實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞化學(xué)染色POX

細(xì)胞化學(xué)染色、滄州醫(yī)學(xué)專業(yè)醫(yī)學(xué)技術(shù)系侯振江、細(xì)胞化學(xué)染色是一種基于形態(tài)，利用化學(xué)或生化技術(shù)對血細(xì)胞內(nèi)各種化學(xué)成分進(jìn)行定位、定性和半定量分析的方法。 為研究血細(xì)胞生理、病理、化學(xué)結(jié)構(gòu)的臨床診斷、鑒別診斷、療效觀察、預(yù)后監(jiān)測和發(fā)病機(jī)制探討提供重要依據(jù)。血細(xì)胞化學(xué)染色的基本要求是在原位顯示細(xì)胞成分和結(jié)構(gòu)，反應(yīng)產(chǎn)物是有色沉淀物，具有一定的穩(wěn)定性。 血球化學(xué)染色顯示糖原、脂質(zhì)、酶、蛋白質(zhì)等。物理法和化學(xué)法固定，(1)物理法固定，物理法固定干燥和火焰，化學(xué)法最常用甲醛、乙醇、丙酮和醋酸等。 血細(xì)胞化學(xué)染色工藝?yán)萌斯ず铣傻拿富|(zhì)，在酶的作用下產(chǎn)生降解產(chǎn)物，與重氮鹽結(jié)合產(chǎn)生偶氮偶聯(lián)，形成不溶性偶氮色素，證明酶的存在。 2、聯(lián)苯胺法：粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中的過氧化物酶作用于過氧化氫，釋放出新的生態(tài)氧，使無色聯(lián)苯胺發(fā)生藍(lán)色沉淀。3、普魯士藍(lán)法：細(xì)胞內(nèi)、外鐵與酸性亞鐵氰化鉀作用，形成藍(lán)色亞鐵氰化鐵沉淀。 4、舍爾反應(yīng)：高碘酸氧化細(xì)胞內(nèi)糖類中的乙二醇基形成乙醛基，醛基和舍爾試劑作用，使無色品紅色沉淀。 5、金屬沉積法以外還有物理學(xué)方法，如脂溶性染料染色(顯示脂質(zhì))、熒光顯示、放射自顯像及體外活體染色也常用于臨床血細(xì)胞學(xué)診斷。(三)細(xì)胞化學(xué)定量粗略估計(jì)，根據(jù)染色反應(yīng)的強(qiáng)弱、顏色濃淡，人為區(qū)別陰性和各種程度的陽性。 百分比法只能反映細(xì)胞的陽性率，不能反映顏色的強(qiáng)弱。 積分法是常用的半定量法，結(jié)合等級的估算和百分率，反映細(xì)胞陽性率的高低和細(xì)胞顏色的強(qiáng)弱。以下常用的細(xì)胞化學(xué)染色方法介紹方法學(xué)對白血病鑒別診斷具有重要意義。 一、過氧化物酶染色(POX )、(一)四甲基聯(lián)苯胺法(TMB )【原理】顆粒和單核細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)的髓過氧化物酶(POXorMPO )分解過氧化氫，釋放出新的生態(tài)氧，將白聯(lián)苯胺氧化為藍(lán)色聯(lián)苯胺，后者又變成茶色化合物沉積在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)、POX、新生態(tài)氧o111222卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡【試劑】取1%TMB亞硝基鐵氰化鈉飽和溶液1%過氧化氫溶液稀過氧化氫溶液瑞氏染色液、【操作】0.1%TMB乙醇溶液lml，取硝基2 .在新鮮干燥的血液片中，加入混合溶液0.5ml，放置lmin后，加入過氧化氫溶液0.7ml，染色6min。 3 .瑞氏染液重染1520min。 4 .油鏡檢查。【結(jié)果】細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在藍(lán)黑色粒子者為陽性。 (-)顆粒無沉積()顆粒小，分布稀疏()顆粒粗，局灶分布()顆粒粗大，分布密集，占細(xì)胞質(zhì)1/22/3 ()顆粒粗大，呈團(tuán)塊分布()的所有細(xì)胞質(zhì)均可充滿顆粒，復(fù)蓋核。 (1)粒系： POX主要分布于粒細(xì)胞和單核細(xì)胞內(nèi)，隨著粒細(xì)胞成熟度的增加而增強(qiáng)，中性分葉核細(xì)胞呈強(qiáng)陽性。 嗜酸性粒細(xì)胞陽性度最強(qiáng)，其陽性粒子比嗜酸性粒細(xì)胞粗大，折射。 堿性粒細(xì)胞陰性。(2)單核細(xì)胞：原始單核細(xì)胞呈陰性反應(yīng)，幼稚單核細(xì)胞和成熟單核細(xì)胞呈弱陽性反應(yīng)，顆粒細(xì)膩、分散分布。(3)其他細(xì)胞淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、幼紅細(xì)胞、組織細(xì)胞、巨核細(xì)胞均呈陰性反應(yīng)。(4)血小板過氧化物酶主要定位于幼稚型巨核細(xì)胞的核膜，作為原巨核細(xì)胞的一個標(biāo)志物，有助于FABM7的識別。 過氧化物酶染色主要用于急性白血病類型鑒別，急性骨髓細(xì)胞白血病多呈陽性反應(yīng)，以M3和M2型最強(qiáng)，以MI和M5型最弱，有助于區(qū)別M3和M5型。 急性淋巴細(xì)胞白血病表現(xiàn)為POX陰性反應(yīng)，是急性骨髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞白血病鑒別的重要指標(biāo)。注意事項(xiàng)、TMB制備在85%88%的乙醇溶液中染色效果好，不使用90%95%的乙醇，細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)會立即凝固，妨礙試劑滲透到細(xì)胞內(nèi)，減弱或消失顯色反應(yīng)。 雙氧水需要新鮮配制，其濃度和添加量不能隨意改變。 涂膜中粒細(xì)胞未見陽性顆粒，紅細(xì)胞呈棕色或綠色，表明過氧化氫過濃。 過氧化氫在血片上不產(chǎn)生氣泡的話，表示無效。 染色液的適當(dāng)pH為5.5，pH為10個鐵粒子。 正常范圍： 30%90%，平均60%，I型較多，無少見的ii型、iii、iv型。細(xì)胞內(nèi)鐵、(3)環(huán)狀鐵粒子紅血球：有6個鐵粒子，其中2/3以上的鐵粒子在核周圍排列成完全的環(huán)狀或不完全的環(huán)狀。 正?；蛴猩w粒幼細(xì)貧血無環(huán)狀鐵顆粒幼細(xì)胞、鐵顆粒幼細(xì)貧血中環(huán)狀鐵顆粒幼細(xì)胞為6%。環(huán)鐵粒幼細(xì)胞、【臨床意義】1 .缺鐵性貧血時(shí)，骨髓細(xì)胞外鐵明顯減少，“一”“士”，細(xì)胞內(nèi)鐵平均為5.9%，僅為I型。 經(jīng)過有效的鐵劑治療，外鐵增加了。 因此，骨髓鐵染色是診斷缺鐵性貧血、指導(dǎo)缺鐵劑治療的重要方法。2.鐵粒幼細(xì)胞性貧血時(shí)，外鐵“2”和“3”為內(nèi)鐵平均70%，鐵粒粗大，以iiiv型為主，出現(xiàn)很多環(huán)狀鐵粒幼細(xì)胞。 因此，本實(shí)驗(yàn)是診斷鐵粒幼細(xì)胞貧血的有效方法。 MDS還出現(xiàn)環(huán)狀鐵粒幼細(xì)胞。3.缺鐵性貧血如