熒光定量PCR儀器簡介-liuyippt課件

.,熒光定量PCR儀器簡介,湖南圣湘生物科技有限公司劉昳,.,主要內(nèi)容,.,.,945772,水浴鍋PCR,熒光定量PCR,金屬浴鍋PCR,1、PCR儀的發(fā)展歷史,.,2、熒光定量PCR儀的發(fā)展歷史,Perkin-ElmerCetus儀器公司推出第一臺熱循環(huán)儀,ABIPrism7700第一個高通量的實時熒光PCR儀,Bio-RadiCycler,2000年后更多質(zhì)優(yōu)價廉的儀器進(jìn)入市場，通量更高,1985.11,1996年,1998年,1999年,2000年,ABI推出7900HT熒光定量PCR儀,Roche推出第一臺全自動熒光定量PCR儀Lightcycler1.0,.,3、熒光定量PCR儀的組成,一臺PCR儀主要由控溫系統(tǒng)和光源系統(tǒng)兩大組件構(gòu)成。,.,4、熒光定量PCR儀的原理,Taqman探針,.,4、熒光定量PCR儀的原理,.,5、熒光定量PCR儀的應(yīng)用,基礎(chǔ)科學(xué)研究疾病檢測與治療檢測、預(yù)后優(yōu)生優(yōu)育及遺傳篩查基因表達(dá)分析臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用腫瘤分型/耐藥性評估食品衛(wèi)生檢疫及安全評估,醫(yī)院檢驗科、感染病科等疾控中心血站、血液中心研究所等機(jī)構(gòu)食品監(jiān)督管理局海關(guān)進(jìn)出口檢疫,.,高端市場,低端市場,5、熒光定量PCR儀的市場情況,.,高通量,高速度,自動化,靈活化,4,3,2,1,互聯(lián)網(wǎng)化,5,6、熒光定量PCR儀的發(fā)展趨勢,.,.,1、硬件組成,光學(xué)系統(tǒng)：激發(fā)光源和檢測系統(tǒng)；熱循環(huán)系統(tǒng)：加熱和制冷系統(tǒng)；信號處理系統(tǒng)；,.,2、激發(fā)光源比較,.,Laser:高強(qiáng)度,波長范圍窄Tungstenlamp:中等光強(qiáng),波長范圍寬Lightemittingdiode:低的光強(qiáng)，波長范圍窄,2.激發(fā)光源比較,.,2.激發(fā)光源比較,.,3、檢測裝置比較,.,3、檢測裝置靈敏度比較,PMT可以檢測到很寬的波長范圍，并對信號有放大作用CCD檢測范圍寬,易受背景信號噪音影響,整體檢測時間較長光電二極管可以檢測到很寬的波長范圍,檢測靈敏度低,冷CCD裝置與普通CCD相比：冷CCD能降低圖像噪音，提高圖像質(zhì)量和靈敏度。,.,3、檢測裝置PMT和CCD檢測原理比較：,光信號得以擴(kuò)增.獲得更大的檢測信號和更高的靈敏度無邊緣效應(yīng),光子釋放出電子，使檢測器留下一個帶正電荷正電荷記數(shù)作為檢測信號信號沒有得以放大有邊緣效應(yīng),.,4、加熱系統(tǒng)：空氣加熱,速度快；管間溫度均一性好；無需金屬的精密加工；成本低；對環(huán)境溫度要求高：不能低于室溫（15-35）;靈活性差：不能做溫度梯度；樣本數(shù)量少（羅氏毛細(xì)管32個）。,.,金屬熱塊的加熱和降溫分別通過電阻絲和半導(dǎo)體來控制。特點：溫控范圍大（4to99），均一性（0.5）；靈活性好：可以做溫度梯度；樣本數(shù)量多（96孔和384孔)；但其加熱速度比空氣加熱稍慢。,4、加熱系統(tǒng)：半導(dǎo)體加熱系統(tǒng),.,風(fēng)扇制冷壓縮機(jī)制冷半導(dǎo)體制冷,5、制冷系統(tǒng),.,6、熒光定量PCR儀的性能目標(biāo),.,.,PCR儀的家族成員,進(jìn)口美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（ABI）美國伯樂（Bio-rad）瑞士羅氏（Roche）美國安捷倫（Agilent）德國凱杰（Qiagen）德國艾本德（Eppendorf）韓國柏業(yè)（Bioneer）,國產(chǎn)杭州博日（Bioer）上海宏石（Slan）西安天?。═ianlong）上海楓嶺（Funglyn）廈門安普利（Amplly）廣州達(dá)安（DA）上?？迫A（Fluocycler）,.,.,2007年：ABIStepone/Plus,2010年：ABIViiA7,.,ABI儀器光學(xué)路徑,.,Rox：(5-carboxy-x-rhodamine)5-羧基-X-羅丹明,樣本1,樣本2,Rox的功能：1）校正單次反應(yīng)運行中由于泡沫或蒸發(fā)/冷凝而導(dǎo)致的信號改變；2）為故障分析提供一項強(qiáng)有力的診斷工具：每次循環(huán)采集參比染料信號，不受PCR反應(yīng)影響；3）均一化校正由于移液誤差或蒸發(fā)所導(dǎo)致的批內(nèi)體積差異；4）均一化校正批間體積差異，提供更連續(xù)一致的批間重復(fù)Ct值。,ABI儀器：校正染料ROX,.,ABI儀器：校正染料ROX的效果,.,各款A(yù)BI主流熒光定量PCR的特點,.,羅氏定量PCR儀大家族,Lightcycler1.5,Lightcycler2.0,Lightcycler480,Lightcyclernano,Lightcycler1536,羅氏CobasAmpliprep,.,空氣后通過加熱元件加熱，熱空氣經(jīng)過風(fēng)扇的作用進(jìn)入循環(huán)腔內(nèi)；通過風(fēng)扇的調(diào)節(jié)來保證空氣循環(huán)和溫度的均一性；加熱時，風(fēng)扇低速運轉(zhuǎn)從而使得腔內(nèi)的溫度均勻；冷卻時，風(fēng)扇高速運轉(zhuǎn)使加熱槍和毛細(xì)管降溫。,RocheLC1.5/2.0熒光定量儀特點,.,RocheLC1.5/LC2.0性能參數(shù),.,RocheLC480熱循環(huán)系統(tǒng)組成和特點：ThermalBlockCycler包括了樣本底座（96孔或384孔），Peltier元件，配合Therma-BaseTM熱均衡器，銀質(zhì)散熱塊和電子元件。Blockcyclercover(熱蓋）Multiwellplateloader,Multiwellplatedetector,Multiwellplatebar-codescanner(條形碼掃描裝置），BlockCyclerdoorwithfans.,熱蓋,微孔板模塊Peltier半導(dǎo)體加熱單位冷卻裝置Therma-BaseTM,RocheLC480,.,RocheLC480特有的溫控元件Therma-Base,Therma-Base是一種熱均衡器。封閉的真空夾層，內(nèi)壁為燈芯式結(jié)構(gòu)，存貯工作液；通過一系列的蒸發(fā)和凝結(jié)過程來調(diào)節(jié)控制溫度,提升導(dǎo)熱效率，提高孔間溫度均一性，孔間溫度的精確度0.1C快速冷卻和加熱速度Heating:(4.8)C/sCooling:(2.5)C/s整個板的精確PCR結(jié)果96孔模式1hour384孔模式40min,多孔板座,Peltier元件,冷卻裝置：銀質(zhì)散熱鰭,Therma-Base層,.,光源：Xenon-lamp,RocheLC480光學(xué)系統(tǒng)組成及特點激發(fā)和發(fā)射濾鏡輪：5個激發(fā)波長和6個檢測波長；半峰帶分別為25-40nm和20nm；,氙燈：激發(fā)波長從330nm到630nm；需預(yù)熱兩分鐘；平均壽命至少500個小時；易更換。,冷CCD(1204x1344),溫度被控制在10左右，降低了熱噪作用。,RocheLC480光學(xué)系統(tǒng)特點,.,光路特點：如何解決邊緣效應(yīng)？,光源太近：光強(qiáng)度夠了，但邊緣光信號根本無法收集；,光源太遠(yuǎn)：整體光強(qiáng)度不夠，且邊緣信號弱。,.,RocheLC480獨有的compactinstrument:,兩個解決辦法：Fieldlens:具有很好的光透性和光收集能力；使得激發(fā)和檢測光的保持良好均一性；光線以近乎直角的角度經(jīng)過熱蓋孔射到每個孔中；2.特殊的光路設(shè)計使樣本與CCD達(dá)到最佳光程位置，光經(jīng)過多次折射后到達(dá)檢測系統(tǒng)。,孔間無陰影效應(yīng)很好地收集孔邊緣光，不會造成邊緣光的失真或變化,保證了整板的均一性和靈敏度,.,MyIQ單色PCR,Bio-radIQ5,Bio-radICycler,MJOpticon2,Bio-radCFX-96,伯樂定量PCR儀大家族,.,Bio-RadRealTimePCR儀性能特點,.,安捷倫定量PCR儀大家族,StrategeneMx3000P,StrategeneMx3005P,2001年，StrategeneMx3000P,2007年，安捷倫收購Strategene。,.,Mx3000p熒光定量PCR儀硬件,.,熱循環(huán)系統(tǒng)特點：半導(dǎo)體控溫制冷（Peltier控溫）熱蓋加熱升降溫速度2.5/s溫度均一性和準(zhǔn)確性：0.25,.,光學(xué)系統(tǒng)特點：,1使用PMT光電倍增管（提高靈敏度且無邊緣效應(yīng)）2光纖維掃描激發(fā)和檢測3光源：鹵鎢燈,.,掃描式檢測模式：,恒定的強(qiáng)度，沒有位置的相關(guān)性；,1.所有96孔都用相同強(qiáng)度的光掃描，因此沒有激發(fā)的差別2.所有96孔的發(fā)射光都經(jīng)過相同的距離傳輸給PMT，因此沒有檢測距離的差別,避免了個樣品間的光程差，無需內(nèi)參校正。,整板讀取3.5秒；4通道的掃描16秒；5通道的掃描要20秒選擇不同的染料后，分別掃描濾鏡輪轉(zhuǎn)動16bitPMT檢測熒光,.,ROTORGene3000,ROTORGene6000,ROTORGeneQ,凱杰定量PCR儀大家族,2008年，Qiagene收購Cobbert。,.,LED激發(fā),PMT檢測,反應(yīng)倉-空氣流動使溫度上升下降,.,主要特點：空氣加熱，升溫（15/s)和降溫(20/s)速度快；每通道獨立LED燈光源，和濾光片，多達(dá)6個通道（365-680nm激發(fā)，460-750nm檢測）；PMT檢測，增益可調(diào)；提供Rotor0DiscTMOTV進(jìn)行光學(xué)溫度校驗；36-wellRotor,72-wellRotor,0.2ml普通PCR管，0.1ml四聯(lián)管；,Rotor-GeneQ實時熒光定量PCR儀-Qiagen,.,其他進(jìn)口PCR儀,艾本德Mastercycler,柏業(yè)ExicyclerTM96,.,LINE-GENEFQD-33A,LINE-GENEFQD-66A,LINE-GENEFQD-K,LINE-GENEFQD-96A,博日定量PCR儀大家族,.,博日PCR儀器加熱模塊,.,激發(fā)光LED,Longlifemaintenance-freeultra-bright,熒光檢測PMT,LowTemperatureDriftultra-sensitiveHigh-stable,博日PCR儀器光源系統(tǒng),.,底部掃描方式，全板掃描時間少于5秒,博日PCR儀器熒光采集,.,SLAN-48,SLAN-96P,SLAN-96R,宏石定量PCR儀大家族,.,宏石slan熒光定量PCR儀,光源：LED燈檢測裝置：PMT(光電倍增管）溫控系統(tǒng)：半導(dǎo)體加熱/制冷檢測動力學(xué)范圍：100-1010反應(yīng)體積：10ul-100ul可選擇的熒光染料：FAM,SYBER;VIC,HEX,JOE,TET;ROX,TEXRAD,CY5樣本容量：48個（20ul-100ul)SFDA,CETUVISO13485認(rèn)證（2003）,軟件系統(tǒng)根據(jù)每管熒光值大小，自動選擇增益值，無需手動設(shè)置；檢測靈敏度高，熒光背景值低，無需光學(xué)及背景校正。,.,Slan的獨特檢測模式：獨立光纖傳導(dǎo)掃描側(cè)面檢測,提高了熒光采集效率，減小孔間熒光干擾側(cè)面檢測，相對頂部透光，降低了對管蓋透光性的要求,.,.,Genelight2400,Genelight9800,安普利定量PCR儀大家族,.,達(dá)安DA7600,達(dá)安PCR儀,光源：LED燈檢測裝置：PMT(光電倍增管）溫控系統(tǒng)：半導(dǎo)體加熱/制冷檢測動力學(xué)范圍：100-1010反應(yīng)體積：10ul-100ul激發(fā)波長：470nm檢測波長：530nm、640nm、710nm溫度范圍：30-99可選擇的熒光染料：FAM,SYBER;LC640NHSESTER;CY5.5,TYE705樣本容量：48