微觀技術(shù)課程2 Microsoft PowerPoint 演示文稿.ppt

1、微觀技術(shù),馬玉堃 生命科學(xué)學(xué)院 2007年3月,2 目鏡 目鏡的組成 目鏡通常由2個(gè)透鏡組成。上面一個(gè)與眼睛接觸的叫接目透鏡，下面一個(gè)靠近視野的叫會(huì)聚透鏡或視野透鏡。在上下透鏡中間，或在視野透鏡的下面裝一個(gè)用金屬制的光闌，物鏡或視野透鏡就在這個(gè)光闌面成像。在此可以安裝目鏡測微計(jì)或用眼睫毛粘貼在光闌上制成指針目鏡。 目鏡的效用 1）使由物鏡映來的倒像，反映在目鏡的光闌上，并使它再擴(kuò)大成為直立的虛像。 2）可校正物鏡所余下來的色差及球面差，以及補(bǔ)正映像的歪曲。 3）使映像投射到一定的位置上，便于做顯微鏡照相。,目鏡的放大 目鏡的放大倍數(shù)計(jì)算： 目鏡的放大倍數(shù)=250mm（明示距離）/fmm（目鏡焦

2、距） 目鏡的焦距一般在出品目錄上都已注明，若焦距為36毫米，則目鏡放大倍數(shù)為7，這個(gè)數(shù)字在鏡頭上注明。在實(shí)驗(yàn)室常用的目鏡倍數(shù)為10。若與40的物鏡配合使用，則此顯微鏡的放大倍數(shù)為1040=400。,目鏡的類型 負(fù)目鏡 結(jié)構(gòu)如圖1-7A，最常見的一種。它是由2個(gè)平凹透鏡組成。在2個(gè)透鏡之間，有一個(gè)圓形的光闌。在下面的一個(gè)視野透鏡，其凸面向下，作用是聚會(huì)來自物鏡的光線，使之聚焦成像在光闌附近。上面透鏡也是凸面向下，作用是放大映象為眼睛接受。 正目鏡 這種目鏡也是由2個(gè)平凸面透鏡組成，如圖1-7B。其凸面相對，光闌也移動(dòng)到視野透鏡的下面。 補(bǔ)償目鏡 結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，它在焦點(diǎn)平面上端插入了一組消色透鏡，

3、如圖1-7C。這是專門為復(fù)消色差物鏡設(shè)計(jì)的。因?yàn)樵谝曇爸車匀怀霈F(xiàn)色差，如果單獨(dú)使用復(fù)消色差物鏡，仍不能全部消除，所以就與補(bǔ)償目鏡配合使用以達(dá)到消除殘留色差的目的。,3 集光器 集光器的效用 集光器是顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)中的重要組成部件。其功能是收集從光源來的光線并集合成光束，以增強(qiáng)照度，然后經(jīng)過標(biāo)本再射到物鏡中去。所以一般放大倍數(shù)較高的顯微鏡，在載物臺(tái)下面均有集光器。 集光器的組成 集光器一般由2個(gè)或3個(gè)凸透鏡組成，上面的透鏡是平面的，如圖1-8。一般顯微鏡都裝備有阿貝氏照明裝置，它是由集光器、彩虹光圈和反射鏡三者聯(lián)合而成，裝在鏡臺(tái)之下的支架上，利用齒輪和齒條升降，可調(diào)節(jié)光的強(qiáng)弱。在更高級的研究顯

4、微鏡中，另外裝有三個(gè)以上透鏡組成的消錯(cuò)性集光器。能消除球面色差和色象差。圖1-9。,集光器的用法 欲使顯微鏡發(fā)揮它的能力，除了有高級物鏡外，還必須有優(yōu)良的集光器配合使用，因?yàn)槲镧R的分辨力受集光器鏡口率的影響。 物鏡的有效鏡口率等于鏡口率加集光器鏡口率再除以2。 例如：鏡口率為1.2，如與鏡口率為0.5的集光器配合使用，則物鏡的有效鏡口率為0.85，即，物鏡的有效鏡口率=1/2（物鏡的鏡口率+集光器鏡口率）=1/2（1.2+0.5）=0.85。,因此，在使用集光器時(shí)應(yīng)該注意以下幾點(diǎn)： 原則上，集光器的鏡口率應(yīng)該與物鏡的鏡口率一致。通常集光器上刻有最大鏡口率的數(shù)值，如N.A.1.0，1.2，1.4

5、等。應(yīng)該根據(jù)情況來調(diào)整。 集光器鏡口率在1.0以上時(shí)，要用香柏油浸沒在集光器上面的透鏡與載玻片之間，以便使高倍物鏡發(fā)揮作用。 若照明光線過強(qiáng)時(shí)，可以降低集光器或縮小光圈，但都會(huì)減低顯微鏡的分辯力。所以最好是改變電燈的亮度，或利用深色濾光片或增加濾光片數(shù)量。 若檢查的標(biāo)本是活體或沒有染色，則需要縮小集光器下的光圈。因?yàn)檎彰鞯墓馐叫?，明暗對比越明顯。,顯微鏡的放大率：也稱放大倍數(shù)。顯微鏡的總放大倍數(shù)等于目鏡和物鏡的放大倍數(shù)的乘積。公式為：,M為總放大倍數(shù)， K1為物鏡放大倍數(shù)， K2為目鏡放大倍數(shù)， 為光學(xué)鏡筒長(單位：mm)，f1為物鏡焦距(單位：mm)， f2為目鏡焦距(單位：mm)， 25

6、0為明視距離(單位：mm)。 由公式可知，物鏡的放大率是對一定鏡筒長度而定的，鏡筒長度的變化，不僅放大率隨之變化，而且成像也受到影響。因此使用顯微鏡時(shí)，不能任意改變鏡筒的長度。所謂標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)鏡筒長是指物鏡的后焦點(diǎn)與目鏡的前焦點(diǎn)之間的距離。國際上將顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)鏡筒長定為160mm，此數(shù)字標(biāo)刻在物鏡的外殼上。,第三節(jié)顯微鏡的照明原理 以投射光為照明光,顯微鏡有2種照明方式： 一種為臨界照明,光源經(jīng)扣光鏡后會(huì)聚在被檢物體上,光束窄而強(qiáng),這是它的優(yōu)點(diǎn).但是光源的燈絲像與被檢物體的平面重合,這樣就造成被檢物體的照明呈現(xiàn)不均勻性,在有燈絲的地方明亮,無燈絲的地方暗淡,不僅影響質(zhì)量,也影響照相.,另一種為柯拉

7、照明,照明光路有許多組件,包括光源、集光器、視場光欄、孔徑光欄、集光器和物臺(tái)等。在此照明中, 集光器透鏡的2側(cè),燈絲和孔徑光欄為一共軛面. 燈絲的成像在孔徑光欄平面上. 集光器透鏡的2側(cè)視場光欄和物臺(tái)為一共軛面,視場光欄的像呈現(xiàn)在物臺(tái)上.因此,比臨界照明優(yōu)越.一是照明均勻,二是通過調(diào)整視場光欄大小和位置可以控制標(biāo)本平面上照明區(qū)的大小和位置。當(dāng)只需要觀察或測量標(biāo)本的一部分時(shí)，可以關(guān)小視場光欄，減小照明區(qū)域，使標(biāo)本的其他部分不受熱，并且減少了雜散光的干擾。,第四節(jié)顯微鏡的使用 1觀察前的準(zhǔn)備工作 (1)觀察者要養(yǎng)成顯微鏡鏡檢的工作習(xí)慣，觀察時(shí)要雙眼同時(shí)睜開，一邊觀察一邊進(jìn)行記錄或描繪。 (2)觀察

8、時(shí)所用的材料、藥品和各種器具要預(yù)先準(zhǔn)備好。 (3)顯微鏡在使用之前應(yīng)檢查一下它的各個(gè)部件是否完整和正常，并對載物臺(tái)、目鏡、物鏡以及聚光器上端透鏡進(jìn)行必要的清潔工作。然后進(jìn)行合軸調(diào)節(jié)，其操作步驟如下：,可變光欄的中心對準(zhǔn)聚光鏡的中心。如果可變光欄的水平是固定的，則裝配時(shí)已保證它與聚光鏡合軸，不必調(diào)整；如果可變光欄的水平位置可以移動(dòng)，則應(yīng)把可變光欄關(guān)到最小，使它的中心孔對準(zhǔn)聚光鏡下方的透鏡中心。 載物臺(tái)上放置觀察標(biāo)本，把聚光器上升到它上端透鏡平面稍低于載物臺(tái)平面的高度，并將它的可變光欄開到最大，用低倍物鏡，進(jìn)行調(diào)焦到能看見標(biāo)本，可調(diào)反射鏡使視野得到最亮和最均勻的照明，或把光欄關(guān)小，最亮的照明區(qū)正處

9、在視野的中央。 轉(zhuǎn)到高倍鏡，并調(diào)焦到看清標(biāo)本，然后去掉標(biāo)本，拔出目鏡，眼睛直接向鏡筒觀察，并把可變光欄關(guān)小，看其亮點(diǎn)是否在視野中心，如果不是，就要轉(zhuǎn)動(dòng)聚光器的調(diào)節(jié)螺旋，把亮點(diǎn)調(diào)到視野中央，再慢慢開啟可變光欄，使視野看到光欄邊緣和聚光鏡的邊緣相接為止。,2顯微鏡的照明操作 (1)當(dāng)用天然光、日光燈及其他各種沒有聚會(huì)透鏡及光欄的顯微鏡燈或普通臺(tái)燈照明時(shí)，因射來的光束寬，也比較均勻，操作比較簡單，其步驟是： 先使顯微鏡正對光源，讓反射鏡鏡面充分接受射來的光，把聚光器上升到它上端透鏡平面痢稍低于載物臺(tái)平面的高度。 將低倍物鏡轉(zhuǎn)到工作位置上，在載物臺(tái)上放一標(biāo)本片，把聚光器下的可變光欄開到最大，調(diào)節(jié)反射鏡

10、，使光線透過標(biāo)本進(jìn)人物鏡。 調(diào)焦到能看清標(biāo)本，去掉標(biāo)本后，再仔細(xì)調(diào)節(jié)反射鏡，使視野得到最亮和均勻的照明，或照明最亮的區(qū)域正處在視野中央，然后進(jìn)行其他操作步驟。,(2)當(dāng)使用帶有會(huì)聚透鏡和可變光欄的顯微鏡燈時(shí)，雖然也可以照上述方法取得一般照明的效果，但要得到均勻而較強(qiáng)的照明，則應(yīng)采用柯拉照明法。 一般顯微鏡的光源裝置在鏡座中，開啟光源開關(guān)，把燈光亮度調(diào)到34檔(或3V)即可。 3聚光器和物鏡配合的操作及濾光片的選擇 (1)聚光器與物鏡不但其性能要相匹配，而且兩者的數(shù)值孔徑要相一致。在完成上述照明操作之后，對無標(biāo)明數(shù)值孔徑的聚光器，先取下目鏡，直接向鏡筒中看，把聚光器下的可變光欄關(guān)到最小，然后才慢

11、慢開大，讓它的口徑與視場的直徑恰好一樣大。最后安上目鏡選用適當(dāng)?shù)臑V光片，即可進(jìn)行觀察。,(2)濾光片的選用：根據(jù)觀察的目的要求，采用合適的濾光片，有如下選擇： 防止耀眼和減輕眼睛疲勞。當(dāng)光線太強(qiáng)耀眼難受時(shí)，單為了削減入射光，可采用乳白玻璃或白色毛玻璃濾光片。最好根據(jù)標(biāo)本染色的情況，選用一個(gè)綠色，黃綠色或藍(lán)綠色的濾光片，把能刺激眼睛的紅光吸收掉，以減輕眼睛的疲勞。 增進(jìn)分辨率。根據(jù)顯微鏡分辨率的原理可將白光中波長較長的光波吸收掉，而利用所通過的較短波長來照明，可以達(dá)到增進(jìn)分辨率的目的。例如用一個(gè)綠色或藍(lán)色的濾光片就可以達(dá)到目的。 增大明暗反差。當(dāng)需要利用標(biāo)本的反差來識(shí)別其結(jié)構(gòu)時(shí)，就要通過合適的照

12、明來加強(qiáng)反差，其方法是選用一個(gè)顏色與標(biāo)本顏色互補(bǔ)的濾光片。各種顏色互補(bǔ)色可見表11。,4觀察操作 在完成上述各步的操作之后，便可在載物臺(tái)上放上待檢的標(biāo)本片，進(jìn)行調(diào)焦和觀察。 (1)低倍、高倍鏡的使用：先把低倍的物鏡用粗調(diào)焦螺旋下降至離蓋玻片0.5 cm處，然后一邊觀察視野一邊上升物鏡，直至看到圖像，再將標(biāo)本移到視野中心，用細(xì)調(diào)焦螺旋把物鏡調(diào)至最清晰處，若要用高倍鏡觀察時(shí)，把所要進(jìn)一步放大觀察的部位移至視野中央，直接順時(shí)針轉(zhuǎn)換成高倍物鏡，然后用細(xì)調(diào)焦螺旋凋焦，至看清物像。,(2)油鏡的使用：先用低倍物鏡觀察標(biāo)本的概況，然后更換高倍鏡，并把需要用油鏡觀察的部位移到視野的正中央，再進(jìn)行油鏡觀察操作：

13、 把鏡筒向上提升約1.5cm(有的是載物臺(tái)向下降1.5cm)，再把油鏡轉(zhuǎn)到工作位置。 在聚光器和蓋玻片上所要觀察的位置各滴一小滴香柏油或石蠟油，一邊從側(cè)面觀察油鏡頭，一邊細(xì)心擰動(dòng)粗調(diào)焦螺旋，使油鏡頭的前端與油滴接觸，再慢慢下降油鏡，使其前端接近而沒有碰到蓋玻片為止，最后，一邊觀察視野中的圖像，一邊擰動(dòng)細(xì)調(diào)焦螺旋，使鏡筒稍為上下升降看清標(biāo)本。,觀察完畢后，提升物鏡約1cm，把油鏡轉(zhuǎn)離光軸，及時(shí)做清潔工作。油鏡先用干的擦鏡紙擦12次，把部分油去掉，再用清潔劑(70乙醚+30無水乙醇)或二甲苯滴濕的擦鏡紙擦2次，最后用干擦鏡紙擦1次。擦拭要小心，動(dòng)作要輕，聚光器上的油滴也用同樣方法處理。擦拭時(shí)，要順鏡頭的直徑方向，而不要沿鏡頭的圓周擦，載玻片上的油可用“拉紙法”擦凈，即把一小張擦鏡紙蓋在載玻片上，在紙上滴一些清潔劑或二甲苯，趁濕把紙往外拉，這樣連續(xù)作了34次，即可干凈。最后，把聚光器下降約1cm，把物鏡轉(zhuǎn)離光軸，使鏡筒下端正處在兩個(gè)物鏡之間，置于陰涼處保存。,Olympus顯微鏡觀察的順序操作 1將電源開關(guān)置于ON的位置。 2電壓調(diào)至 79 V。 3將LBD-2濾色鏡放人燈室的窗口，根據(jù)亮度選用適當(dāng)?shù)腘D濾色鏡放人燈架一側(cè)。 4