glucose and lipid metabolism during somatostatin blockade of growth hormone and insulin in humansJ. Clin Endocrinol Metab, 2007,92(5):1834-1842. 8 Ye J. Role of insulin in the pathogenesis of free fatty acidinduced insulin resistance in skeletal muscle. E