肝豆狀核變性課題匯報.ppt

1、骨髓間充質(zhì)干細胞對肝豆狀核變性 肝纖維化治療的臨床研究 腦科醫(yī)院 肝豆狀核變性病區(qū) 張東鋒,主要研究開發(fā)內(nèi)容,本研究采用分組對照臨床試驗方法，對骨髓間充質(zhì)干細胞治療HLD肝纖維化的安全性和有效性進行評價 檢測多種肝纖維化指標及肝組織形態(tài)學病理改變；以觀察自體骨髓間充質(zhì)干細胞移植對肝纖維化病理進程的影響 為開展間充質(zhì)干細胞治療HLD肝纖維化提供試驗依據(jù),申請項目的必要性和依據(jù),概述 肝豆狀核變性（Hepatolenticular degeneration，HLD） 又稱Wilson?。╓ilson disease，WD），是一種難治性的 常染色體隱性遺傳銅代謝障礙疾病 由于銅在肝、腦等組織中異常

2、沉積引起相應器官組織損 傷，臨床以肝硬化、腦損害等相關(guān)癥狀為主要表現(xiàn) 臨床癥狀復雜多樣，但所有患者由于銅離子自膽道排泄障 礙，造成游離銅在肝組織長期緩慢蓄積導致不同程度的肝 臟慢性損害，肝纖維化幾乎是每一個HLD患者肝臟的主要 病理改變,HLD流行病學調(diào)查 本病是較為常見的單基因遺傳病，國外Ferenci P等流行病學調(diào)查，本病發(fā)病率為1/3萬人，患病率為1525/10萬人，雜合子為1/100人 國內(nèi)劉焯霖等對19821991年神經(jīng)遺傳性疾病專科門診統(tǒng)計分析，結(jié)果HLD占10.14，居全部單基因遺傳病的第二位 我院統(tǒng)計2010年7月2011年2月期間427例住院患者，約70%的患者在院外由于誤

3、診誤治導致病情加重，甚至因為肝硬化失代償或/及嚴重腦損害導致殘疾和死亡,申請項目的必要性和依據(jù),申請項目的必要性和依據(jù),Ferenci P等,胡紀源等,楊任民等,HLD的病理研究 證實患者均存在 明顯的肝臟損害,絕大多數(shù)HLD患 者存在著不同程 度的肝纖維化聲 像學改變,HLD的肝纖維化 是患者最常見的 病理改變,其終末期病理,肝硬化失代償 是本病患者致 殘、致死的最 主要原因,我們認為非常有必要 對HLD的肝纖維化進 行系統(tǒng)研究,研究證實HLD患者均存在明顯的肝臟損害,干預,申請項目的必要性和依據(jù),肝纖維化的病理機制,肝纖維化 的形成涉 及致病機 體反應的 多個方面,反應細胞,細胞因子,細胞

4、過量表達產(chǎn)物以及 降解酶等,復雜 的細 胞及 分子 機制,ECM 合成 增加,ECM 降解 減少,致病因子使 肝組織中,竇內(nèi) 皮細 胞,肝細 胞等,形成復 雜的細 胞-細 胞因子 網(wǎng)絡(luò),肝星 狀細 胞激 活,釋放多種因子,這些物質(zhì)常 被用作檢測肝纖 維化水平的血清 標志物,HA LN PC- IV-C,ECM可 被基質(zhì)金 屬蛋白酶 （MMPs） 降解,基質(zhì)金屬 蛋白酶抑 制劑(TIMPs),結(jié)合,活性被抑制,阻止肝 臟ECM 的降解,ECM在肝臟沉積,肝纖維化,呂有魁等臨床觀察到多數(shù)HLD患者上述指標明顯升高,劉焯霖等 觀察到兒 童HLD肝 組織內(nèi) TIMP-1、 TIMP-2表 達量增強,國

5、內(nèi)外有關(guān)文獻在治療HLD肝纖維化現(xiàn)狀 國內(nèi)外有關(guān)文獻在治療HLD肝纖維化尚屬空白，已報導的藥物尚無一種被正式批準應用于臨床抗肝纖維化，這是因為,申請項目的必要性和依據(jù),某些藥物雖具 有抗肝纖維化 作用，但其靶 向性不強，對 其它組織也有 影響，長期應 用副作用大,許多藥物早 期或短期有 預防作用， 對已形成的 肝纖維化療 效并不明顯,某些藥物在 某一環(huán)節(jié)有 抗肝纖維化 效果，但在 其它環(huán)節(jié)又 促進纖維化 矛盾的作用,尋找有效治療HLD肝纖維化的途徑任重而道遠卻又迫在眉睫,干細胞干預肝纖維化的研究現(xiàn)狀,申請項目的必要性和依據(jù),Peresen 等,Higashiyama R等,Sakaida等,A

6、ziz等,骨髓間充質(zhì) 干細胞及肝 星狀細胞， 可誘導活化 的肝星狀細 胞凋亡，明 顯減少膠原 沉積,骨髓干細胞定 植于肝臟，一 部分表達基質(zhì) 金屬蛋白酶， 促進纖維條索 的溶解而發(fā)揮 抗纖維作用,骨髓干細胞移 至肝臟纖維條 索周圍 分泌 MMP-2、9 14增多 細胞 外基質(zhì)及膠原 條索降解增多 有利肝功改善,通過將MSCs 由尾靜脈注入 肝纖維化模型 鼠內(nèi)發(fā)現(xiàn)MSCs 具有向肝細胞 方向的轉(zhuǎn)化及減 輕肝纖維化的 功能,MSCs移植具有抗肝纖維化作用,骨髓間充質(zhì)干細胞治療肝損害的優(yōu)勢 骨髓間充質(zhì)干細胞取材方便，來源豐富 分化能力強 免疫原性低 沒有倫理學障礙，不受道德及法律方面的限制 具有跨胚

7、層向多組織細胞分化的潛能和自我更新的高增值能力。,申請項目的必要性和依據(jù),本課題意義 骨髓來源的間充質(zhì)干細胞治療肝豆狀核變性導致的肝纖維化的安全性和有效性還需進一步的評估 探討骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療該病肝纖維化的機制也具有重要的意義,申請項目的必要性和依據(jù),實施方案 采用臨床試驗方法，將病人分為三組: 青霉胺組 骨髓間充質(zhì)干細胞移植干預組; 骨髓間充質(zhì)干細胞移植干預加青霉胺組。 隨訪1-2年；治療后3、6、9、12個月觀察患者日常生活能力評價、臨床分級評價、細胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、肝銅含量變化、治療1年后肝組織活檢進行病理檢查，所得數(shù)據(jù)應用SAS處理。,項目研究開發(fā)內(nèi)容,給藥方案 青霉胺組

8、：青霉胺(上海信誼制藥公司生產(chǎn))，劑量為每日40mg/kg，連續(xù)816周 骨髓間充質(zhì)干細胞移植干預：將3l06細胞/ml的骨髓間充質(zhì)干細胞液2ml+生理鹽水100ml經(jīng)靜脈移入人體。每10天靜脈干細胞移植一次，三次為一個療程 骨髓間充質(zhì)干細胞移植干預加青霉胺組：將3l06細胞/ml的骨髓間充質(zhì)干細胞液2m+生理鹽水100ml經(jīng)靜脈移入人體，每10天靜脈干細胞移植一次，三次為一個療程。另將青霉胺（劑量為每日40mg/kg），每日分3次口服，連續(xù)816周,項目研究開發(fā)內(nèi)容,標本收集 分別于治療后3、6、9、12個月抽取病人外周血1.2ml，用于細胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、肝銅含量檢測； 治療后1年進

9、行肝臟組織病理檢查,項目研究開發(fā)內(nèi)容,觀察指標與方法 取血1.2ml，血標本經(jīng)低速冷凍離心(3000轉(zhuǎn)/分)10分鐘后取血清約0.5ml進行有關(guān)實驗項目檢測。如：血清生化、肝纖維化指標及相關(guān)細胞因子檢測 血清銅藍蛋白采用免疫比濁法，ALT采用比色法，LN、HA采用放射免疫法(RIA)，PDGF、 TGF1、IL-10、TNF-、MMP-1及TIMP-1采用ELISA法 肝臟組織病理檢查:肝臟標本均作連續(xù)切片，每份標本均行下述檢查：普通HE染色、膠原纖維采用Masson氏染色、網(wǎng)狀纖維采用Gomori染色 肝臟組織銅含量測定采用原子吸收分光光度法檢測,項目研究開發(fā)內(nèi)容,統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)應用SAS

10、處理，各組間比較采用one way ANOVA 分析,項目研究開發(fā)內(nèi)容,關(guān)鍵技術(shù) 肝臟穿刺可能會給病人帶來一定的痛苦和創(chuàng)傷，我們將請有經(jīng)驗的臨床醫(yī)生在彩超監(jiān)測下進行活檢 建立一套穩(wěn)定的檢測細胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、肝銅含量方法直關(guān)重要。本實驗室檢測基質(zhì)金屬蛋白酶時，出現(xiàn)不穩(wěn)定的現(xiàn)象，對于這一問題，我們正請有關(guān)專家?guī)椭⒎€(wěn)定、可靠的方法,項目研究開發(fā)內(nèi)容,技術(shù)路線,項目研究開發(fā)內(nèi)容,本項目的特色與創(chuàng)新之處 首次應用人骨髓干細胞移植干預HLD患者，為開展骨髓干細胞移植治療HLD肝纖維化提供新的 理論、實驗依據(jù),項目研究開發(fā)內(nèi)容,已具備的試驗手段 南方醫(yī)科大學附屬鄭州人民醫(yī)院2008年成立了院士工

11、作站，并開展了干細胞治療。與此相適應的投入一千萬元建立了一個現(xiàn)代化試驗室，配備了先進的試驗設(shè)備。有能力提供高質(zhì)量、高活性的細胞 該研究與我們剛獲得的國家自然基金項目可以共享試驗設(shè)備和人力資源，我們又投入500多萬元，購買了與試驗相關(guān)的設(shè)備， 如ABI3730XL序列儀、高速冷凍離心機、流式細胞儀、PCR儀、分子生物學平臺、高速離心機、懸渦振蕩器，磁力攪拌器，PH計，立式高壓消毒鍋，微波爐等 院士工作站具備完成本課題所需的條件,實施本項目已具備的條件,已具備的技術(shù)力量,實施本項目已具備的條件,項目的預期經(jīng)濟、社會和環(huán)境效益,通過以下三方面的研究 評價骨髓間充質(zhì)干細胞治療HLD患者的安全性和有效性（血常規(guī)、尿常規(guī)、肝腎功能） 探討經(jīng)人靜脈骨髓間充質(zhì)干細胞移植干預肝纖維化的病理過程 觀察骨髓間充質(zhì)干細胞對多種肝纖維化指標、細胞