生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課件-(淀粉酶活力測(cè)定)

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)-生物技術(shù)系2017.5,HenanUniversityofTechnology,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,1.淀粉含量測(cè)定2.氨基酸的紙上層析3.蛋白質(zhì)分子量測(cè)定4.淀粉酶活力測(cè)定5.蛋白質(zhì)含量測(cè)定6.甲醛滴定測(cè)氨基氮7.酵母RNA的提取、組分鑒定和含量測(cè)定8.賴氨酸含量測(cè)定9.凝膠層析法分離蛋白質(zhì)10.蔗糖酶的提取與部分純化11.蔗糖酶活力的測(cè)定12.Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量,教學(xué)目的,生物化學(xué)是專業(yè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課，其先修課程為無(wú)機(jī)化學(xué)、分析化學(xué)和有機(jī)化學(xué)。其目的是：學(xué)習(xí)和掌握生物技術(shù)，培養(yǎng)動(dòng)手觀察和思維能力。,學(xué)習(xí)方法,1、預(yù)習(xí)：實(shí)驗(yàn)前必須進(jìn)行充分的預(yù)習(xí)和準(zhǔn)備，并寫(xiě)出預(yù)習(xí)報(bào)告，做到心中有數(shù)，這是做好實(shí)驗(yàn)的前提。2、操作：應(yīng)按擬定的實(shí)驗(yàn)操作計(jì)劃與方案進(jìn)行。做到輕（動(dòng)作輕、講話輕），細(xì)（細(xì)心觀察、細(xì)致操作），準(zhǔn)（試劑用量準(zhǔn)確、結(jié)果及其記錄準(zhǔn)確），潔（使用的儀器清潔，實(shí)驗(yàn)桌面整潔，實(shí)驗(yàn)結(jié)束把實(shí)驗(yàn)室打掃清潔）。3、在實(shí)驗(yàn)全過(guò)程中，應(yīng)集中注意力，獨(dú)立思考解決問(wèn)題。自己難以解釋時(shí)可請(qǐng)老師解答。4、寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告：做完實(shí)驗(yàn)后，應(yīng)解釋實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，并作出結(jié)論，或根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和處理。主要包括：a、目的，b、原理，c、操作步驟及實(shí)驗(yàn)性質(zhì)、現(xiàn)象，d、數(shù)據(jù)處理（含誤差原因及分析），e、討論，f、思考題回答。,實(shí)驗(yàn)室守則,生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室守則是學(xué)生實(shí)驗(yàn)正常進(jìn)行的保證，學(xué)生進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室必須遵守以下規(guī)則：1.進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，須遵守實(shí)驗(yàn)室紀(jì)律和制度，聽(tīng)從老師指導(dǎo)2.未穿實(shí)驗(yàn)服、未寫(xiě)實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)報(bào)告者不得進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3.進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后，要熟悉周圍環(huán)境，熟悉防火及急救設(shè)備器材的使用方法和存放位置，遵守安全規(guī)則。4.實(shí)驗(yàn)前，清點(diǎn)、檢查儀器、明確儀器規(guī)范操作方法及注意事項(xiàng)，否則不得動(dòng)手操作。5.使用藥品時(shí)，要求明確其性質(zhì)及使用方法后，據(jù)實(shí)驗(yàn)要求規(guī)范使用。禁止使用不明確藥品或隨意混合藥品。6.實(shí)驗(yàn)中，保持安靜，認(rèn)真操作，仔細(xì)觀察，積極思維，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中必須有原始記錄，不得擅自離開(kāi)崗位。7.實(shí)驗(yàn)室公用物品（包括器材、藥品等）用完后，應(yīng)歸放回原指定位置。實(shí)驗(yàn)廢液、廢物按要求放入指定收集器皿。8.愛(ài)護(hù)公物，注意衛(wèi)生，保持整潔，節(jié)約用水、電、氣及器材。9.實(shí)驗(yàn)完畢后，要求整理、清潔實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，檢查水、電、氣源，打掃實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生。10.實(shí)驗(yàn)記錄經(jīng)教師簽名認(rèn)可后，方可離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室。,實(shí)驗(yàn)一淀粉含量測(cè)定,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握旋光儀的操作使用。2.了解旋光法測(cè)粗淀粉的基本原理。二、實(shí)驗(yàn)原理在加熱及稀鹽酸的作用下，淀粉水解并轉(zhuǎn)入鹽酸溶液中。在一定的水解條件下，不同谷物淀粉的比旋光度是不同的。其在171195之間，因此可用旋光法測(cè)定粗淀粉的含量。,三、實(shí)驗(yàn)儀器和試劑,1、主要儀器：（1）旋光儀（2）電子天平（感量0.0001g）2、試劑：1鹽酸溶液30硫酸鋅溶液。15亞鐵氰化鉀溶液。,四、實(shí)驗(yàn)步驟,1.樣品的處理在電子天平上稱取小麥粉2.5000g置于三角瓶中加入50ml1%HCl混成漿狀（不能有結(jié)塊）沸水浴中準(zhǔn)確加熱15min先加1ml30%ZnSO4混勻再加1ml15%亞鐵氰化鉀混勻移至100ml容量瓶中加水定容混勻后過(guò)濾棄去最初15ml收集其余濾液。2.旋光度測(cè)定取濾液20ml置于旋光管中，先用1%HCl調(diào)節(jié)旋光儀“0”點(diǎn)，然后將樣品溶液放入旋光儀中測(cè),六、思考題樣品加鹽酸處理時(shí)，煮沸時(shí)間少于或多于15min會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生什么影響？,五、結(jié)果計(jì)算,其中：,實(shí)驗(yàn)二氨基酸的紙上層析,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)對(duì)氨基酸的分離，學(xué)習(xí)紙層析法的基本原理及操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理紙層析是以濾紙作為惰性支持物的分配層析，濾紙纖維上的OH具有親水性，因此能吸附一層水作為固定相，而通常把有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相。有機(jī)溶劑自上而下流動(dòng)，稱為下行層析；自下而上流動(dòng)，稱為上行層析。流動(dòng)相流經(jīng)支持物時(shí)與固定相之間連續(xù)抽提，使物質(zhì)在兩相之間不斷分配而得到分離。,三、儀器和試劑,1、主要儀器：（1）層析缸（2）微量進(jìn)樣器（3）噴霧器2、試劑：（1）展開(kāi)劑：乙醇：水：冰乙酸50:10:1（2）氨基酸溶液：0.5%的賴氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸溶液及它們的混合液（3）顯色劑：0.1%水合茚三酮丙酮溶液。,四、實(shí)驗(yàn)步驟,1、平衡：將展開(kāi)劑（乙醇：水：冰乙酸50:10:1）放入培養(yǎng)皿中置于密閉容器內(nèi)使其充滿展開(kāi)劑（24h左右）2、點(diǎn)樣：取濾紙1張用鉛筆在距下方2cm處劃線并將所得線段分成5等分從而得到4個(gè)標(biāo)記點(diǎn)，用微量進(jìn)樣器分別取5l下列樣品phelyspro混合Aa向4個(gè)標(biāo)記點(diǎn)上加樣（樣品擴(kuò)散中1cm）3、展層：將濾紙卷成筒狀且不能夠重疊，并用棉線扎緊然后垂直放入培養(yǎng)皿中進(jìn)行展層2h（當(dāng)展開(kāi)劑沿到達(dá)濾紙長(zhǎng)度三分之二時(shí)，即可取出）測(cè)量展開(kāi)劑前沿移動(dòng)距離（a）4、顯色：用0.1%茚三酮-丙酮溶液朝點(diǎn)樣面噴霧（不要噴得太多）然后將濾紙置于電爐上方20cm處加熱直至斑點(diǎn)出現(xiàn)為止，測(cè)量各斑點(diǎn)中心到點(diǎn)樣點(diǎn)距離（b）,1計(jì)算出各種氨基酸的Rf值，并根據(jù)Rf值鑒定出混合氨基酸中的各組分，在層析圖譜上標(biāo)出各氨基酸名稱。2對(duì)氨基酸移動(dòng)快慢的原因給予簡(jiǎn)要分析。,五、結(jié)果計(jì)算,六、思考題,實(shí)驗(yàn)三蛋白質(zhì)分子量測(cè)定,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆针娪净驹?、分類、影響因?SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳用途,凝膠制備。二、實(shí)驗(yàn)原理聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的方法，主要是根據(jù)各蛋白質(zhì)組分的分子大小和形狀以及所帶凈電荷多少等因素所造成的電泳遷移率的差別。在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入一定量的十二烷基硫酸鈉（SDS），使所有蛋白質(zhì)顆粒表面覆蓋一層SDS分子，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間原有的電荷差異消失，此時(shí)，蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量大小。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈直線關(guān)系。,1主要儀器（1）電泳儀（2）電泳槽2.試劑（1）電極緩沖液（2）PH7.2凝膠緩沖液（3）1%TEMED，（4）30%凝膠儲(chǔ)液，（5）10%過(guò)硫酸銨（6）0.1%考馬斯亮藍(lán)R250染色液（4）10%乙酸脫色液,四、實(shí)驗(yàn)步驟,1.電泳槽的安裝：取兩塊玻璃板將帶玻璃條的板（高板）放置桌面上在上面放置“U”型橡膠條最后將凹槽玻璃板（低板）壓在高板上，置于電泳槽內(nèi)，用鍥子壓緊。2.凝膠液的制備與灌裝：配置20ml凝膠液：在小燒杯中依次加入5ml30%凝膠儲(chǔ)液，10mlPH7.2凝膠緩沖液，2ml1%TEMED，2.2ml重蒸水，0.8ml10%過(guò)硫酸銨混勻立即沿高板內(nèi)側(cè)倒凝膠液于兩板之間直至低板上沿插上梳子放置15min，待膠凝后取下“U”條重新將膠板放置于電泳槽內(nèi)向外槽內(nèi)加三分之一槽深電極緩沖液向內(nèi)槽加入電極緩沖液沒(méi)過(guò)低板最后拔出梳子。3.加樣：用微量進(jìn)樣器加入7l標(biāo)準(zhǔn)蛋白于中間膠槽內(nèi)其余槽內(nèi)加入7l下列樣品牛血清蛋白綠豆分離蛋白4.電泳：連接電極線，高板外側(cè)接正極，低板內(nèi)側(cè)槽接負(fù)極，打開(kāi)電源調(diào)電流120mA電泳2h（當(dāng)指示劑前沿超過(guò)二分之一膠長(zhǎng)時(shí)停止）5.剝膠：取下膠板倒去電極緩沖液量取指示劑遷移距離和染色劑的前膠長(zhǎng)，然后將膠板置于水龍頭下方?jīng)_玻板四周直至膠與玻璃板分離6.染色與固定：將膠板放入染色盒內(nèi)向其中加入0.1%考馬斯亮藍(lán)R250使其浸沒(méi)置于搖床上染色過(guò)夜7.脫色：用10%乙酸溶液脫色至譜帶清晰，測(cè)定脫色后膠長(zhǎng)及各譜帶遷移距離。,五、結(jié)果計(jì)算,1、計(jì)算相對(duì)遷移率：2、以相對(duì)遷移率MR為橫坐標(biāo)、LgMr為縱坐標(biāo)，作出分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線。3、求分子量,五、注意事項(xiàng)130%Acr-Bis是神經(jīng)毒化合物，操作時(shí)要小心，做好個(gè)人防護(hù)2過(guò)硫酸銨需現(xiàn)用現(xiàn)配3過(guò)硫酸銨和TEMED在灌膠前加入即可4用微量加樣器上樣時(shí)，勿刺破膠面,根據(jù)本實(shí)驗(yàn)所學(xué)知識(shí)，自行設(shè)計(jì)豌豆凝集素的分離純化實(shí)驗(yàn)。,六、思考題,實(shí)驗(yàn)四淀粉酶活力測(cè)定,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握測(cè)定淀粉酶（包括-淀粉酶和-淀粉酶）活力的原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)原理淀粉酶主要包括-淀粉酶和-淀粉酶兩種。-淀粉酶可作用于淀粉中的-1,4-糖苷鍵，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，-淀粉酶可從淀粉的非還原性末端進(jìn)行水解，生成麥芽糖。淀粉酶催化產(chǎn)生的這些還原糖能使3,5-二硝基水楊酸還原，生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。,其反應(yīng)如右圖：,淀粉酶活力的大小與產(chǎn)生的還原糖的量成正比。用標(biāo)準(zhǔn)濃度的麥芽糖溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用比色法測(cè)定淀粉酶作用于淀粉后生成的還原糖的量，以單位重量樣品在一定時(shí)間內(nèi)生成的麥芽糖的量表示酶活力。淀粉酶存在于萌發(fā)后的禾谷類種子中，其中主要是-淀粉酶和-淀粉酶。兩種淀粉酶特性不同，-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速鈍化。-淀粉酶不耐熱，在7015min鈍化。根據(jù)它們的這種特性，采用加熱的方法鈍化-淀粉酶，測(cè)出-淀粉酶的活力。在非鈍化條件下測(cè)定淀粉酶總活力（-淀粉酶活力+-淀粉酶活力），再減去-淀粉酶的活力，就可求出-淀粉酶的活力。,三、儀器和試劑,主要儀器：（1）離心機(jī)（2）分光光度計(jì)試劑（1）標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液（2mg/mL）（2）1%3,5-二硝基水楊酸試劑（3）1%淀粉,四、操作步驟,以麥芽糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。,1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作（每2組4人做1標(biāo)準(zhǔn)曲線）,2.淀粉酶液的制備：在電子天平上稱取小麥芽（在9428冰箱內(nèi)，用后放回）0.5g置于研缽中加20ml水研成漿狀轉(zhuǎn)移至離心管中2000轉(zhuǎn)/分離心5min（注意離心前對(duì)稱放置的離心管應(yīng)在天平上平衡）取上清液于100ml容量瓶中加水定容混勻即得淀粉酶原液用于-淀粉酶活力測(cè)定吸取原液5ml于100ml容量瓶中加水定容即得淀粉酶稀釋液用于總酶活力測(cè)定。3.淀粉酶活力測(cè)定-淀粉酶活力測(cè)定吸取原液1ml于具塞試管中70保溫15min用于鈍化-淀粉酶加1ml1%淀粉置于40水浴中保溫5min加1%3.5一二硝基水楊酸2ml沸水加熱5min后加水至20ml混勻測(cè)A1（用1#管調(diào)零）總酶活力測(cè)定吸取稀釋液1ml于具塞試管中加1ml1%淀粉40保存5min加入1%3.5一二硝基水楊酸2ml沸水加熱5min后加水至20ml混勻測(cè)A2（用1#管調(diào)零）,五、結(jié)果計(jì)算,-淀粉酶活力（）淀粉酶總活力-淀粉酶活力麥芽糖含量從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得麥芽糖的毫克數(shù)原液體積為100稀釋倍數(shù)為20規(guī)定：40度5分鐘內(nèi)淀粉酶水解淀粉產(chǎn)生1mg麥芽糖為1個(gè)活力單位（u）,六、附注,1樣品提取液的定容體積和酶液稀釋倍數(shù)可根據(jù)不同材料酶活性的大小而定。2為了確保酶促反應(yīng)時(shí)間的準(zhǔn)確性，在進(jìn)行保溫這一步驟時(shí)，可以將各試管每隔一定時(shí)間依次放入恒溫水浴，準(zhǔn)確記錄時(shí)間，到達(dá)5min時(shí)取出試管，立即加入3,5-二硝基水楊酸以終止酶反應(yīng)，以便盡量減小因各試管保溫時(shí)間不同而引起的誤差。同時(shí)恒溫水浴溫度變化應(yīng)不超過(guò)0.5。3如果條件允許，各實(shí)驗(yàn)小組可采用不同材料，例如萌發(fā)1d、2d、3d、4d的小麥種子，比較測(cè)定結(jié)果，以了解萌發(fā)過(guò)程中這兩種淀粉酶活性的變化。,七、思考題,1為什么要將試管中的淀粉酶原液置70水浴中保溫15min？2為什么要將各試管中的淀粉酶原液和1%淀粉溶液分別置于40水浴中保溫？,實(shí)驗(yàn)五蛋白質(zhì)含量的測(cè)定,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)凱氏定氮法的原理和操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理含氮的有機(jī)物與濃硫酸共熱時(shí)，其中的碳、氫二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮?jiǎng)t轉(zhuǎn)變成氨，并進(jìn)一步與硫酸作用生成硫酸銨。濃堿可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，借水蒸汽將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定濃度的過(guò)量硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中氫離子濃度降低，然后用標(biāo)準(zhǔn)無(wú)機(jī)酸滴定，直到恢復(fù)溶液中原來(lái)氫離子濃度為止，最后根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)酸的摩爾數(shù)（相當(dāng)于待測(cè)物中氨的摩爾數(shù)）計(jì)算出待測(cè)物中的總氮量。,三、實(shí)驗(yàn)試劑、器材,1主要儀器(1)凱氏定氮蒸餾裝置(2)消化爐(3)電子天平2試劑(1)濃硫酸（化學(xué)純）(2)硫酸鉀-硫酸銅混合催化劑(3)甲基紅-溴甲酚綠混合指劑(4)2%硼酸溶液(5)標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液（約0.01mol/L）(6)40%NaOH(7)0.01mol/LHCl,四、操作步驟,1、消化：在電子天平上稱取小麥粉0.2000g-0.4000g置于凱氏試管底部加混合混合催化劑0.5g和3ml濃硫酸置于消化爐中高溫加熱至淡綠色透明（2h左右）取出放入通風(fēng)櫥內(nèi)至不冒白煙，向其中加20ml水，并移至100ml容量瓶定容即得樣品消化液。同時(shí)每4組8人做1空白實(shí)驗(yàn)：0.5g混合催化劑+3ml濃硫酸置于凱氏試管中放入消化爐加熱至淡綠色（1h左右）冷卻后加水移入100ml容量瓶中定容得空白消化液。2.蒸餾與吸收：吸取10ml2%的硼酸于三角瓶中加4d甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑（若變綠色則用0.01mol/LHCl調(diào)至紫紅色）。將其置于冷凝管下端并使管尖插入液面以下，再吸取5ml消化液從漏斗上方加入蒸餾室內(nèi)用水洗兩次，并加入10ml40%NaOH后水封（注意：勿使漏斗內(nèi)玻桿取下以防漏氣），然后打開(kāi)通氣閥進(jìn)行加熱蒸餾，直至吸收液由紫紅色變成綠色，計(jì)時(shí)蒸餾3min先移去吸收液再停止加熱以防倒吸。3.滴定：用0.01mol/LHCl滴定吸收液由綠色退去變紅色為止，記下耗去標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的體積V1.V0。,C：標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液摩爾濃度(0.01)。V1：滴定樣品用去的鹽酸溶液平均毫升數(shù)。V0：滴定空白消化液用去的鹽酸溶液平均毫升數(shù)。W：樣品重量（mg）。14.01：氮的原子量。K=5.7M=12.5%V2=100mlV3=5ml,五、結(jié)果計(jì)算,實(shí)驗(yàn)六甲醛滴定測(cè)氨基氮,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?加深對(duì)氨基酸兩性解離的認(rèn)識(shí)。2掌握甲醛滴定法的原理及應(yīng)用。,三、實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及材料,1.實(shí)驗(yàn)儀器：微量堿式滴定管（10ml）、2.試劑：(1)0.5酚酞指示劑：。(2)1甘氨酸即1克加100ml水配制而成(3)0.1molL標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液（使用前需標(biāo)定）。(4)中性甲醛溶液：取分析純甲醛(3637)溶液20ml，加0.5酚酞指示劑約3滴，滴加0.100molL的氫氧化鈉溶液，使溶液呈微粉紅色（臨用前中和）。,氨基酸為兩性離子，在水溶液中有下列平衡：RCHCOO-+2HCHORCHCOO-+H+NH3+N(CH2OH)2常溫下甲醛能迅速與氨基酸的氨基結(jié)合生成亞羥甲基化合物，使上述平衡右移促使NH3+釋放H+，從而使溶液酸度增加，滴定終點(diǎn)移至酚酞的變色域內(nèi)（pH值9.0左右），根據(jù)滴定終點(diǎn)時(shí)所消耗標(biāo)準(zhǔn)堿的量即可算出反應(yīng)體系中存在的游離氨基即氨基氮的含量如果樣品為一種已知的氨基酸，即可算出該氨基酸的含量。如果樣品為未知氨基酸或幾種氨基酸的混合物，則只能算出其氨基氮的含量。,二、實(shí)驗(yàn)原理,四、操作方法,已知氨基酸溶液中氨基酸含量的測(cè)定:取3只三角瓶編號(hào)2ml1%甘氨酸2ml1%甘氨酸2ml水（空白）均加5ml水和5ml中性甲醛（用前加2滴0.5%酚酞滴加0.1mol/LNaOH調(diào)至淡紅色），及4滴0.5%酚酞混勻用0.1mol/L滴至粉紅色出現(xiàn)為止分別記下耗去標(biāo)準(zhǔn)堿的體積(V1.V2.V0）,五、結(jié)果處理與計(jì)算,式中：V：滴定樣品所消耗標(biāo)準(zhǔn)堿的平均體積（ml）。V0：滴定空白所消耗標(biāo)準(zhǔn)堿的體積（ml）。C：滴定時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉的濃度（0.1molL）.14.01：lmllmolL氫氧化鈉相當(dāng)于氮的質(zhì)量（mg）。,說(shuō)明：1.本法優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單快速，缺點(diǎn)是不夠準(zhǔn)確，其準(zhǔn)確度僅達(dá)到氨基酸或氨基氮理論含量的90。而且，如果樣品液中含有脯氨酸或酪氨酸時(shí)滴定誤差更大，因?yàn)楦彼崤c甲醛作用后生成不穩(wěn)定化合物使結(jié)果偏低，酪氨酸的酚基結(jié)構(gòu)又使結(jié)果偏高。2甲醛滴定法常用以測(cè)定蛋白質(zhì)的水解程度。3中性甲醛需臨用前配制。放置一段時(shí)間后，在使用前需重新中和。,六、思考題,為什么說(shuō)甲醛滴定法可以測(cè)定蛋白質(zhì)的水解程度？除此之外還有哪些方法可以用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的水解程度？,實(shí)驗(yàn)七酵母RNA的提取、組分鑒定和含量測(cè)定,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?）了解并掌握稀堿法提取酵母RNA的原理和方法。（2）了解核酸的組分并掌握其鑒定方法。（3）掌握地衣酚顯色法測(cè)定酵母RNA含量的原理和方法,二、實(shí)驗(yàn)原理,酵母含RNA達(dá)2.6710.0%，以酵母為原料使用稀堿使酵母裂解，然后用酸中和,除去蛋白質(zhì)和菌體后的上清液用乙醇沉淀RNA。由此得到的RNA為變性的RNA，可用作制備核苷酸的原料。用硫酸水解RNA后,可生成磷酸、戊糖和堿基,各成分用以下反應(yīng)加以鑒定：（1）磷酸與鉬酸銨試劑作用可生成黃色磷鉬酸銨沉淀。（2）核糖與地衣酚試劑作用呈鮮綠色。（3）嘌呤堿與硝酸銀反應(yīng)可生成白色的嘌呤銀化物沉淀。RNA與濃鹽酸共熱時(shí)，即發(fā)生降解，形成的核糖繼而轉(zhuǎn)變成糠醛，后者與3，5-二羥甲苯（地衣酚或苔黑酚）反應(yīng)呈鮮綠色，該反應(yīng)需用三氯化鐵和氯化銅作催化劑，反應(yīng)產(chǎn)物在670nm處有最大吸收。RNA在20250微克范圍內(nèi)，光吸收與RNA濃度成正比。,三、儀器和試劑,1.主要試劑（1）酵母粉（2）0.04MNaOH溶液（3）1.5M硫酸（4）無(wú)水乙醚（5）95乙醇（6）濃氨水（7）酸性乙醇溶液（8）濃硝酸（9）0.1MAgNO3（10）三氯化鐵-鹽酸溶液。（11）鉬酸銨試劑（12）50ugRNA標(biāo)準(zhǔn)溶液,（13）苔黑酚(3,5-二羥基甲苯)乙醇溶液（14）地衣酚-銅離子試劑（15）0.001MNaOH溶液2、器材：（1）離心機(jī)（2）分光光度計(jì)（3）抽濾裝置。（4）電子天平,四、實(shí)驗(yàn)步驟,1、酵母RNA提取稱5g干酵母粉于20mL0.04MNaOH溶液中并在研缽中研成漿狀并轉(zhuǎn)入三角燒瓶中。再用10mL0.04MNaOH溶液洗滌并轉(zhuǎn)入三角燒瓶中，沸水浴加熱30min，冷卻，轉(zhuǎn)入離心管。3000轉(zhuǎn)/分，離心15分鐘后，將上清慢慢傾入10mL酸性乙醇，邊加邊攪動(dòng)。加畢，靜置，待RNA沉淀完全后，3000r/min離心3min。棄去上清液。用95乙醇10mL洗滌沉淀。再用乙醚10mL洗滌沉淀并將沉淀轉(zhuǎn)移至布氏漏斗抽濾（先稱量濾紙重W1），沉淀在空氣中干燥30min。稱量所得RNA粗品和濾紙重W2。W2-W1即為RNA粗品重量,2、酵母RNA水解取100mg粗提的酵母RNA于三角瓶中，加入1.5M硫酸10mL,沸水浴加熱10分鐘制成水解液，然后進(jìn)行組份鑒定。3、RNA組份鑒定（1）嘌呤堿：取水解液1mL于試管中滴加入40滴濃氨水。然后加入20滴0.1M硝酸銀溶液，觀察有無(wú)白色嘌呤堿銀化合物沉淀。（2）核糖：取水解液1mL于試管中加入三氯化鐵濃鹽酸溶液40滴和苔黑酚乙醇溶液4滴。放沸水浴中10min。注意觀察核糖是否變成綠色。（3）磷酸：取水解液1mL于試管中加5滴濃硝酸酸化，再加入20滴鉬酸銨溶液在沸水浴上加熱，觀察有無(wú)黃色磷鉬酸銨沉淀產(chǎn)生。,4.RNA含量測(cè)定（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：（每4組8人做1標(biāo)準(zhǔn)曲線）,以RNA微克數(shù)為橫坐標(biāo)，以A670為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。,（2）樣品的處理：稱取10mg粗提的酵母RNA加入100mL0.001MNaOH溶液混勻即得樣品液.（3）酵母RNA含量測(cè)定：取試管1支加入2mL樣品液，再加2mL地衣酚-銅試劑沸水加熱25分鐘冷卻后測(cè)定A(用1號(hào)調(diào)零),四、結(jié)果處理1.酵母RNA得率（%）=（W2-W1）*100W其中W-干酵母粉重量（克）2.粗提的酵母RNA含量（%）=m*V1*100V2*W/其中W/-酵母RNA重量（g）m-從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得RNA的微克數(shù)V1-100mLV2-2mL,實(shí)驗(yàn)八賴氨酸含量測(cè)定,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆展任镏匈嚢彼岷康臏y(cè)定方法及原理。,二、實(shí)驗(yàn)原理,蛋白質(zhì)中賴氨酸的含量是谷物品質(zhì)的主要指標(biāo)之一。由于動(dòng)物及人類不能合成，須從食物中得以補(bǔ)充，為此培育高含量賴氨酸的谷物，對(duì)于提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有重要意義。本實(shí)驗(yàn)分別用茚三酮溶液顯色法和染料結(jié)合法，測(cè)定小麥種子中賴氨酸含量。谷物蛋白中賴氨酸殘基有自由的NH3與茚三酮試劑可發(fā)生顏色反應(yīng)，生成紫紅色物質(zhì)，其顏色深淺與賴氨酸殘基的數(shù)目成正相關(guān)，而其它氨基酸沒(méi)有自由氨基，不能發(fā)生這一反應(yīng)。選用碳原子數(shù)目與賴氨酸相同的亮氨酸，配成標(biāo)準(zhǔn)溶液，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，可用以測(cè)定谷物蛋白內(nèi)賴氨酸的含量。,三、實(shí)驗(yàn)儀器、試劑,1主要儀器：（1）分光光度計(jì)（2）離心機(jī)（3）電子天平2試劑：（1）茚三酮試劑（2）2碳酸鈉溶液（3）4碳酸鈉溶液（4）0.1mg/ml亮氨酸溶液（5）95%乙醇,四、實(shí)驗(yàn)步驟,1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作（每2組4人做1標(biāo)準(zhǔn)曲線）,以亮氨酸的微克數(shù)為橫坐標(biāo)，以A515縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,2、樣品的處理與測(cè)定：在電子天平上稱取小麥粉10mg于具塞試管底部加1ml2%碳酸鈉于80水浴中保溫提取10min加2ml茚三銅試劑80水浴中保溫30min后冷卻至室溫加5ml95%乙醇和5ml蒸餾水充分混勻后轉(zhuǎn)移至離心管中3000轉(zhuǎn)/分離心3min（離心前必須平衡）取上清液測(cè)A（以1號(hào)管調(diào)零）,五、結(jié)果計(jì)算,賴氨酸含量（%）式中：m：標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的亮氨酸的量(微克)；1.11=Mlys/MleuW：為樣品的干重（mg）。B=0.05,實(shí)驗(yàn)九、凝膠層析法分離蛋白質(zhì),一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)凝膠層析法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理，了解凝膠層析法的操作方法。,二、實(shí)驗(yàn)原理凝膠層析又稱分子篩層析，是利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠，對(duì)混合物中各組分按分子大小進(jìn)行分離的層析技術(shù)。把含有不同大小分子的混合液，鋪加在膠面上，讓它流過(guò)凝膠柱。由于凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，當(dāng)混合液通過(guò)凝膠顆?？p隙中時(shí)，溶液中的溶質(zhì)凡是比網(wǎng)孔小的分子，都能自由進(jìn)入顆粒內(nèi)部而受阻滯,流速緩慢,流程長(zhǎng)而后被洗脫；而比網(wǎng)孔大的分子則不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔而沿凝膠顆粒間的空隙先被洗脫(阻力小,流程短,流速大)。因此，在洗脫小分子物質(zhì)后流出（洗脫體積大），從而達(dá)到分離的目的。,三、實(shí)驗(yàn)儀器、試劑,1.主要儀器：（1）凝膠層析儀（2）電子天平（3）層析柱2.試劑：（1）SephadexG100（2）牛血清白蛋白（3）細(xì)胞色素C（4）血紅蛋白（5）核糖核酸酶,四、操作步驟1、凝膠的選擇與處理：稱取凝膠干粉加過(guò)量水浸泡過(guò)夜，棄去上層細(xì)小顆?；靹蚝笱b柱2.裝柱：將柱子垂直固定在鐵架上，先向主內(nèi)加入四分之一柱長(zhǎng)水，再將凝膠倒入柱內(nèi)，打開(kāi)下端開(kāi)口，繼續(xù)灌入凝膠，直至床面距上端5cm左右，觀察柱內(nèi)凝膠是否均勻，有無(wú)氣泡及斷層出現(xiàn)。3.平衡：柱子裝好后放置20min，用洗脫液平衡柱子直至床面不再下降為止，用藍(lán)色葡聚糖2000檢測(cè)柱子是否均勻。4.上樣與洗脫：加樣前檢查床面是否平整，若不平衡用玻璃棒攪拌凝膠使其自然下沉，在膠面上放置圓形濾紙片防止加樣時(shí)沖擊床面，用膠頭滴管吸去上層多余水，然后慢慢滴加10d牛血清蛋白樣品（每組8人加1次樣，兩次加樣間隔20min），待樣品進(jìn)入凝膠后，向床面滴加2cm高度水防止干膠，擰緊螺絲；打開(kāi)恒流泵，紫外檢測(cè)儀，記錄儀及部分收集記下初始筆尖位置，直至峰值出現(xiàn)記錄筆移動(dòng)距離L。5、儀器參數(shù)設(shè)置及調(diào)整：紫外檢測(cè)儀：當(dāng)檔位置于100%T時(shí)，調(diào)光量至數(shù)顯為100。當(dāng)檔位置于0.5A時(shí)調(diào)A數(shù)顯為0記錄儀：設(shè)置紙速2cm/h部分收集器：設(shè)置每10min收集1管，調(diào)恒流泵流速使每管收集液體為4ml即v=0.4ml/min,五、結(jié)果計(jì)算,1、以管號(hào)（或洗脫液體積）為橫坐標(biāo)、相應(yīng)管的A280為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。2、根據(jù)洗脫峰位置量出每種蛋白質(zhì)的洗脫體積Ve，然后以蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)值（logMr）為橫坐標(biāo)、Ve為縱坐標(biāo)，作出分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線。3、樣品完全按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的條件操作，根據(jù)紫外檢測(cè)獲得的洗脫體積，從分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的分子量。注意事項(xiàng)：1.層析柱上方要留有少量液體，避免使凝膠暴露于空氣中2.凝膠過(guò)濾上樣時(shí)，使樣品沿管壁緩緩流下，勿沖破膠面,實(shí)驗(yàn)十：酵母蔗糖酶的提取及部分純化,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)酶的提取和純化方法，并為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供一定量的蔗糖酶。二、實(shí)驗(yàn)原理：蔗糖酶（invertase）（-D-呋喃果糖苷果糖水解（fructofuranosidefructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特異地催化非還原糖中的呋喃果糖苷鍵水解，具有相對(duì)專一性。不僅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。本實(shí)驗(yàn)提取啤酒酵母中的蔗糖酶。該酶以兩種形式存在于酵母細(xì)胞膜的外側(cè)和內(nèi)側(cè)，在細(xì)胞膜外細(xì)胞壁中的稱之為外蔗糖酶（externalyeastinvertase）,其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50%糖成分的糖蛋白。在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)細(xì)胞質(zhì)中的稱之為內(nèi)蔗糖酶（internalyeastinvertase），含有少量的糖。兩種酶的蛋白質(zhì)部分均為雙亞基，二聚體，兩種形式的酶的氨基酸組成不同，外酶每個(gè)亞基比內(nèi)酶多兩個(gè)氨基酸，Ser和Met，它們的分子量也不同，外酶約為27萬(wàn)(或22萬(wàn)，與酵母的來(lái)源有關(guān))，內(nèi)酶約為13.5萬(wàn)。盡管這兩種酶在組成上有較大的差別，但其底物專一性和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)仍十分相似，因此，本實(shí)驗(yàn)未區(qū)分內(nèi)酶與外酶，而且由于內(nèi)酶含量很少，極難提取，本實(shí)驗(yàn)提取純化的主要是外酶。,三、試劑與器材：1.試劑：（1）啤酒酵母（2）甲苯（使用前預(yù)冷到0以下）（3）1N乙酸（4）95%乙醇（預(yù)冷至20）(5)0.02MPH4.9乙酸緩沖液(6)預(yù)冷蒸餾水2.器材：（1）研缽1個(gè)（2）恒溫水?。?）廣泛pH試紙（4）高速冷凍離心機(jī),四、操作步驟：1.提?。?）準(zhǔn)備一個(gè)冰浴，將研缽穩(wěn)妥放入冰浴中（兩組做一個(gè)）。（2）取5g二氧化硅放入研缽中研細(xì)。（3）稱取5g干啤酒酵母放入研缽中，量取預(yù)冷的甲苯20mL緩慢加入酵母中，邊加邊研磨成糊狀，約需30分鐘，至酵母細(xì)胞大部分研碎。（4）緩慢加入預(yù)冷的30mL去離子水，每次加2mL左右，邊加邊研磨30分鐘。以便將蔗糖酶充分轉(zhuǎn)入水相。（5）將混合物轉(zhuǎn)入4個(gè)離心管中（每組2個(gè)），平衡后，用高速冷凍離心機(jī)離心（4，10,000rpm，10min）。如果中間白色的脂肪層厚，說(shuō)明研磨效果良好。用滴管吸出上層有機(jī)相。（6）用滴管小心地取出脂肪層下面的水相，轉(zhuǎn)入另一個(gè)清潔的離心管中，兩組平衡后，4，10,000rpm，離心10min。（7）將清液轉(zhuǎn)入量筒，量出體積（“粗級(jí)分I”），取出1.5mL放入小離心管中，冷凍保存，備下次實(shí)驗(yàn)測(cè)定酶活力及蛋白質(zhì)含量。其余部分轉(zhuǎn)入另一清潔離心管中。2.熱處理（1）預(yù)先將恒溫水浴調(diào)到50，（2）用廣泛pH試紙檢查清液（“粗級(jí)分I”）的pH，用1N乙酸將pH調(diào)至5.0。（3）將盛有粗級(jí)分I的離心管穩(wěn)妥地放入水浴中，50下保溫30分鐘，在保溫過(guò)程中不斷輕搖離心管。（4）取出離心管，于冰浴中迅速冷卻，平衡后4，10,000rpm，離心10min。（5）將上清液轉(zhuǎn)入量筒，量出體積（稱為“熱級(jí)分II”）。取出1.5mL放入小離心管中，冷凍保存。3.乙醇沉淀將熱級(jí)分II轉(zhuǎn)入小燒杯中，放入冰浴中，逐滴加入等體積預(yù)冷至20的95%乙醇，同時(shí)輕輕攪拌，共需30分鐘，以沉淀完全。于4，10,000rpm，離心10min，傾去上清，并滴干。用3mL，0.02mol/L，pH4.9乙酸緩沖液將沉淀溶解，平均分成兩份（稱為“醇級(jí)分”），冷凍保存。,實(shí)驗(yàn)十一:蔗糖酶活力的測(cè)定,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆照崽敲富钚詼y(cè)定方法。了解各級(jí)分酶的純化情況。二、實(shí)驗(yàn)原理為了評(píng)價(jià)酶的純化效果，必須測(cè)定各級(jí)分酶的活性和比活性。測(cè)定蔗糖酶活性的方法有許多種，如費(fèi)林試劑法、Nelsons試劑法、水楊酸試劑法等，本實(shí)驗(yàn)使用費(fèi)林試劑法。其原理是在酸性條件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成一分子葡萄糖和一分子果糖。這些具有還原性的糖與堿性銅試劑混合加熱后被氧化，二價(jià)銅被還原成棕紅色氧化亞銅沉淀，氧化亞銅與磷鉬酸作用，生成藍(lán)色溶液，其藍(lán)色深度與還原糖的量成正比，于650nm測(cè)定光吸收值。,三、試劑和器材（一）試劑：1.堿性銅試劑：稱10g無(wú)水NaCO3，加入100mL去離子水溶解，另稱1.88g酒石酸，用100mL去離子水溶解，混合二溶液，再加入1.13克結(jié)晶CuSO4，溶解后定容到250mL。2.磷鉬酸試劑：在燒杯內(nèi)加入鉬酸17.5g，鎢酸鈉2.5g，10%NaOH100mL,去離子水100mL，混合后煮沸約30min（小心不要蒸干），驅(qū)去鉬酸中存在的氨，直到無(wú)氨味為止，冷卻后加85%磷酸63mL,混合并稀釋到250mL。3.0.25%苯甲酸200mL，配葡萄糖用，防止時(shí)間長(zhǎng)溶液長(zhǎng)菌，也可以用去離子水代替。4.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：（1）貯液：精確稱取無(wú)水葡萄糖（應(yīng)在105恒重過(guò)）0.1802克，以0.25%苯甲酸溶液溶解后，定容到100mL容量瓶中（濃度10mmol/L）。（2）操作溶液：用移液管取貯液10mL，置于50mL容量瓶中，以用0.25%苯甲酸或去離子